悬钩子环斑病毒RT-PCR检测引物及检测方法转让专利
申请号 : CN201310313071.2
文献号 : CN103409557B
文献日 : 2014-11-19
发明人 : 黄天培 , 吴媛 , 方志鹏 , 廖富荣 , 关雄
申请人 : 福建农林大学
摘要 :
本发明涉及悬钩子环斑病毒RT-PCR检测引物及检测方法，其引物由正向和反向引物组成，正向引物及其寡核苷酸序列为RpRSV-F1：5’-TCAGCGGTACTGTTAAATGTC-3’、反向引物及其寡核苷酸序列为RpRSV-R1：5’-CTAAAGGCACAACCTCAAAGA-3’。由该引物组成的RT-PCR检测方法，包括总RNA提取、RT-PCR扩增和RT-PCR产物电泳检测过程。该方法具有良好的特异性、灵敏性高，适合悬钩子环斑病毒的快速准确检测。
权利要求 :
1.一种悬钩子环斑病毒RT-PCR检测引物，其特征在于由1对寡核苷酸引物RpRSV-F1和RpRSV-R1组成，序列如下：RpRSV-F1： 5’-TCAGCGGTACTGTTAAATGTC-3’RpRSV-R1： 5’-CTAAAGGCACAACCTCAAAGA-3’。
2.一种利用权利要求1的引物检测悬钩子环斑病毒的RT-PCR方法，包括以样品总RNA为模板，进行RT-PCR扩增和RT-PCR产物电泳检测，其特征在于：（1）RT-PCR扩增：
第一步合成cDNA，在0.5 mL反应管中，加入6 μL总RNA，2 μL 10 μmol/L的下游引物RpRSV-R1，95℃水浴10 min，冰浴5 min，然后继续加入4 μL 2.5mmol/L的dNTPs，5 μL 5× Reaction buffer，0.5 μL 40 U/μL的Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor，0.5 μL 200 U/μL 的M-MLV Reverse transcriptase，7μL灭菌水，混匀后
37℃水浴60 min，75℃水浴15 min，合成cDNA；
第二步进行PCR扩增，PCR反应体系为25 μL，包括13.25μL灭菌水，2.5 μL 10× PCR buffer，2 μL dNTPs，2 μL上游引物RpRSV-F1，2μL下游引物RpRSV-R1，3 μL cDNA，
0.25 μL Ex Taq DNA聚合酶，混匀后于PTC-200 PCR仪上进行扩增；反应参数为94℃ 3 min；94℃ 50 s，58℃ 50 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃延伸10 min；
（2）RT-PCR产物电泳检测：
RT-PCR反应结束后，取3μL扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果：在222bp处未出现特异性基因条带的样品，表示该样品不含有RpRSV；在222bp处出现基因条带的样品，表示该样品含有RpRSV。
3.一种如权利要求1所述的引物在检测悬钩子环斑病毒上的应用。
说明书 :
悬钩子环斑病毒RT-PCR检测引物及检测方法
[0001] 技术领域 本发明涉及一种悬钩子环斑病毒的引物及检测方法，具体涉及悬钩子环斑病毒RT-PCR检测引物及检测方法，属分子生物学领域。
[0002] 背景技术 悬钩子环斑病毒(Raspberry ringspot virus, RpRSV)是线虫传多面体病毒属A亚组的成员，能侵染多数野生和栽培的双子叶和单子叶植物，至少有14个科的双子叶植物对该病毒表现为感病。RpRSV主要侵染悬钩子属植物、草莓、喇叭水仙、葡萄、矮牵牛、樱桃等植物，能侵入植物的花、果实、叶片、根和种子，导致卷叶病、顶端枯死、矮化病、环斑病等病症，田间作物病毒病的发作呈明显的块状。RpRSV主要分布于法国、挪威、奥地利、比利时、也门、加纳、波兰、土耳其、美国、芬兰、德国、希腊、匈牙利、冰岛、荷兰、西班牙、瑞士、英国和前苏联等。
[0003] 最初植物病毒的检测主要是生物学检测法，但由于其检测速度慢、受环境和季节影响较大等诸多因素限制而运用较少。现在应用较多的是血清学方法。RpRSV具有多个血清型突变株和分离物。常规的血清学方法灵敏度较低和特异性较差，容易出现假阳性和假阴性现象，导致出现漏检的现象，需要通过进一步检测加以鉴定。目前国内对RpRSV只有血清学检测，还未见有反转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）特异性检测RpRSV的研究报道。因此，建立快速、灵敏的RpRSV分子生物学检测方法十分重要。
[0004] 发明内容 本发明的目的是提供悬钩子环斑病毒RT-PCR检测引物及检测方法，所述RT-PCR，是应用反转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）技术检测悬钩子环斑病毒的方法，是基于对病毒的保守序列分析设计的特异反转录引物的检测方法，在植物病毒检测上具有快速、灵敏、特异性强的特点。
