一种5SrDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法

摘要

本发明公开了一种5S rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法，它主要包括染色体标本制备、5S rDNA探针制备、染色体荧光原位杂交、杂交信号检测等步骤，重点解决了现有荧光原位杂交探针的标记复杂繁琐的方法，提供一种简便、快速、准确的探针标记和杂交方法，利用这种技术能够在三小时内完成5S rDNA在染色体上的FISH定位。本发明的探针为寡核苷酸探针在合成时可加入荧光基团修饰，不用再进行标记，与现有技术相比方法简单、成本低廉。

权利要求

1.一种5S rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法，其特征在于按如下的步骤进行：染色体标本制备

（1）按常规植物材料培养，待种子或植株根尖长至0.5-1cm；

（2）切下生长旺盛的根尖，用饱和对二氯苯溶液室温下预处理3-5小时；

（3）吸去预处理液，根尖用0.075mol/L 氯化钾低渗30min，然后用3:1的甲醇:冰醋酸固定20min-1小时；

（4）用蒸馏水洗三次，每次5min，充分洗去固定液；

（5）用果胶酶和纤维素酶按重量分数比1:1混合的酶2.5%（w/w），在37℃解离根尖1小时；

（6）蒸馏水洗去酶液，用0.075mol/L 氯化钾后低渗15-30min，用3:1的甲醇：冰醋酸的固定液固定20min；

（7）取根尖于预先在4℃蒸馏水中冷冻的洁净载玻片上，滴一滴固定液，用镊子将根尖充分捣碎，再加1滴固定液，将细胞吹散，空气干燥；

（8）用1:30稀释的Giemsa染色液染色10min，自来水冲洗凉干；

（9）镜检，选择分散良好的染色体标本放在-20℃冰箱中保存待用；

5S rDNA探针制备

从拟南芥5S rDNA序列中选取一段20个碱基左右的高度保守序列，所述序列为：

5’- CTGATGGGATCCGGTGCTTT -3’ ，5’端带红色荧光标记TAMRA；

染色体荧光原位杂交

A：染色体标本预处理

（1）在荧光显微镜上记下已标记分裂相的坐标，并用玻璃刀在载玻片背面标记分裂相的位置；

（2）将载玻片在45%醋酸中浸泡5min褪色，空气干燥；

B：染色体标本变性

（1） 在标记处加30μL 70%去离子甲酰胺/2×SSC，盖上盖玻片，于PCR仪或烘箱中

70℃处理2min；

（2）去掉盖片，-20℃的70%、85%、100%冷乙醇脱水，每级3min，空气干燥；

C：杂交

（1）用2×SSC稀释探针至5ng/μL；

（2）每张标本加10μL探针，并盖18×18mm的盖玻片；

（3）于湿盒中37℃杂交1-2小时；

D：杂交后洗脱

（1）在4×SSC，0.2%Tween 20中室温下避光洗涤10min；

（2）蒸馏水冲洗片刻，避光空气干燥；

E：杂交信号检测

（1）滴加3μL含有DAPI的防荧光淬灭剂，盖上盖玻片；

（2）Nikon 80i荧光显微镜观察，按照所记录的标本坐标在紫外光激发下可观察到蓝色的染色体，在绿色激发光激发下可观察到红色的5S rDNA杂交信号；

（3）SPOT RT KE冷CCD进行图像采集，SPOT 4.1软件进行图像合成。

说明书

一种5S rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法

技术领域

[0001] 本发明属于细胞遗传学和分子生物学技术领域，涉及一种5S rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法。

背景技术

[0002] 核糖体RNA基因(rDNA)是植物基因组中研究最广泛的遗传单元之一，rDNA是高度保守的重复序列家族，拥有几百乃至几千个拷贝，成簇分布于一对或多对染色体上。通过荧光原位杂交(FISH)技术将rDNA在染色体上进行定位，可以为核型分析提供有效的细胞学标记，特别对于染色体较小且形态相近的物种，这种染色体标记更是核型分析的重要工具。

