一种测定表面活性剂临界胶束浓度灵敏的荧光点亮探针法

摘要

本发明公开一种测定表面活性剂临界胶束浓度的方法。通过采用具有如式（Ⅰ）所示结构的聚集诱导发光有机物为荧光探针，并且根据该类有机物的特性，设计了一种新的测定表面活性剂临界胶束浓度的方法。所述方法通过探针荧光强度突变的最强点确定CMC，而其它报道的CMC荧光测定方法是通过探针荧光强度突变的最低点确定CMC。因此，本发明的CMC荧光测定方法比报道的CMC荧光测定方法具有更高的灵敏度。本发明所述的CMC荧光测定方法，在制备不同浓度表面活性剂检测液时，不需要将荧光探针的浓度维持在同一个水平上，大大简化了操作步骤，可以消除了由于多次量取荧光探针带来的误差。

权利要求

1.一种测定表面活性剂临界胶束浓度的方法，其特征在于，以具有如式（Ⅰ）所示结构的聚集诱导发光有机物为荧光探针，包括如下步骤：S1.将聚集诱导发光有机化合物配制成浓度为1~30 mM的储备液；

S2.在容量瓶中，加入一定量的表面活性剂，用稀释液溶解，再加入一定量的S1.制备得到的储备液，然后采用稀释液进行定容，使最终得到无荧光的定溶液；所述定溶液中，表面活性剂的浓度为2~30 mM；聚集诱导发光有机化合物的浓度为0.5~30 μM；

S3. 在15~35℃下取S2.制备得到的无荧光定溶液直接加入稀释液稀释至10倍以下，得到检测液，将检测液静置0~60 min后，测定其荧光强度，根据最大发射波长处荧光强度的变化作荧光强度随表面活性剂浓度变化的关系图，荧光强度最强点处对应的表面活性剂浓度即表面活性剂的临界胶束浓度;步骤S2.和步骤S3.中，所用稀释液为水、盐溶液或缓冲溶液；

（Ⅰ）

1

其中，R选自取代或非取代的C1~8烷基；

2 3 4

R、R、R各独立选自取代或非取代的C5~6芳香基、取代或非取代的C9~18稠环芳香基、取代或非取代的C5~6芳杂环基或取代的C5~6芳杂环基。

2.根据权利要求1所述测定表面活性剂临界胶束浓度的方法，其特征在于，步骤S3.为在15~35 ℃下取S2.制备得到的无荧光定溶液直接加入稀释液稀释至10倍以下，得到检测液，将检测液静置0~60 min后，测定其荧光强度，观测其最大发射波长处荧光强度的变化，当检测液的荧光强度发生由无到有的转变后，继续进行稀释检测，随着检测液浓度的稀释，荧光强度依次经历由无到强的上升区间和由强到弱的下降区间；在荧光强度上升区间和下降区间，分别以检测液浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标作图，分别得到荧光强度随表面活性剂浓度减少而增强的上升直线，和荧光强度随表面活性剂浓度减少而减弱的下降直线，两条直线的交汇点对应的表面活性剂浓度即表面活性剂的临界胶束浓度。

3.根据权利要求1所述测定表面活性剂临界胶束浓度的方法，其特征在于，步骤S1.中，将聚集诱导发光有机化合物溶于溶剂中配制成储备液，所述溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、水的一种或几种。

4.根据权利要求1所述测定表面活性剂临界胶束浓度的方法，其特征在于，所述盐溶液为含氯化钠、氯化钾、碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠、磷酸钾中的任意一种或几种的溶液；

所述缓冲溶液为含磷酸及其钾盐或钠盐、柠檬酸及其钾盐或钠盐、碳酸及其钾盐或钠盐、醋酸及其钾盐或钠盐、巴比妥酸及其钾盐或钠盐、三羟甲基氨基甲烷中的任意一种或几种的溶液。

