一种快速检测鱼Ⅱ型疱疹病毒的方法

摘要

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种快速检测鱼Ⅱ型疱疹病毒的方法，通过设计特定引物，对样本DNA进行LAMP反应，检测产物中是否含有扩增产物，从而确定样本中是否带有鱼Ⅱ型疱疹病毒。本发明提供的检测方法操作简便，只需一个恒温装置；检测周期短；检测结果灵敏度、正确度高；检测成本低；不仅可以用于病死鱼的病毒检测，还可用于检疫，具有重要的实施价值。

权利要求

1.一种快速检测鱼Ⅱ型疱疹病毒的LAMP试剂盒，其特征在于：所述LAMP试剂盒包括内引物、外引物、环引物、甜菜碱、三磷酸脱氧核苷酸、Bst DNA聚合酶；其中内引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、外引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4、环引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；

所述SEQ ID No.1：5’-ACG TCC ACA GAC CGT CGT CGT TTT GTT CGG TCA CCC AGC TAC A-3’；

SEQ ID No.2：5’-AAT GGG ATC AGG TCA AGT GCG CTT TCG CTG TAC TCT GGA TCC TCT-3’；

SEQ ID No.3：5’-CAA CAC CTG GTG GCG ATA G-3’；

SEQ ID No.4：5’-GTG CTA ACG TTG TGC TGA AC-3’；

SEQ ID No.5：5’-CCT GTC CCT GTC CTC GGG-3’；

SEQ ID No.6：5’-CTT TCA ACC TAC CCT TTA GCG TC-3’。

说明书

一种快速检测鱼Ⅱ型疱疹病毒的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种鱼类病毒的快速检测方法，具体涉及一种通过对鱼Ⅱ型疱疹病毒核酸保守区域的检测实现对鱼Ⅱ型疱疹病毒快速检测方法。

背景技术

[0002] 在养殖生产中，能够产生死鱼的原因有很多，而因病致死的病原也非常多，发病条件复杂。因此查明病死鱼的病原体，对养殖鱼的后续处理、养殖水体的供排水、来年水体的消毒方式有着非常重要的指导意义。

[0003] 鲤疱疹病毒( Cyprinid herpesvirus)是一种线性，双链DNA病毒，有三种类型：CyHV-1、CyHV-2以及CyHV-3，其中CyHV-2（鱼Ⅱ型疱疹病毒）是一种感染金鱼、鲫鱼及其变种的高致病性病毒，最初在金鱼中暴发，感染异育银鲫会引起鳃出血病。

[0004] 有关鱼Ⅱ型疱疹病毒的研究在病原学、病理学、流行病学以及诊断学研究方面已深入到分子水平，但由于诸多原因，到目前为止还不能完全控制鱼Ⅱ型疱疹病毒的疫情，面对鱼Ⅱ型疱疹病毒的所造成的危害及传布所能采取最主要的措施是及早发现和消灭传染源，果断切断传播途径。这样就需要建立和完善灵敏、准确、高效、快捷、方便的检测方法。

[0005] PCR检测由于其快速而又特异，应用方便，还可以进一步衍生出巢式PCR(nested-PCR)而得到应用。2002年Oren Gilad等从病鱼组织中对疱疹病毒进行了分离和纯化，将纯化病毒的DNA提取后，建立了PCR的诊断方法，检测出疱疹病毒；但存在诊断的灵敏度不高和假阳性问题，且前期需要对病毒进行复杂的分离和纯化，以取得大量纯度非常高的待检测样品于检测(参见：Oren Gilad, Susan Yun, Karl B. Andree, Mark A. Adkison, Amir Zlotkin, Herve Bercovier, Avi Eldar, Ronald P. Hedrick. .Initial characteristics of koi herpesvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in koi, Cyprinus carpio koi. Dis Aquat Org.2002, 48: 101–108)；2007范万红建立了用实时荧光定量PCR方法来检测锦鲤疱疹病毒，该方法可靠，但耗时长，需要非常昂贵的定量PCR仪及专门的操作人员，无法在基层养殖单位得到应用(参见：范长红，刘荭，岳志芹，吕建强，何俊强，江育林. 锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用. 中国海洋大学学报 2007,39(5) :785-788)。另外还有利用核酸杂交技术，通过原位杂交或斑点杂交来完成，原位杂交需要先制组织切片，而且此法耗时长，操作繁琐，不适合在基层使用，斑点杂交需要把待测核酸固定于杂交膜上再行杂交、显影，适合于批量样品操作，但仅杂交后的显影检测需15小时左右，耗时长。

