基于氧化石墨烯的表面等离激元共振DNA传感器的制备方法

摘要

本发明公开一种基于氧化石墨烯的表面等离激元共振（SPR）DNA传感器的制备方法。属于纳米材料生物技术领域。主要解决的技术问题是，利用氧化石墨烯-DNA的特异作用，应用表面等离激元共振技术和金纳米粒子的信号放大机理，基于竞争抑制法，检测不同浓度单链DNA吸附在传感芯片表面引起SPR光谱变化，通过共振角度的线性变化实现对单链DNA的检测。本发明利用SPR技术，利用GO组装芯片表面，采用竞争抑制法和AuNPs信号放大作用能够灵敏地检测单链DNA，通过分析SPR共振峰的变化，定量检测单链DNA的浓度，具有超低的检测极限。本发明的优点：仪器设备廉价，成本低，操作简单，效率高，精确度高，检测极限低。

权利要求

1.一种基于氧化石墨烯的表面等离激元共振DNA传感器的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：(1)首先将化学法制备的氧化石墨烯溶于水中，通过超声剥离得到分散性良好的氧化石墨烯水溶液，氧化石墨烯水溶液的浓度是0.01-10mg/ml；

(2)在表面等离激元共振传感器芯片表面通入氧化石墨烯溶液1-16小时，然后通入去离子水，用高纯氮气吹干芯片；

-14 -6

(3)将单链DNA功能化的金纳米粒子与不同浓度(10 -10 M)的碱基匹配的目标单链DNA溶液杂化混合1-24小时；

(4)按照目标单链DNA浓度由高到低的顺序，分别将以上混合溶液通入样品池10-60分钟，每次通入测试样品溶液后用pH＝7.4的磷酸缓冲溶液冲洗，利用表面等离激元共振传感器测试表面等离激元共振曲线，确定共振峰位的变化；

(5)测试完成后，通入浓度为4M的尿素溶液0.5-6小时，然后用磷酸缓冲溶液冲洗，使表面等离激元共振传感芯片重复使用；

芯片表面传感过程是利用单链DNA与双链DNA在氧化石墨烯表面的竞争抑制，两者在溶液中同时存在时，基于竞争抑制，单链DNA会优先大量吸附在氧化石墨烯表面；

所述传感器具有超低的检测极限，能够检测到浓度为10-14单链DNA的浓度变化；

所述传感芯片具有可靠的可再生性，能够重复使用。

说明书

基于氧化石墨烯的表面等离激元共振DNA传感器的制备方

法

技术领域

[0001] 本发明属于表面等离激元共振传感器单链DNA生物检测技术领域，特别涉及一种氧化石墨烯的SPR生物传感器及其制备方法。

背景技术

[0002] DNA作为生物的基本遗传物质，DNA的检测在生物技术、环保、生命科学等领域都有重大应用价值。DNA传感器的研究在国内外受到广泛的关注。表面等离激元共振传感器（Surface Plasmon Resonance,SPR）是金属表面的等离激元波耦合照射光产生的一种共振现象，金属薄膜表面介电常数和厚度的变化会影响SPR共振曲线的变化，从而实现金属表面介质环境变化的传感。具有实时、原位和免标记检测、检测快速、灵敏度高，检测极限（limited of detection,LOD）低等特点，目前主要用于医药、生物、化学、食品等领域的研究应用，可免标记检测蛋白质，DNA等物质。但是，由于传统检测单链DNA的方法是在SPR芯片表面固定探针单链DNA（ssDNA）分子，利用碱基序列匹配方法捕获样品溶液中的目标单链DNA，从而实现检测目的。

[0003] 石墨烯是2004年发现并迅速发展的一种新型材料，广泛应用于医药、生物、化学、电子、物理等领域。石墨烯被氧化可以形成氧化石墨烯（Graphene Oxide,GO），表面带有羧基、羟基等含氧官能团，可以溶于水，与ssDNA能够由氢键和π-π键相互作用而稳定结合，结合力远大于双链DNA（dsDNA）与GO的结合力。