[0003] 5S rDNA探针一般采用质粒或PCR扩增获得，再进行直接或间接标记用于FISH，目前还没有利用荧光基团标记的的寡核苷酸探针在植物染色体上进行5S rDNA FISH定位的报道。

发明内容

[0004] 本发明公开了一种rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法。本发明的方法是利用荧光基团标记的寡核苷酸探针在植物染色体上进行rDNA FISH定位。具体地说包括如下步骤：

[0005] 1. 染色体标本制备

[0006] （1）按常规植物材料培养，待种子或植株根尖长至0.5-1cm；

[0007] （2）切下生长旺盛的根尖，用饱和对二氯苯溶液室温下预处理3-5小时；

[0008] （3）吸去预处理液，根尖用蒸馏水或0.075mol/L 氯化钾低渗30min，然后用3:1（甲醇:冰醋酸）固定20min-1小时；

[0009] （4）用蒸馏水洗三次，每次5min，充分洗去固定液；

[0010] （5）用果胶酶和纤维素酶按重量分数比1:1混合的酶2.5%（w/w），在37℃解离根尖1小时；

[0011] （6）蒸馏水洗去酶液，后用0.075mol/L 氯化钾后低渗15-30min，用3:1甲醇：冰醋酸固定液固定20min；

[0012] （7）取根尖于预先在4℃蒸馏水中冷冻的洁净载玻片上，滴一滴固定液，用镊子将根尖充分捣碎，再加1滴固定液，将细胞吹散，空气干燥；

[0013] （8）用1:30稀释的Giemsa染色液染色10min，自来水冲洗凉干；

[0014] （9）镜检，选择分散良好的染色体标本放在-20℃冰箱中保存待用；

[0015] 2. 5S rDNA探针制备

[0016] 从拟南芥5S rDNA序列中选取一段20个碱基左右的高度保守序列，合成时在探针的5’或3’端连接一个荧光基团：

[0017] 5’- CTGATGGGATCCGGTGCTTT -3’ （ SEQ NO:1） ，5’端带红色荧光标记TAMRA（5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯）；

[0018] 3. 染色体荧光原位杂交：

[0019] A：染色体标本预处理

[0020] （1）在荧光显微镜上记下已标记分裂相的坐标，并用玻璃刀在载玻片背面标记分裂相的位置；

[0021] （2）将载玻片在45%醋酸中浸泡5min褪色，空气干燥；

[0022] B：染色体标本变性

[0023] （1） 在标记处加30μL 70%去离子甲酰胺/2×SSC，盖上盖玻片，于PCR仪或烘箱中70℃处理2min；

[0024] （2）去掉盖片，-20℃的70%、85%、100%冷乙醇脱水，每级3min，空气干燥；

[0025] C：杂交

[0026] （1）用2×SSC稀释探针至5ng/μL；

[0027] （2）每张标本加10μL探针，并盖18×18mm的盖玻片；

[0028] （3）于湿盒中37℃杂交1-2小时；

[0029] D：杂交后洗脱

[0030] （1）在4×SSC，0.2%Tween 20中室温下避光洗涤10min；

[0031] （2）蒸馏水冲洗片刻，避光空气干燥；

[0032] E：杂交信号检测

[0033] （1）滴加3μL含有DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的防荧光淬灭剂，盖上盖玻片；

[0034] （2）Nikon 80i荧光显微镜观察，按照所记录的标本坐标在紫外光激发下可观察到蓝色的染色体，在绿色激发光激发下可观察到红色的5S rDNA杂交信号；

[0035] （3）SPOT RT KE冷CCD进行图像采集，SPOT 4.1软件进行图像合成。

[0036] 本发明公开的5S rDNA在植物染色体上的荧光原位杂交方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

