一种快速检测血清中miRNA浓度的荧光试剂盒

摘要

本发明公开了一种快速检测血清中miRNA浓度的荧光试剂盒，其组成包括DNA合成的模板链、脱氧核苷三磷酸复合物、酶复合物、底物复合物、引物、缓冲液、双蒸水，其特征在于，所述引物为待测的miRNA，合成的模板链5′端的8个碱基作为DNA合成的模板，可为除T碱基外的任意碱基;3′端则与待测miRNA碱基互补。本发明从获得待测样品到给出检测结果，整个过程只需10多分钟，可检测样品浓度达到10fM级。本发明具有灵敏、快速的特点。

权利要求

1.一种快速检测血清中miRNA浓度的荧光试剂盒，其组成包括DNA合成的模板链、脱氧核苷三磷酸复合物、酶复合物、底物复合物、引物、缓冲液、双蒸水，其特征在于，所述DNA合成的模板链，其5′端的8个碱基作为DNA合成的模板，由A、G、C三种碱基组成，不用T碱基，其3′端碱基与待测的miRNA碱基完全反向互补，所述引物为待测的miRNA；所述酶复合物为DNA聚合酶、ATP硫酰化酶、虫荧光素酶等浓度混合，所述底物复合物为5′-磷酸硫酸腺苷与荧光素。

2.根据权利要求1所述的荧光试剂盒，其特征在于，所述脱氧核苷三磷酸复合物为dTTP、dGTP和dCTP等浓度混合。

3.根据权利要求1所述的荧光试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液由以下化合物组成：

pH 7.75的0.1M Tris-acetate，2mM EDTA，10mM Mg(Ac)2，0.4mg/ml PVP。

说明书

一种快速检测血清中miRNA浓度的荧光试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测miRNA的试剂盒，尤其涉及一种快速检测血清中miRNA浓度的荧光试剂盒，属于miRNA检测领域。

背景技术

[0002] 近年研究结果发现，越来越多疾病的发生都与miRNA的表达水平和活性密切相关。miRNA表达水平的改变必将导致循环中miRNA浓度的变化。循环中的miRNA可作为疾病的特异性标志物，通过检测循环中miRNA浓度的变化，对疾病作出准确诊断。目前已在科学研究中应用的核酸（包括miRNA）检测方法灵敏度都偏低，检测不到样品中低浓度的核酸。需要先经PCR扩增等技术提高样品中核酸的浓度后再用这些方法检测。miRNA只有20多个核苷酸，不方便用PCR方法扩增。临床诊断要求最好的方式是直接检测待测样品而不宜改变样品中miRNA的浓度。因此在科研中通用的核酸检测方法不适宜用于临床检测循环中的miRNA。提高现有检测方法的灵敏度，或研究更灵敏的新的检测方法，在不人为地提高样品中核酸浓度的条件下直接检测出miRNA的实际真实浓度，是miRNA应用研究中的一个重要方面，也是临床上通过检测miRNA诊断疾病必须解决的关键问题。

[0003] Nyren等建立的DNA聚合酶活性及焦磷酸（PPi）定量法开始时是用于DNA序列测定的。在DNA合成的过程中，每增加一个核苷酸分子都会释放出一分子的PPi。在ATP硫酰化酶作用下，一分子PPi与一分子5′-磷酸硫酸腺苷反应生成一分子ATP。虫荧光素酶由ATP提供能量，使底物Luciferin荧光素氧化产生荧光。检测到荧光就证明DNA分子又延伸了一个核苷酸。DNA测序用的合成模板和引物都是DNA。底物为dNTP,其中的dATP会干扰ATP活性，需要用dATPαS替代。dATPαS为人工修饰碱基，成本比普通的碱基高。DNA延伸后未被利用的dNTP需用ATP二磷酸酶降解，才能继续下一个延伸。DNA测序的酶复合物中必须有ATP二磷酸酶，酶和酶的比例必须合适，才能保证测序的连续进行。在细胞内DNA合成的真实引物是RNA，不是DNA。台湾学者Hsiang-Ping YU等受此启发，将DNA测序中的DNA引物改用miRNA，实现了用该方法检测miRNA浓度。Hsiang-Ping YU等用该方法检测了合成的纯miRNA和从细胞中纯化的miRNA的浓度。因细胞提取液中有ATP，用该法检测细胞中miRNA时需先用ATP二磷酸酶清除细胞提取液中的ATP。该过程所需要的时间至少是检测所需时间的3倍，影响了该方法在检测急症的miRNA方面的应用价值。