[0004] 与本发明最相近的用于检测ssDNA的技术是利用SPR芯片表面固定探针ssDNA检测法和利用荧光标记探针分子通过荧光淬灭间接检测法。SPR芯片表面直接检测法是在芯片金膜表面固定探针ssDNA，直接检测碱基匹配的ssDNA；荧光淬灭法是在ssDNA一端利用荧光分子标记，通过测定与溶液中的GO结合后荧光淬灭程度确定ssDNA数量。

[0005] 现有检测技术存在的主要问题是：（1）SPR芯片表面直接检测法中表面直接固定探针ssDNA的固定量少，对单链DNA检测极限不够低。（2）荧光淬灭法利用荧光分子标记探针ssDNA分子，通过荧光分子和GO结合发生荧光淬灭现象，从而间接检测ssDNA分子，需要复杂的荧光标记过程，需要特殊的分子生物学设备，成本高，并且无法直观检测ssDNA分子的浓度。

[0006] 事实上，检测ssDNA的传感技术的发展方向是提高灵敏度和特异性，降低检测极限，简化检测过程，但是，由于传感仪器和方法的影响，无法利用很简单的传感方法和传感芯片 实现对ssDNA的超低检测极限，难以满足科研和实际应用中样品中对ssDNA的检测要求。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种基于氧化石墨烯的表面等离激元共振DNA传感器的制备方法，要解决的技术问题是，应用GO组装表面等离激元共振（SPR）传感器芯片表面，基于竞争抑制分析方法，利用ssDNA功能化的金纳米粒子（AuNPs-ssDNA）作为竞争反应物，高灵敏度，超低检测极限的检测ssDNA。

[0008] 表面等离激元共振技术是，以波长为632.8nm的激光，基于棱镜耦合方法激发厚度为50nm金膜表面的表面等离激元共振波，当发生表面等离激元共振时，入射光能量几乎全部被束缚在金膜表面形成SPR，接受器接收到的光强最小，形成共振峰，当金膜表面介质环境的介电常数和厚度发生变化时，共振峰的强度和位置发生变化，从而，根据研究共振峰的变化可以定量研究表面介质的变化情况。

[0009] 本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

[0010] 一种基于氧化石墨烯的表面等离激元共振DNA传感器的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

[0011] （1）首先将化学法制备的氧化石墨烯溶于水中，通过超声剥离得到分散性良好的氧化石墨烯水溶液，氧化石墨烯水溶液的浓度是0.01-10mg/ml；

[0012] （2）在表面等离激元共振传感器芯片表面通入氧化石墨烯溶液1-16小时，然后通入去离子水，用高纯氮气吹干芯片；

[0013] （3）将单链DNA功能化的金纳米粒子与不同浓度（10-14-10-6M）的碱基匹配的目标单链DNA溶液杂化混合1-24小时；

[0014] （4）按照目标单链DNA浓度由高到低的顺序，分别将以上混合溶液通入样品池10-60分钟，每次通入测试样品溶液后用pH=7.4的磷酸缓冲溶液冲洗，利用表面等离激元共振传感器测试表面等离激元共振曲线，确定共振峰位的变化。

[0015] （5）测试完成后，通入浓度为4M的尿素溶液0.5-6小时，然后用磷酸缓冲溶液冲洗，可以使表面等离激元共振传感芯片重复使用。

[0016] 所述传感芯片材料为：利用磁控溅射方法在LaSFN9玻璃表面依次镀制0.5-2nm的铬膜和45-55nm的金膜，利用氧化石墨烯组装在金膜表面，氧化石墨烯表面能够吸附大量单链DNA，但是对双链DNA的吸附量相对很少。