[0037] （1）探针制备方面，本发明的探针为寡核苷酸探针在合成时可加入荧光基团修饰，不用再进行标记，与现有技术相比方法简单、成本低廉。

[0038] （2）寡核苷酸探针很容易渗透进入染色体，所以染色体标本预处理步骤可简化。

[0039] （3）寡核苷酸探针不需要变性，杂交液的成分仅为2xSSC，比经典方法成分简单很多。

[0040] （4）杂交时间仅需1小时，不需要过夜。

[0041] （5）杂交后洗脱步骤简便，不需要甲酰胺。

[0042] （6）杂交信号检测可直接观察，不需要抗体孵育等信号检测步骤。

附图说明

[0043] 图1 5S rDNA在雪里蕻中期染色体上的FISH定位，箭头所示为是5S rDNA在中期染色体上分布的位点；

[0044] 图2 5S rDNA在雪里蕻中期染色体上的FISH定位，箭头所示为是5S rDNA在中期染色体上分布的位点；

[0045] 图3 5S rDNA在杨树中期染色体上的FISH定位，箭头所示为是5S rDNA在中期染色体上分布的位点；

[0046] 图4 5S rDNA在花椰菜中期染色体上的FISH定位，箭头所示为是5S rDNA在中期染色体上分布的位点；

[0047] 图5 5S rDNA在胡萝卜中期染色体上的FISH定位，箭头所示为是5S rDNA在中期染色体上分布的位点。

具体实施方式

[0048] 下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。所用到的试剂的来源、仪器的型号见下表：

[0049]试剂、仪器名称 来源、型号
对二氯苯 上海天连精细化工有限公司
甲醇 天津市化学试剂六厂
乙醇 天津市化学试剂六厂
冰醋酸 天津市化学试剂一厂
KCl 天津市化学试剂一厂
NaCl 天津市化学试剂一厂
HCl 天津市化学试剂一厂
MgCl2 天津市化学试剂一厂
柠檬酸三钠 天津市福晨化学试剂厂
Na2HPO4 天津市化学试剂一厂
KH2PO4 天津市化学试剂一厂
果胶酶 SEVER
纤维素酶 Yakult
Giemsa 北京化学试剂公司
Tween20 北京鼎国生物技术有限公司
多聚甲醛 北京鼎国生物技术有限公司
去离子甲酰胺 Sigma
防荧光淬灭剂 Vectashield
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚） Roche
DIGHighPrime Roche
RNaseA Roche
Anti-digoxigenin-rhodamine Roche
PCR仪 Effendorf5331
荧光显微镜 Nikon80i
冷CCD SPOTRTKE

[0050] 实施例1

[0051] 5S rDNA在雪里蕻中期染色体上的FISH定位

[0052] 1. 染色体标本制备

[0053] （1）雪里蕻种子萌发后根尖长至0.5cm。

[0054] （2）切下根尖，用饱和对二氯代苯水溶液室温下预处理5小时。

[0055] （3）根尖用0.075mol/L 氯化钾低渗溶液低渗30min，然后用3:1（甲醇:冰醋酸）固定20min。

[0056] （4）用蒸馏水洗三次，每次5min，充分洗去固定液。

[0057] （5）用果胶酶和纤维素酶按重量分数比1:1混合的酶2.5%（w/w），在37℃解离根尖1小时。

[0058] （6）蒸馏水洗去酶液，用0.075mol/L 氯化钾低渗溶液低渗30min，用3:1甲醇：冰醋酸固定液固定20min。

[0059] （7）用涂片法制备染色体标本，取根尖于预先在4℃蒸馏水中冷冻的洁净载玻片上，滴一滴固定液，用镊子将根尖充分捣碎，再加1滴固定液，将细胞吹散，空气干燥。

[0060] （8）用1:30稀释的Giemsa染色液染色（北京化学试剂公司）自来水冲洗凉干。

[0061] （9）镜检，选择分散良好的染色体用荧光显微镜标尺记下坐标的位置并用记号笔在反面标记染色体的位置，将染色体标本放在-20℃冰箱中保存待用。

[0062] 2. 5S rDNA探针制备

[0063] 5S rDNA保守序列5’- CTGATGGGATCCGGTGCTTT -3’ （ SEQ NO:1）由上海生工合成，5’端带红色荧光标记TAMRA（5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯）。探针用蒸馏水稀释为50ng/μL储存液-20℃冰箱中保存备用。