[0004] 本发明在Hsiang-Ping YU等方法的基础上进行了进一步的创新，建立了灵敏、快速、廉价的检测血清中miRNA浓度的实验方法。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种快速检测血清中miRNA浓度的荧光试剂盒。本发明通过以下技术方案来实现：

[0006] 本发明公开了一种快速检测血清中miRNA浓度的荧光试剂盒，其组成包括DNA合成的模板链、引物、脱氧核糖核苷三磷酸复合物、酶复合物、底物复合物、缓冲液，其中，[0007] 所述DNA合成的模板链5′端的8个核苷酸作为合成的模板，为除T碱基外的任意三种碱基。3′端碱基与待测miRNA碱基反向互补。

[0008] 所述引物为待测的miRNA。

[0009] 进一步的，所述脱氧核糖核苷三磷酸复合物为dTTP、dGTP和dCTP等浓度混合物；

[0010] 所述酶复合物为DNA聚合酶、ATP硫酰化酶、虫荧光素酶等浓度混合；

[0011] 所述底物复合物为5′-磷酸硫酸腺苷与荧光素；

[0012] 所述的缓冲液由0.1M Tris-acetate(pH7.75)，2mM EDTA，10mM Mg(Ac)2，0.4mg/ml PVP组成。

[0013] 本发明对Hsiang-Ping YU等所用DNA合成模板链的碱基做了必要的调整，除了保证其3′端碱基与待测的miRNA碱基完全反向互补外，其5′端作为合成模板的部分只保留A、G、C三种碱基，去除其中可能存在的T碱基。这样底物中就不再需要与T碱基配对的dATP，即不再需要人工修饰的dATPαS碱基，以降低检测所需要的的成本。

[0014] 本发明还去除了酶复合物中的ATP二磷酸酶。miRNA定量关注的是PPi的浓度而不在意是哪一种核苷酸插入到DNA上，因此不需要完全清除上一次聚合时未被利用的dNTP。去除ATP二磷酸酶可进一步降低检测所需的成本，同时不必刻意计算酶复合物中各种酶的比例，使操作变得简单，使成功率更高。

[0015] 本发明选择血清等作为检测的样本来源。因血清中没有ATP,可以省略用ATP二磷酸酶事先去除样品中的ATP的步骤，使整个检测时间成倍缩短，满足心梗等急症检测miRNA必须快速的要求。

[0016] 通过上述改进，用该法检测血清中的miRNA，全程只需大约15分钟，检测的灵敏度已经达到10fM级，用该方法已经检测出心梗模型动物和正常动物血清中miRNA浓度的差异。模型动物中miRNA浓度最高的约为正常动物的3倍。

附图说明

[0017] 图1为以DNA为引物，发光强度与引物浓度的相关性分析图；

[0018] 图2为以miRNA1为引物，发光强度与引物浓度的相关性分析结果图；

[0019] 图3为正常动物，发病1小时和6小时心梗模型动物血清miRNA1浓度测定结果图；

[0020] 图4为正常动物，发病1小时和6小时心梗模型动物血清miRNA1浓度测定结果直方图；

[0021] 图5为第二批动物血清样品发光值测定结果图；

[0022] 图6为第二批血清样品发光值测定结果直方图。

具体实施方式

[0023] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0024] 实施例1一种快速检测血清中miRNA浓度的荧光试剂盒，其组成包括DNA合成的模板链、脱氧核苷三磷酸复合物、酶复合物、底物复合物、引物、缓冲液、双蒸水，其中，[0025] 所述DNA合成的模板链，其5′端的8个碱基作为DNA合成的模板，由A、G、C三种碱基组成，不用T碱基，其3′端碱基与待测的miRNA碱基完全反向互补，所述引物为待测的miRNA；