[0005] 实现上述发明目的的技术方案如下：
[0006] 本发明的悬钩子环斑病毒RT-PCR检测引物，其特征在于由1对寡核苷酸引物RpRSV-F1和RpRSV-R1组成，序列如下：
[0007] RpRSV-F1： 5’-TCAGCGGTACTGTTAAATGTC-3’
[0008] RpRSV-R1： 5’-CTAAAGGCACAACCTCAAAGA-3’；
[0009] 本发明利用悬钩子环斑病毒RT-PCR检测引物，检测悬钩子环斑病毒的RT-PCR方法，包括以样品总RNA为模板，进行RT-PCR扩增和RT-PCR产物电泳检测，其特征在于：
[0010] （1）RT-PCR扩增：
[0011] 第一步合成cDNA，在0.5 mL反应管中，加入6 μL总RNA，2 μL 10 μmol/L的下游引物RpRSV-R1，95℃水浴10 min，冰浴5 min，然后继续加入加入4 μL 2.5 mmol/L的dNTPs，5 μL 5× Reaction buffer，0.5 μL 40 U/μL的Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor，0.5 μL 200 U/μL 的M-MLV Reverse transcriptase，7μL灭菌水，混匀后37℃水浴60 min，75℃水浴15 min，合成cDNA；
[0012] 第二步进行PCR扩增，PCR反应体系为25 μL，包括13.25μL灭菌水，2.5 μL10× PCR buffer，2 μL dNTPs，2 μL上游引物RpRSV-F1，2μL下游引物RpRSV-R1，3 μL cDNA，0.25 μL Ex Taq DNA聚合酶，混匀后于PTC-200 PCR仪上进行扩增；反应参数为94℃
3 min；94℃ 50 s，58℃ 50 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃延伸10 min；
3 min；94℃ 50 s，58℃ 50 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃延伸10 min；
[0013] （2）RT-PCR产物电泳检测：
[0014] RT-PCR反应结束后，取3μL扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果：在222bp处未出现特异性基因条带的样品，表示该样品不含有RpRSV；在222bp处出现基因条带的样品，表示该样品含有RpRSV。
[0015] 本发明的优点和有益效果：对本发明的引物的特异性和灵敏度进行分析的结果，于供试的RpRSV阳性样品中，在222bp处扩增出特异的目的条带，而健康普通烟叶样品及同属同亚组的病毒成员南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)和烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)在222bp处都未扩增出特异条带；通过克隆测序，扩增序列与GenBank公布的RpRSV的不同分离物序列的同源性最高（92%-96%），证明该引物具有良好的特异性，检测结果具有可靠性。
[0016] 通过对引物灵敏度分析，该特异引物的灵敏度高，因此在样品量较少或者病毒含量在样品组织中含量很低的情况下，也能用该引物检测。通过RT-PCR检测RpRSV在口岸进境种苗携带病毒的实际检测过程中具有重要的应用价值。
[0017] 附图说明 图1为RT-PCR引物特异性示意图。其中，M表示 100bp DNA Marker；1表示含RpRSV的样品； 2表示健康的普通烟叶片的样品； 3表示含 ArMV，不含RpRSV的样品；4表示含TRSV，不含RpRSV的样品。
[0018] 图2 为RT-PCR引物灵敏度分析示意图。其中，M表示100bp DNA Marker；1表示0 -1 -2
cDNA相对浓度为10 ；2表示cDNA相对浓度为10 ；3表示cDNA相对浓度为10 ；4表示cDNA-3 -4 -5
相对浓度为10 ；5表示cDNA相对浓度为10 ；6表示cDNA相对浓度为10 ；7表示cDNA相-6 -7
对浓度为10 ；8表示cDNA相对浓度为10 。
cDNA相对浓度为10 ；2表示cDNA相对浓度为10 ；3表示cDNA相对浓度为10 ；4表示cDNA-3 -4 -5
相对浓度为10 ；5表示cDNA相对浓度为10 ；6表示cDNA相对浓度为10 ；7表示cDNA相-6 -7
对浓度为10 ；8表示cDNA相对浓度为10 。
[0019] 具体实施方式 为了进一步阐述本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
[0020] 实施例1 一种悬钩子环斑病毒RT-PCR检测方法，包括以下步骤：
[0021] 1. 总RNA的提取