[0064] 3．染色体荧光原位（FISH）杂交方法

[0065] A：染色体标本预处理

[0066] （1）在荧光显微镜上记下标本分裂相的坐标，并用玻璃刀在载玻片背面标记杂交区域。

[0067] （2）将载玻片在45%醋酸中浸泡5min褪色，空气干燥；

[0068] B：染色体标本变性

[0069] （3）在标记处加30μL 70%去离子甲酰胺/2×SSC，盖上盖玻片，于PCR仪或烘箱中70℃处理2min。

[0070] （4）迅速甩掉盖片，-20℃的冷乙醇系列（70%，85%，100%）脱水，每级3min，空气干燥。

[0071] C：杂交

[0072] （1）用2×SSC稀释探针至5ng/μL。

[0073] （2）每张标本加10μL探针，并盖18×18mm的盖玻片。

[0074] （3）于湿盒中37℃杂交1小时。

[0075] D：杂交后洗脱

[0076] （1）在4×SSC，0.2%Tween 20中室温下避光洗涤10min。

[0077] （2）蒸馏水冲洗片刻，空气干燥（避光）。

[0078] E：杂交信号观察

[0079] （1）滴加3μL含有DAPI的防荧光淬灭剂，盖上盖玻片。

[0080] （2）Nikon 80i荧光显微镜观察，在紫外光激发下可观察到蓝色的染色体，在绿色激发光激发下可观察到红色的5S rDNA杂交信号。

[0081] （4） SPOT RT KE冷CCD进行图像采集，SPOT 4.1软件进行图像合成见图1。

[0082] 实施例2：比较实施例

[0083] 经典的原位杂交方法

[0084] 步骤：

[0085] 5S rDNA在雪里蕻中期染色体上的FISH定位步骤：

[0086] 1. 染色体标本制备

[0087] （1）雪里蕻种子萌发后根尖长至0.5cm。

[0088] （2）切下根尖，用饱和对二氯苯水溶液室温下预处理5小时。

[0089] （3）根尖用0.075mol/L 氯化钾低渗溶液低渗30min，然后用3:1（甲醇:冰醋酸）固定40min。

[0090] （4）用蒸馏水洗三次，每次5min，充分洗去固定液。

[0091] （5）用果胶酶和纤维素酶按重量分数比1:1混合的酶2.5%（w/w），在37℃解离根尖1小时。

[0092] （6）蒸馏水洗去酶液，用0.075mol/L 氯化钾低渗溶液低渗30min，用3:1甲醇：冰醋酸固定液固定20min。

[0093] （7）用涂片法制备染色体标本，取根尖于预先在4℃蒸馏水中冷冻的洁净载玻片上，滴一滴固定液，用镊子将根尖充分捣碎，再加1滴固定液，将细胞吹散，空气干燥。

[0094] （8）用1:30稀释的Giemsa染色液染色（北京化学试剂公司）自来水冲洗凉干。

[0095] （9）镜检，选择分散良好的染色体标本放在-20℃冰箱中保存待用。

[0096] 2. 5S rDNA探针制备

[0097] 含有5S rDNA的质粒（由武汉大学宋运淳教授惠赠）来自番茄，采用随机引物法标记，地高辛标记物为Digoxigenin-11-dUTP（Roche）。将1μg 模板DNA 稀释于16μL无菌双蒸水中，在沸水浴中变性10min，迅速放入冰水中冷却10min，加入4μL DIG High Prime（Roche） 4μL，37℃温浴20小时，65℃温浴10分钟终止反应，-20℃冰箱中保存备用。