1

5.根据权利要求1所述测定表面活性剂临界胶束浓度的方法，其特征在于，所述R 选自C1~2烷基。

2

6.根据权利要求1所述测定表面活性剂临界胶束浓度的方法，其特征在于，R 选自取代或非取代的C5~6芳香基。

3

7.根据权利要求1所述测定表面活性剂临界胶束浓度的方法，其特征在于，R 选自取代或非取代的C5~6芳香基。

4

8.根据权利要求1所述测定表面活性剂临界胶束浓度的方法，其特征在于，R 选自取代或非取代的C5~6芳香基。

9.根据权利要求1所述测定表面活性剂临界胶束浓度的方法，其特征在于，式（Ⅰ）中，1

R选自甲基或乙基；

2

R选自苯基，甲基苯基，氯苯基，溴苯基，三氟甲基苯基，萘基；

3

R选自苯基，溴苯基，甲氧基羟基取代的苯基，溴苯基，三氟甲基苯基，萘基，吡啶基，噻吩基；

4

R选自苯基，甲基苯基，氯苯基，溴苯基，三氟甲基苯基。

10.根据权利要求1所述测定表面活性剂临界胶束浓度的方法，其特征在于，所述表面活性剂为离子型表面活性剂。

说明书

一种测定表面活性剂临界胶束浓度灵敏的荧光点亮探针法

技术领域

[0001] 本发明涉及表面活性剂分析技术领域，具体涉及一种测定表面活性剂临界胶束浓度的方法。

背景技术

[0002] 表面活性剂具有多种特性，如润湿、乳化、发泡、溶解、分散、洗涤、耐腐蚀、抗静电等，被广泛应用于多种领域，如药物化学、合成化学、材料科学、生物学等。在一定的浓度下，即临界胶束浓度（critical micelle concentration, CMC）浓度下，表面活性剂开始形成热力学稳定的胶束，同时，各种性质发生显著的变化。因此，CMC的测定在实际应用中具有非常重要的意义，它是物理化学和分析化学研究的一个热点。目前发展的CMC测定方法是利用浓度达到CMC时表面活性剂溶液物理性质的突变来确定CMC值。通过荧光探针在浓度达到CMC时其荧光性质的突变来确定CMC值的方法具有操作简单、灵敏度高、成本低等优点，因此备受多种研究领域的关注。

[0003] CMC荧光测定法是基于有机荧光探针在浓度大于CMC的表面活性剂溶液中和在浓度小于CMC的表面活性剂溶液中具有明显不同的荧光性质。在浓度小于CMC时，表面活性剂常常以单体存在；在浓度等于CMC时，表面活性剂的单体开始形成胶束，形成的胶束和单体之间存在动态平衡。有胶束存在时，有机荧光探针趋向于优先溶解或包含在这些胶束的内部疏水区，并且显示出与在表面活性剂低浓度（浓度低于CMC）溶液中明显不同的荧光性质，如荧光强度、发射波长、发射光谱振动结构等性质。由于CMC荧光探针在胶束和在溶液中的荧光强度常常不同，因此，可根据荧光探针在胶束和在溶液中荧光强度的相对强弱，将荧光探针分为两大类， 即Ⅰ型和Ⅱ型探针。Ⅰ型探针为在胶束中的荧光强度比在溶液中的荧光强度强的探针，而Ⅱ型探针则为在胶束中的荧光强度比在溶液中的荧光强度弱的探针。图1示意性地解释了Ⅰ型和Ⅱ型探针通过荧光强度的突变确定CMC值的原理。图1a/1b显示，当表面活性剂浓度小于CMC时，Ⅰ型/Ⅱ型荧光探针存在于溶液中，此时的荧光强度为最低/最高；当表面活性剂浓度等于CMC时，胶束开始形成，荧光探针开始从溶液中转入胶束中，随着胶束的增加，Ⅰ型/Ⅱ型荧光探针荧光强度从最弱点/最强点（此时浓度为CMC，胶束开始形成）快速变化到最强/最弱（此时胶束浓度已增大到能够把几乎所有的探针包含到胶束中）。理想的Ⅰ型 /Ⅱ型荧光探针是其在溶液/胶束中没有荧光，但在胶束/溶液中有很强荧光的荧光化合物，即理想的I型和II型荧光探针分别是通过荧光关闭（fluorescence turn-off）和荧光点亮（fluorescence turn-on）的模式指示胶束的形成和拆卸以及测定CMC。从原理上来说，II型荧光探针的检测灵敏度比I高，因为荧光点亮测定模式的灵敏度比荧光关闭的灵敏度高。