[0022] 1）RpRSV新鲜叶片（购自Agdia公司）经液氮处理，磨成粉末状，用样品提取液稀释后，取200μL加入1 mL Trizol试剂，移入灭菌的1.5 ml离心管中；
[0023] 2）室温下保持5 min，加入0.2 ml氯仿，振荡15 s，然后在室温下保持10 min后，4 ℃，12000 g离心15 min；
[0024] 3）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加入0.5 ml异丙醇，颠倒混匀，室温下保持10 min；
[0025] 4）4 ℃，12000 g离心10 min；
[0026] 5）倒掉上清液，加入1 mL体积比为 75%的乙醇洗涤沉淀，然后4 ℃，7500 g离心5 min（如沉淀悬浮起来，则用12000 g），弃去乙醇；
[0027] 6）沉淀于室温下干燥后，溶于50 μL ddH2O（DEPC处理）中，55 ℃水浴10 min后，-20℃保存备用。
[0028] 2. 引物设计和合成
[0029] 利用DNAMAN和PRIMER PREMIER5.0软件根据RpRSV的非编码区保守区域序列设计1对寡核苷酸引物，上游引物RpRSV-F1和下游引物RpRSV-R1。
[0030] 上游引物及其序列为：
[0031] RpRSV-F1（SEQ ID NO：1）：5’-TCAGCGGTACTGTTAAATGTC-3’
[0032] 下游引物及其序列为：
[0033] RpRSV-R1（SEQ ID NO：2）： 5’-CTAAAGGCACAACCTCAAAGA-3’
[0034] 3. 悬钩子环斑病毒RT-PCR检测方法的建立
[0035] 第一步合成cDNA。在0.5 mL反应管中，加入6 μL总RNA，2 μL 下游引物RpRSV-R1（10 μmol/L），95℃水浴10 min，冰浴5 min，加入4 μL dNTPs (2.5mmol/L)，5 μL 5× Reaction buffer，0.5 μL Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor (40 U/μL)，0.5 μL M-MLV Reverse transcriptase (200 U/μL)，7μL灭菌水，混匀后
37℃水浴60 min，75℃水浴15 min，合成cDNA。
37℃水浴60 min，75℃水浴15 min，合成cDNA。
[0036] 第二步进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL，包括13.25μL灭菌水，2.5 μL10× PCR buffer，2 μL dNTPs，2 μL上游引物RpRSV-F1，2μL下游引物RpRSV-R1，3 μL cDNA，0.25 μL Ex Taq DNA聚合酶，混匀后于PTC-200 PCR仪上进行扩增；反应参数为94℃
3 min；94℃ 50 s，58℃ 50 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃延伸10 min。
3 min；94℃ 50 s，58℃ 50 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃延伸10 min。
[0037] RT-PCR反应结束后，取3μL扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察、拍照。以是否产生222bp特异条带来判定样品中是否含有RpRSV。
[0038] 实施例2 悬钩子环斑病毒RT-PCR的特异性检测
[0039] 取RpRSV、ArMV和TRSV新鲜叶片（均购自Agdia公司）和阴性样品健康普通烟叶，按实施例1方法提取总RNA、进行RT-PCR扩增，凝胶电泳检测结果。结果RpRSV病叶中产生222bp的特异条带，而ArMV和TRSV病叶以及健康的普通烟叶均未产生222bp的特异条带，检测结果如图1所示。将RT-PCR产物克隆至pMD18-T载体并测序。结果表明，扩增的目的片段序列与GenBank公布的RpRSV的不同分离物序列的同源性最高（92%-96%）。因此该引物为RpRSV的特异性引物，可用于RpRSV的快速检测。
[0040] 上述结果表明建立的RT-PCR方法具有良好的特异性，可用于RpRSV的检测。
[0041] 实施例3 RpRSV RT-PCR的灵敏性检测
[0042] 按实施例1方法进行反转录后，将cDNA进行10倍系列稀释，进行RT-PCR扩增，以检测该方法的相对灵敏度。RT-PCR检测结果如图2所示。该特异引物RpRSV-F1（SEQ ID -3NO：1）和RpRSV-R1（SEQ ID NO：2）能检测到的最低相对cDNA浓度的灵敏度为10 ，引物灵敏度好。
[0043] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。