[0026] 所述脱氧核苷三磷酸复合物为dTTP、dGTP和dCTP等浓度混合；

[0027] 所述酶复合物为DNA聚合酶、ATP硫酰化酶、虫荧光素酶等浓度混合。

[0028] 所述底物复合物为5′-磷酸硫酸腺苷与荧光素；

[0029] 所述的缓冲液由以下化合物组成：

[0030] 0.1M Tris-acetate(pH7.75)，2mM EDTA，10mM Mg(Ac)2，0.4mg/ml PVP。

[0031] 试验例1：用DNA为引物检测引物浓度与荧光值间的线性关系

[0032] 试验试剂：DNA聚合酶(Sigma公司D8276)、ATP硫酰化酶(Sigma公司A8957)、虫荧光素酶(Sigma公司L1759)、5′-磷酸硫酸腺苷(Sigma公司A8957)、荧光素(Sigma公司L9504)、dTTP(Sigma公司89270)、dGTP(Sigma公司D5038)、dCTP(Sigma公司D4913)；

[0033] 酶复合物：DNA聚合酶、ATP硫酰化酶、虫荧光素酶等浓度混合，（比例大致相同，不必像DNA测序一样进行比例优化）；

[0034] 底物复合物：5′-磷酸硫酸腺苷、荧光素；

[0035] 脱氧核苷三磷酸复合物：dTTP、dGTP和dCTP等浓度混合；

[0036] 所用缓冲液由0.1M Tris-acetate(pH7.75)，2mM EDTA，10mM Mg(Ac)2，0.4mg/ml PVP组成。

[0037] DNA合成的模板链，5′端的8个碱基作为合成的模板，其中不包括T碱基，3′端碱基与miRNA1序列完全互补。具体序列如下：

[0038] 5′-GCAGCCAGCTCCATACTTCTTTACATTCCA-3′（试验例只测miRNA1浓度）[0039] DNA引物序列与miRNA1序列相同，具体序列如下：

[0040] 5′-TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG-3′

[0041] 实验过程：

[0042] 反应体系：40ul（饱和模板不变，引物浓度梯度变化）

[0043]

[0044]

[0045] 按次序加样，先加DNA模板和DNA引物，保证有足够的退火时间。

[0046] 检测所用仪器为GloMax20/20发光检测仪（Promega），设定读数间隔为1次/秒、检测时间为至少120秒，至背景值读数稳定，测量值出现峰值。

[0047] 检测结果见表1，图1：

[0048] 表1

[0049]

[0050] 结果表明：DNA引物在100nm-5pm范围内引物浓度和荧光之间存在线性关系[0051] 试验例2：检测miRNA1引物浓度与荧光值间的线性关系

[0052] 操作步骤同试验例1，只是将例1中的DNA引物换成miRNA1，反应体系中加入RNA酶抑制剂，检测结果见表2，图2：

[0053] 表2

[0054]

[0055]

[0056] 结果显示：miRNA浓度在500-10nm之间与荧光强度之间存在线性关系。

[0057] 试验例3：检测动物血清中的miRNA1浓度

[0058] 试验材料：心梗模型动物血清，来自哈尔滨医科大学药理教研室；采用结扎冠脉前降支，建立的昆明种小鼠急性心肌梗死模型。

[0059] 制备正常动物和心梗模型动物的血清，用血清代替miRNA1作为引物，检测各动物血清中的miRNA1浓度，操作过程同试验例2。

[0060] 1、两份心梗模型动物血清，两份正常动物血清，每份血清取6ul作引物。检测结果见表3：

[0061] 表3

[0062]

[0063] 结果显示：能够用本发明的试剂盒检测出正常动物循环中较低浓度的miRNA1。两份正常动物血清中miRNA1浓度大体相同。两份心梗模型动物血清miRNA1浓度差异较大，一只比正常动物稍高，另一只是正常动物的3倍。

[0064] 2、检测正常动物，发病1小时和发病6小时的心梗模型动物血清miRNA1浓度，血清量为1ul和11.7ul,检测结果见表4，图3，图4：

[0065] 表4

[0066]

[0067]

[0068] 3、第二批正常动物和心梗模型动物各5份血清miRNA1浓度测定，检测结果见表5，图5、图6：

[0069] 表5

[0070]