[0006] 近年来发展起来的环介导等温扩增法(LAMP, loop-mediated isothermal amplification)可以高灵敏地非常有选择性地高效扩增靶序列，最终的LAMP产物是是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱。通常为了使用LAMP方法实现检测，需要先期制备供扩增用的模板，在LAMP 扩增后，还需要对扩增产物进行可视化观察，以确定 LAMP 的最终扩增结果，该结果代表了检测的最终结果。LAMP是一种全新的恒温核酸扩增方法，和其它核酸扩增技术相比，具有等温扩增，只需要一个恒温装置、高效灵敏，模板仅需要10个拷贝或更少、扩增特异性强，应用包含了六个区段的四条引物按严格顺序进行扩增、检测时间短，扩增可以在60min内完成，比普通PCR反应还要省时间、产物可以通过直接在反应管中加SYBR GreenⅠ染色（由橙色转为绿色）或用琼脂糖凝胶电泳检测的优点，其用于鱼病毒的检测，具有速度快、无需前期纯化病毒，操作简单的效果；但是其反应原理、引物设计复杂，同时作为病毒基因检测新技术，还需要寻找到合适的可供检测的病毒基因区域并设计出有效地引物。

发明内容

[0007] 本发明的发明目的是提供一种快速检测鱼Ⅱ型疱疹病毒的方法，基本思路是通过基因技术，设计特定引物，对样本DNA进行LAMP反应，检测产物中是否含有扩增产物，从而确定样本中是否带有鱼Ⅱ型疱疹病毒。

[0008] 为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种快速检测鱼Ⅱ型疱疹病毒的方法，包括以下步骤：

[0009] (1) 制备检测样品：提取待检测鱼组织中的总DNA，制备成模板DNA；

[0010] (2) 环介导等温扩增：构建反应体系，以反应体系体积每25μL计，首先将内引物、外引物、甜菜碱、三磷酸脱氧核苷酸以及1μL步骤（1）制备的模板DNA加入到2.5μL10倍环介导等温扩增反应液中，再补充灭菌的超纯水到24μL；将反应物混合均匀后加热到95℃并保持3～5min，之后放入冰水中冷却10～20秒，再加入1μL的8U/μL的Bst DNA聚合酶，混合均匀后于61～65℃孵育30～60min，结束反应得到环介导等温扩增反应产物；其中内引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2各0.4μmol/L、外引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4各0.2μmol/L、甜菜碱1.5mol/L、三磷酸脱氧核苷酸0.1～0.4μmol/L；

[0011] 所述SEQ ID No.1：5’-ACG TCC ACA GAC CGT CGT CGT TTT GTT CGG TCA CCC AGC TAC A-3’；

[0012] SEQ ID No.2：5’-AAT GGG ATC AGG TCA AGT GCG CTT TCG CTG TAC TCT GGA TCC TCT-3’；

[0013] SEQ ID No.3：5’-CAA CAC CTG GTG GCG ATA G-3’；

[0014] SEQ ID No.4：5’-GTG CTA ACG TTG TGC TGA AC-3’；

[0015] (3) 检测结果判定：检测步骤（2）制备的反应产物，如果存在环介导等温扩增产物，则说明待检测鱼中有鱼Ⅱ型疱疹病毒。

[0016] 优选的技术方案中，上述步骤（2）的反应体系还包括环引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.6各0.2μmol/L；

[0017] 所述SEQ ID No.5：5’-CCT GTC CCT GTC CTC GGG-3’；

[0018] SEQ ID No.6：5’-CTT TCA ACC TAC CCT TTA GCG TC-3’。

[0019] 环引物的加入进一步缩短了扩增时间，与无环引物的扩增体系相比，扩增过程节省的时间达40%。

[0020] 上述引物是根据鱼Ⅱ型疱疹病毒（Cyprinid herpersvirus 2, CyHV-2） DNA基因组序列中较为保守的CyHV-2解旋酶基因（GenBank登录号为No.KC245087.1）经生物序列的相似性搜索（BLAST）分析确定的并且与GenBank公布的其它核酸序列无同源的保守区域以及引物设计原则分别设计的。