[0004] 有机荧光化合物的荧光性质决定于其是适合用作Ⅰ型还是Ⅱ型探针。传统有机荧光化合物在稀溶液中有很好的发光性能，但在聚集态，尤其是在晶态时，荧光减弱甚至淬灭。这是由于随着荧光物质浓度的增加，荧光物质分子间的作用力增强，很容易形成同种分子间的激基缔合物（excimer）或者不同分子间的激基复合物（exciplex）而使其荧光强度降低（Nature, 1999, 397, 121-128; Science, 1994, 265, 765-768）。这种现象被称为“聚集产生的荧光淬灭效应”（aggregation-induced quenching, ACQ）。这类荧光化合物常常被用作Ⅰ型探针。因为这类荧光化合物可很好地溶于表面活性剂胶束（浓度>CMC时）中并具有很强的荧光，但在表面活性剂溶液（浓度5430-5435 ) 等应用领域，引起了人们广泛的兴趣。根据CMC荧光探针的检测机理，具有AIE特性的荧光化合物可以发展为理想的Ⅱ型CMC探针。但是，但目前为止，只有三篇报道是关于用AIE化合物测定CMC。其中两篇是将AIE化合物用作Ⅰ型探针(Science in China Series B: Chemistry 2009, 52, 755-759; Langmuir 2012, 28, 15725-15735)，因为这些AIE化合物在溶液中几乎没有荧光，而在胶束中聚集发光。另一篇文献(Analyst
2011, 136, 3343-3348)报道的AIE化合物是1,2-二苯基-1,2-二（4-甲基苯基）乙烯（1,2-diphenyl-1,2-di(p-tolyl)ethene, TPE)。TPE在胶束中荧光很弱，但在溶液中由于聚集发光，荧光增强，因此，TPE在溶液中的荧光信号被用来指示胶束的组装/拆卸过程。但该文献通过荧光强度突变最弱点(如图1b所示)，即把TPE被完全包裹在胶束中时的浓度确定为CMC，而不是通过荧光强度突变最强点来确定真正的CMC（胶束全部转变为单体时的浓度）。同时，该文献公开的TPE必须在非常低的浓度（0.5 μM）下使用，否则会影响胶束的形成，这就降低了TPE测定CMC的灵敏度。

[0005] 到目前为止，并未找到一种化合物作为理想的Ⅱ型探针。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种测定表面活性剂临界胶束浓度的灵敏的荧光点亮探针法。该方法利用一种具有聚集诱导发光特性的五取代四氢嘧啶化合物作为荧光探针，该类化合物在胶束中完全没有荧光，在溶液中却发出很强的荧光，是理想的CMC荧光点亮探针（Ⅱ型荧光探针），因此可以通过该化合物在溶液中的荧光信号变化指示胶束的拆卸过程，从而测定CMC，即通过无荧光（探针全部被包括在胶束中）到荧光最强（胶束全部转变成单体，探针全部被释放到溶液中）的荧光强度突变过程来指示胶束拆卸的过程，此过程是荧光点亮（turn-off）的过程，是检测灵敏度很高的过程，荧光突变最强点即CMC。所述方法还具有操作简单、快速的特点。

[0007] 本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：

[0008] 一种测定表面活性剂临界胶束浓度灵敏的荧光点亮探针法，以具有如式（Ⅰ）所示结构的聚集诱导发光有机物为荧光探针，包括如下步骤：

[0009] S1.将聚集诱导发光有机化合物配制成浓度为1~30mM的储备液；

[0010] S2.在容量瓶中，加入一定量的表面活性剂，以稀释液溶解，再加入一定量的S1.制备得到的储备液，然后采用稀释液进行定容，使最终得到无荧光的定溶液；所述定溶液中，表面活性剂的浓度为2~30mM；聚集诱导发光有机化合物的浓度为0.5~30μM；

[0011] S3. 在15~35℃下取S2.制备得到的无荧光定溶液直接加入稀释液稀释至10倍以下，得到检测液，将检测液静置0~60min后，测定其荧光强度，根据最大发射波长处荧光强度的变化作荧光强度随表面活性剂浓度变化的关系图，荧光强度最强点处对应的表面活性剂浓度即表面活性剂的临界胶束浓度;

[0012] 步骤S2.和步骤S3.中，所用稀释液为水、盐溶液或缓冲溶液；

[0013]

[0014] （Ⅰ）

[0015] 其中，R1选自取代或非取代的C1~8烷基；

[0016] R2、R3、R4各独立选自取代或非取代的C5~6芳香基、取代或非取代的C9~18稠环芳香基、取代或非取代的C5~6芳杂环基或取代的C5~6芳杂环基。