[0017] 传感过程是利用单链DNA与双链DNA在氧化石墨烯表面的竞争抑制，两者在溶液中同时存在时，基于竞争抑制，单链DNA会优先大量吸附在氧化石墨烯表面。

[0018] 所述传感器具有超低的检测极限，能够检测到浓度为10-14单链DNA的浓度变化。

[0019] 本发明利用SPR技术，利用GO组装芯片表面，采用竞争抑制法和AuNPs信号放大作用，能够灵敏的检测单链DNA，通过分析SPR共振峰的变化，定量检测单链DNA的浓度， 具有超低的检测极限，最低检测极限为10fM。具有非常高的特异性，当一个单链DNA的一个碱基发生突变时，就能够在SPR角度变化就会超出线性范围。结果表明，此方法确实可以解决目前ssDNA降低检测极限难的问题。该检测方法简单、经济、高效，稳定，具有良好的应用前景。

附图说明

[0020] 图1是基于氧化石墨烯SPR检测平台结合竞争抑制法检测ssDNA原理图。

[0021] 图2是ssDNA与AuNPs连接前后的紫外光谱图。

[0022] 图3（a）是金膜表面的原子力显微镜图。

[0023] 图3（b）是金膜表面组装GO后的原子力显微镜图。

[0024] 图4是GO表面（圆），AuNPs-ssDNA吸附在GO表面（方框），存在部分碱基匹配目标csDNA（倒三角）和存在不匹配msDNA（正三角）的SPR曲线及示意图。

[0025] 图5（a）是ssDNA作为竞争物质的竞争法检测不同浓度目标csDNA的SPR曲线图和示意图。

[0026] 图5（b）是AuNPs-ssDNA作为竞争物质的竞争法检测不同浓度目标csDNA的SPR曲线图和示意图。

[0027] 图6（a）是AuNPs-ssDNA作为竞争物质的不同浓度目标csDNA检测结果图。

[0028] 图6（b）是ssDNA作为竞争物质的不同浓度目标csDNA检测结果图。

[0029] 图7是本发明GO基底的可再生实验SPR曲线图。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0031] 本发明所述一种基于氧化石墨烯的表面等离激元共振DNA传感器的制备方法，包括以下步骤：

[0032] 第一、制备氧化石墨烯

[0033] 将氧化石墨溶于水中，通过超声剥离得到分散性良好的氧化石墨烯溶液，氧化石墨烯溶液的浓度是0.01-10mg/ml。

[0034] 第二、将制备好的GO溶液通入SPR样品池，使GO溶液浸泡SPR金膜芯片1-16小时，实现对SPR芯片表面的GO组装。

[0035] 第三、九份不同浓度（10-14-10-6M）碱基匹配的目标ssDNA溶液与竞争反应物AuNPs-ssDNA溶液混合，杂化培育1-24小时。

[0036] 第四、将以上九份溶液按高浓度到低浓度分别通入样品池，每一个浓度通入时间为15分钟，并且用磷酸缓冲溶液冲洗芯片，测试每一个浓度的SPR曲线。

[0037] 第五、按照上述实验过程，使用ssDNA作为竞争反应物溶液，同样测试每一种浓度的 SPR曲线，对比证明竞争反应物AuNPs-ssDNA溶液的信号放大作用。

[0038] 第六、检测完样品后，向样品池中通入浓度为4M的尿素溶液0.5-6小时，然后用磷酸缓冲溶液冲洗，实现SPR传感芯片重复使用，测试SPR曲线。

[0039] 以下结合实例进一步说明本发明的具体内容及其实施方式。

[0040] 实施例一：组装GO的SPR传感器对目标单链DNA的检测方法

[0041] 在SPR芯片表面组装GO后，分别与单链DNA溶液和双链DNA溶液作用时，单链DNA在GO表面吸附的数量远大于双链DNA。利用ssDNA功能化的金纳米粒子（AuNPs-ssDNA）作为竞争反应物，浓度越高的目标单链DNA与其混合后，形成的双链DNA越多，与GO吸附的数量就越少，SPR共振角变化越小。当目标单链DNA不匹配时，不匹配的单链DNA和AuNPs-ssDNA全部吸附在GO表面。

[0042] 实施例二：制备金纳米粒子

[0043] 14nm的金纳米粒子的制备是根据传统的Frens-Turkevich方法，在有冷凝器的1L三颈瓶中，加入浓度为1mM的氯金酸500mL，冷凝回流及磁力搅拌下油浴加热至沸，迅速加入浓度为38.8mM的柠檬酸钠50mL，颜色由淡黄色变为紫红色，继续搅拌加热10分钟，缓慢冷却到室温，转存入广口瓶中备用。