[0021] 本发明中制备检测样品为现有技术，可以通过常规的酚/氯仿提取DNA，也可以参考中国专利ZL 201010201656.1中核酸样品的制备方法来制备样品，或者是通过商业化的DNA提取试剂盒来实现；检测LAMP反应产物的方法为现有技术，可以通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测LAMP反应产物，有扩增条带出现的为检测结果阳性；或者向经稀释1000倍的LAMP反应产物中加入100倍稀释的商品化SYBR Green I染料1μL后，颜色由橙色变为绿色，提示检测结果为阳性。阳性检测结果的出现说明通过环介导等温扩增反应已扩增到仅属于鱼Ⅱ型疱疹病毒核酸相关的片段，即检测对象带有鱼Ⅱ型疱疹病毒。

[0022] 在LAMP反应产物检测中，阳性对照为含有CyHV-2解旋酶基因的质粒（pMD-T- CyHV-2）片段；阴性对照优选为健康鱼的DNA提取物，即没有受到鱼Ⅱ型疱疹病毒感染的健康的鱼，鱼的种类与待检测的鱼保持一致，提取方法可与待检测样品制备一致，例如：当待检测的鱼为异育银鲫时，阴性对照即为健康的异育银鲫的DNA提取物；当待检测的鱼锦鲤时，阴性对照即为健康的锦鲤的DNA提取物。以健康鱼的DNA提取物为阴性对照而不选用二次蒸馏水为阴性对照的目的是保证检测的真实有效性，因为如果以二次蒸馏水为阴性对照，以CyHV-2解旋酶基因的质粒片段为阳性对照时，即使待检测的鱼最后的检测结果呈阳性，那么也可能是由于鱼的DNA导致的；而如果以健康的同一种类的鱼的DNA提取物为阴性对照，而以CyHV-2解旋酶基因的质粒片段为阳性对照时就不会出现这样的情况；所述鱼的种类包括：普通鲫鱼、异育银鲫、锦鲤、金鱼、鲤鱼。

[0023] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有以下优点：

[0024] （1）本发明实现了对鱼Ⅱ型疱疹病毒的快速检测，整个检测时间可以在3小时左右完成，快于PCR检测，比用核酸杂交法检测时间省10小时以上；

[0025] （2）本发明设计了4个（二对）引物覆盖了鱼Ⅱ型疱疹病毒DNA靶序列的6个区段，大大提高了检测的特异性；

[0026] （3）本发明提供的检测方法操作简便，只需一个恒温装置；检测周期短；检测结果灵敏度、正确度高；检测成本低；不仅可以用于病死鱼的病毒检测，还可用于检疫，具有重要的工业应用价值。

附图说明

[0027] 图1是实施例一中LAMP 反应产物的琼脂糖凝胶电泳检测图；

[0028] 图2是实施例三中LAMP 反应产物的检测图；

[0029] 图3是实施例三中病死金鱼肠组织的SEM图；

[0030] 图4是实施例四中LAMP 反应产物的检测图；

[0031] 图5是实施例五中LAMP 反应产物的检测图。

具体实施方式

[0032] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

[0033] 实施例中LAMP核心引物是由一对外引物和一对内引物组成，其中一对内引物由前内引物CyHV-FIP（SEQ ID No.1）和后内引物CyHV-BIP（SEQ ID No.2）组成；一对外引物由前外引物CyHV-F3（SEQ ID No.3）和后外引物CyHV-B3（SEQ ID No.4）组成；

[0034] 所述前内引物SEQ ID No.1包含F1C，一个TTTT连接子和F2，其序列为5’-ACG TCC ACA GAC CGT CGT CGT TTT GTT CGG TCA CCC AGC TAC A-3’；