[0098] 3. 染色体荧光原位杂交（FISH）方法

[0099] A. 染色体标本预处理

[0100] 将载玻片在45%醋酸中浸泡5min褪色，空气干燥，滴加100 μL 100 μg/mL RNase A（用2xSSC：0.3 mol/L NaCl,0.03 mol/L 柠檬酸三钠配制）盖上盖片，37℃温浴1小时，用2xSSC洗涤3x5min（洗涤3次，每次5min），70%、85%、100%乙醇系列脱水，每级5分钟，风干后滴加100 μL 0.01% pepsin（胃蛋白酶）（10 mM HCl配制），盖上盖片，37℃温浴10 min，
1xPBS（0.137M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.01M Na2HPO4, 0.002 M KH2PO4）洗涤 2x5min，含有50 mM MgCl2的1xPBS洗涤5分钟，1%多聚甲醛（用含50 mM MgCl2的1xPBS配制）室温下固定10分钟，1xPBS洗涤5分钟，70%、85%、100%乙醇系列脱水，每级5分钟，风干。

[0101] B. 染色体标本变性

[0102] 滴加30μL 70%去离子甲酰胺/2×SSC，盖上盖玻片，于PCR仪或烘箱中70℃处理2min。迅速甩掉盖片，-20℃的冷乙醇系列（70%，85%，100%）脱水，每级3min，空气干燥。

[0103] C. 杂交

[0104] 将探针用用杂交液（60%去离子甲酰胺，2xSSC，10%硫酸葡聚糖）稀释10倍，于95℃变性10分钟，迅速置入冰水中10分钟，每张标本滴加10μL探针，盖上18×18mm盖玻片，于湿盒中37℃杂交过夜。

[0105] D. 杂交后洗脱

[0106] 60%甲酰胺（用2xSSC稀释）37℃洗涤3x5min，TNT缓冲液（100 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20）洗涤5分钟。

[0107] E. 杂交信号检测

[0108] 滴加100μL TNB缓冲液（100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5% blocking reagent），盖上盖片，37℃湿盒中温浴30min， TNT缓冲液洗去盖片，滴加30μL用TNB稀释为2μg/μL的Anti-digoxigenin-rhodamine（Roche），盖上盖片，37℃湿盒中温浴30min，TNT洗涤3x5min。

[0109] F．杂交信号观察

[0110] （1）滴加3μL含有1.5 µg/mL DAPI的防荧光淬灭剂（Vectashield），盖上盖玻片。

[0111] （2）Nikon 80i荧光显微镜观察，在紫外光激发下可观察到蓝色的染色体，在绿色激发光激发下可观察到红色的5S rDNA杂交信号。

[0112] （3） SPOT RT KE冷CCD进行图像采集，SPOT 4.1软件进行图像合成（见图2）。

[0113] 本发明的方法

[0114] 步骤：

[0115] 与经典的原位杂交相比

[0116] （1）探针制备方面，本发明的探针为寡核苷酸探针在合成时可加入荧光基团修饰，不用再进行标记，与现有技术相比方法简单、成本低廉。

[0117] （2）寡核苷酸探针很容易渗透进入染色体，所以染色体标本预处理步骤可简化。

[0118] （3）寡核苷酸探针不需要变性，杂交液的成分仅为2xSSC，比经典方法成分简单很多。

[0119] （4）杂交时间仅需1小时，不需要过夜。

[0120] （5）杂交后洗脱步骤简便，不需要甲酰胺

[0121] （6）杂交信号检测可直接观察，不需要抗体孵育等信号检测步骤[0122] 结论：

[0123] 本发明方法简单步骤简练，所需成本低，耗时短从杂交到结果观察可在3小时之内完成。

[0124] 实施例3

[0125] 实际应用的实施例

[0126] 应用本发明的方法已在如杨树（见图3）、花椰菜（见图4）、胡萝卜（图5）等30多种植物上多种植物上实验取得成功，

[0127] 方法：同实施例1

[0128] 步骤：同实施例1

[0129] 结论：本发明方法可推广应用于多种植物的5S rDNA FISH定位。