[0044] 实施例三：AuNPs-ssDNA的制备

[0045] 将150μL、40μM的二硫键修饰的探针ssDNA水溶液加入到3mL、6nM的金纳米粒子溶液中，静置过夜；然后加入3mL磷酸盐缓冲溶液（pH=7.4，10mM磷酸缓冲液，0.2M氯化钠），静置2h；最后用真空离心浓缩仪将溶液浓缩至900μL；离心（9000rpm，15min/次）三次以除去未反应的ssDNA，最终分散在3mL的磷酸盐缓冲溶液中。参阅图2，ssDNA功能化的金纳米粒子前后的紫外光谱表征图。

[0046] 实施例四：GO组装的SPR芯片平台的构建

[0047] 利用将改进的Hummers法制备氧化石墨烯溶于水中，通过超声剥离得到分散性良好的氧化石墨烯溶液，氧化石墨烯溶液的浓度是（0.01，2，10）mg/ml；将2mg/mL的GO水溶液通入样品池，组装（1，12，16）h，然后用去离子水冲掉未组装的GO溶液，然后用高纯氮气吹干传感芯片金膜表面，测试传感芯片金膜表面组装GO后的SPR曲线。参阅图3，通过对比传感芯片金膜表面组装GO前后的AFM图像，表明GO成功组装在金膜表面，证明完成本发明的氧化石墨烯SPR传感芯片。

[0048] 实施例五：基于竞争抑制原理检测ssDNA分子

[0049] 在固定浓度的AuNPs-ssDNA溶液中，分别与碱基匹配的csDNA（10-6M）溶液和不-6匹配的msDNA（10 M）溶液混合，杂化培养4h后，在GO组装的SPR芯片表面分别通入包含csDNA的AuNPs-ssDNA溶液，AuNPs-ssDNA溶液和包含有不匹配的msDNA的AuNPs-ssDNA溶液15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗芯片表面，分别测试SPR光谱曲线。参阅图4，样品溶液中存在碱基匹配的csDNA时，SPR曲线的共振角在GO和AuNPs-ssDNA 吸附后曲线的中间范围，如果检测的目标分子的碱基序列不匹配，即样品溶液中存在碱基匹配的csDNA时，SPR曲线的共振角在范围之外，基本原理示意图参阅图1。

[0050] 实施例六：检测不同浓度的碱基匹配csDNA试验中AuNPs的放大作用[0051] 分别在固定浓度的探针ssDNA溶液和探针AuNPs-ssDNA溶液中，加入不同浓度的-14 -6碱基匹配csDNA（10 -10 M），杂化培养4小时后，分别通入组装GO的SPR芯片表面15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗，测试SPR曲线。参阅图5（a），单纯利用探针ssDNA溶液作为-7 -6
抑制反应物的SPR曲线，共振角的明显变化是10 M和10 M，之后的低浓度的目标csDNA分子加入检测不到SPR共振角变化。但是，参阅图5（b），利用探针AuNPs-ssDNA溶液作为抑-14 -6
制反应物的SPR曲线，目标csDNA分子的浓度从10 M到10 M的SPR共振角度都有明显的变化。整理两组实验共振角的变化的柱状图参阅图6，探针AuNPs-ssDNA溶液作为抑制剂的-14 -6 -14
GO的SPR传感器，能够检测浓度范围在10 -10 M，最低检测极限为10 M。

[0052] 实施例七：本发明GO的SPR芯片的可再生性的验证

[0053] 参阅图7，在GO的SPR芯片表面通入探针AuNPs-ssDNA溶液后，测试SPR光谱，SPR共振角向右变化为0.11度，然后通入4M的尿素溶液30分钟，SPR共振角向左移动，再次重复通入探针AuNPs-ssDNA溶液15分钟，SPR共振角再次向右移动到0.11度。

[0054] 每次测试SPR曲线，都是在磷酸缓冲溶液环境中测试。