[0035] 后内引物SEQ ID No.2包含B1C，一个TTT连接子和CyHV-B2，其序列如下所示：5’-AAT GGG ATC AGG TCA AGT GCG CTT TCG CTG TAC TCT GGA TCC TCT-3’；

[0036] 前外引物SEQ ID No.3的序列为：5’-CAA CAC CTG GTG GCG ATA G-3’；

[0037] 后外引物SEQ ID No.4的序列为：5’ –GTG CTA ACG TTG TGC TGA AC-3’;

[0038] 为了加速扩增反应，设计了环引物，包括前环引物CyHV-LF（SEQ ID No.5）以及后环引物（SEQ ID No.6）CyHV-LB；

[0039] SEQ ID No.5：5’-CCT GTC CCT GTC CTC GGG-3’；

[0040] SEQ ID No.6：5’-CTT TCA ACC TAC CCT TTA GCG TC-3’。

[0041] 实施例一：对死亡异育银鲫的鱼Ⅱ型疱疹病毒检测

[0042] 1. 制备检测样品：取出待检测死亡鱼（新鲜或冷冻的样本均可）肠组织0.1 g，加入1ml TE缓冲液（50mmol/L Tris-HCl，0.4mol/L EDTA，pH7.6），冰浴匀浆，充分研磨后，分别取500µL组织研磨液至两个离心管中。每管分别加入等体积（500μL）的Tris饱和酚，颠倒混合后4℃，12,000r/min离心10min。上清转入新离心管，再加入等体积的酚/氯仿（各250μL），颠倒混合后4℃，12,000r/min离心10min。再取上清转入新的离心管，加入等体积的氯仿（500μL），颠倒混合后4℃，12,000r/min，离心10min。取上清转入新的离心管中，加入1/10体积NaAC(3mol/L)，2倍体积的预冷无水乙醇，颠倒混匀后4℃ 12,000r/min离心10min再去上清，干燥纸上倒置两分钟。加入500μL 70%的乙醇于沉淀中洗盐后，4℃，
12,000r/min离心5min，最后弃上清，室温或37℃晾干后溶于50μL的TE缓冲液中，作为供扩增检测用的模板；

[0043] 2. LAMP反应：在每25μL扩增体系中，包含：10倍环介导等温扩增反应液2.5μL，终浓度各为0.4μmol/L的内引物CyHV-FIP（SEQ ID No.1）和CyHV-BIP（SEQ ID No.2），终浓度各为0.2μmol/L的外引物CyHV-F3（SEQ ID No.3）和CyHV-B3（SEQ ID No.4），终浓度为0.4-0.1μmol/L的dNTPs，终浓度为1.5mol/L的甜菜碱，步骤1所得的模板1μL；补加灭菌的超纯水至24μL；将反应混合物混匀后加热变性，迅速于冰中冷却后加入1μL的8U/μL的Bst DNA聚合酶，混匀后于61℃孵育50min，结束反应得到LAMP反应产物；

[0044] 3. 检测结果判定：LAMP 反应产物可通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。具体操作过程为：称取4.5g琼脂糖，加入1×TBE缓冲液30mL，100℃煮沸至完全溶解，冷却至适温（约50℃）加入10000×Gelred 3μL摇匀即可灌制凝胶；取上述LAMP 反应产物10μL加样至加样孔中，进行电泳；电泳条件为：电压45V，电流60mA，电泳时间约为1h。

[0045] 附图1为检测图，从左到右：1为阳性对照质粒，2为死亡的异育银鲫，3为正常的异育银鲫；结果显示有扩增条带出现，表明结果为阳性，说明死亡异育银鲫带有鱼Ⅱ型疱疹病毒。

[0046] 实施例二：对死亡锦鲤的鱼Ⅱ型疱疹病毒检测

[0047] 1. 制备检测样品：取出待检测死亡鱼（新鲜或冷冻的样本均可）肾组织0.01 g，使用商品化的基因组提取试剂盒，该试剂盒可以为Tiangen公司产品，试剂盒名称为磁珠法基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书操作，最终溶于50µl洗脱液中，作为检测模板；

[0048] 2. LAMP反应：在每25μL扩增体系中，包含：10倍环介导等温扩增反应液2.5μL，终浓度各为0.4μmol/L的内引物CyHV-FIP（SEQ ID No.1）和CyHV-BIP（SEQ ID No.2），终浓度各为0.2μmol/L的外引物CyHV-F3（SEQ ID No.3）和CyHV-B3（SEQ ID No.4），终浓度各为0.2μmol/L的前环引物CyHV-LF（SEQ ID No.5）和后环引物CyHV-LB（SEQ ID No.6），终浓度为0.4-0.1μmol/L的dNTPs，终浓度为1.5mol/L的甜菜碱，步骤1所得的模板1μL；补加灭菌的超纯水至24μL；将反应混合物混匀后加热变性，迅速于冰中冷却后加入1µL的8U/μL的Bst DNA聚合酶，混匀后于61℃孵育30min，结束反应；

[0049] 3. 检测结果判定：将上述LAMP扩增产物稀释1000倍后，取25μL稀释液，加入100倍稀释的SYBR Green I染料1μL后，再将该小型离心管直接置于紫外灯下，加入SYBR Green I染料的LAMP扩增产物稀释液的颜色由橙色变为绿色，提示检测结果为阳性，即扩增产物中有鱼Ⅱ型疱疹病毒的核酸片段，说明死亡异育银鲫带有鱼Ⅱ型疱疹病毒。

[0050] 实施例三：对死亡金鱼的鱼Ⅱ疱疹病毒检测

[0051] 1.制备检测样品：取出待检测死亡鱼（新鲜或冷冻的样本均可）肝组织0.01 g，使用商品化的基因组提取试剂盒，该试剂盒可以为康为世纪公司产品，试剂盒名称为通用型基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书操作，最终溶于50μl洗脱液中，作为检测模板；

[0052] 2.LAMP扩增反应：同实施例二中步骤2；

[0053] 3.检测结果判定：同实施例二中步骤3，加入SYBR Green I染料的LAMP扩增产物稀释液的颜色由橙色变为绿色，其照片见附图2，其中从左到右：1为死亡的金鱼，2为正常金鱼对照，3为阴性质粒对照；可以看出检测结果为阳性，说明死亡金鱼带有鱼Ⅱ型疱疹病毒。

[0054] 附图3为上述死亡金鱼的肠组织的SEM图，从电镜照片中可证实有该种病毒颗粒。

[0055] 实施例四：对死亡普通鲫鱼的鱼Ⅱ疱疹病毒检测

[0056] 1.制备检测样品：取出待检测死亡鱼（新鲜或冷冻的样本均可）心组织0.01 g，使用商品化的基因组提取试剂盒，该试剂盒可以为Qiagen公司产品，试剂盒名称为QIAamp DNA Mni kit，按试剂盒说明书操作，最终溶于50μl洗脱液中，作为检测模板；

[0057] 2.LAMP扩增反应：同实施例一中步骤2；

[0058] 3.检测结果判定：同实施例一中步骤3，附图4为上述检测的结果图，从左到右：1为死亡的鲫鱼，2为正常鲫鱼对照，3为阳性质粒对照，可以看出检测结果为阳性，说明死亡鲫鱼带有鱼Ⅱ型疱疹病毒。

[0059] 实施例五：对异育银鲫鱼苗的鱼Ⅱ疱疹病毒检疫

[0060] 1.制备检测样品：取待检异育银鲫鱼苗多条，去头尾及鳍后总重约0.2g，按1/3（W/V）比例加入DNA抽提缓冲液（10 mM Tris-HCl，0.05 mM EDTA, 5mM(NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100,pH7.8），沸水浴5min，再经7000r/min离心5min后的上清1.0μL作为一个25μL LAMP反应的模板；

[0061] 2. LAMP扩增反应：同实施例二中步骤2；

[0062] 3.检测结果判定：同实施例二中步骤3，加入SYBR Green I染料的LAMP扩增产物稀释液的颜色由橙色变为绿色，其照片见附图5，其中从左到右：1为正常的的异育银鲫，2为从异育银鲫鱼苗中检测出阳性结果，3为阳性质粒对照，可以看出检测结果为阳性，说明异育银鲫鱼苗带有鱼Ⅱ型疱疹病毒。