[0017] 作为一种可选方案，步骤S3.可选为在15~35℃下取S2.制备得到的无荧光定溶液直接加入稀释液稀释至10倍以下，得到检测液，将检测液静置0~60min后，测定其荧光强度，观测其最大发射波长处荧光强度的变化，当检测液的荧光强度发生由无到有的转变后，继续进行稀释检测，随着检测液浓度的稀释，荧光强度依次经历由无到强的上升区间和由强到弱的下降区间；在荧光强度上升区间和下降区间，分别以检测液浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标作图，分别得到荧光强度随表面活性剂浓度减少而增强的上升直线，和荧光强度随表面活性剂浓度减少而减弱的下降直线，两条直线的交汇点对应的表面活性剂浓度即表面活性剂的临界胶束浓度。

[0018] 从理论上分析，上述荧光强度随表面活性剂浓度减少而增强的上升区间即表面活性剂浓度大于临界胶束浓度的区间；上述荧光强度随表面活性剂浓度减少而减弱的下降区间即表面活性剂浓度小于临界胶束浓度的区间。

[0019] 作为一种可选方案，步骤S3. 还可以在15~35 ℃下取1~10 mL S2.制备得到的无荧光定溶液，分别加入11个容量瓶中，加入稀释液稀释至刻度，得到11个分别稀释了0倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍稀释浓度梯度的检测液（稀释浓度的选择可以由本领域技术人员根据需要进行调整），将检测液静置0~60 min后，分别测定11个检测液荧光强度，分析最大发射波长处荧光强度随表面活性剂浓度变化的线性关系，随着表面活性剂浓度的降低，荧光强度依次经历由无到强的上升区间和由强到弱的下降区间，确保上升区间和下降区间有足够的对象求取线性关系，如果没有，则在两个浓度之间继续制备检测液，直到上升区间和下降区间有足够的对象求取线性关系为止。

[0020] 在荧光强度上升区间和下降区间，分别以检测液浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标作图，分别得到荧光强度随表面活性剂浓度减少而增强的上升直线，和荧光强度随表面活性剂浓度减少而减弱的下降直线，两条直线的交汇点对应的表面活性剂浓度即表面活性剂的临界胶束浓度。

[0021] 作为一种优选方案，步骤S1.中，将聚集诱导发光有机化合物溶于溶剂中配制成储备液，所述溶剂优选为甲醇、乙醇、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、水的一种或几种。

[0022] 作为一种优选方案，步骤S2.中，所述聚集诱导发光有机化合物的浓度优选为2~30μM。

[0023] 作为一种优选方案，所述盐溶液优选为含氯化钠、氯化钾、碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠、磷酸钾中的任意一种或几种的溶液；

[0024] 所述缓冲溶液优选为含磷酸及其钾盐或钠盐、柠檬酸及其钾盐或钠盐、碳酸及其钾盐或钠盐、醋酸及其钾盐或钠盐、巴比妥酸及其钾盐或钠盐、三羟甲基氨基甲烷中的任意一种或几种的溶液。

[0025] 作为一种优选方案，所述R1选自C1~2烷基。

[0026] 作为一种优选方案，R2选自取代或非取代的C5~6芳香基。

[0027] 作为一种优选方案，R3选自取代或非取代的C5~6芳香基。

[0028] 作为一种优选方案，R4选自取代或非取代的C5~6芳香基。

[0029] 作为一种更优选方案，式（Ⅰ）中，

[0030] R1选自甲基或乙基；

[0031] R2选自苯基，甲基苯基，氯苯基，溴苯基，三氟甲基苯基，萘基；

[0032] R3选自苯基，溴苯基，甲氧基羟基取代的苯基，溴苯基，三氟甲基苯基，萘基，吡啶基，噻吩基；

[0033] R4选自苯基，甲基苯基，氯苯基，溴苯基，三氟甲基苯基。

[0034] 作为一种优选方案，所述表面活性剂优选为离子型表面活性剂。

[0035] 作为一种优选方案，所述表面活性剂优选为阴离子型表面活性剂或阳离子型表面活性剂。

[0036] 本发明涉及的CMC荧光测定方法，其测定原理不同于已报道的CMC荧光测定方法。该CMC荧光测定法是通过探针在溶液中的荧光信号变化来指示胶束的拆卸过程，以荧光强度突变的最强点来确定CMC，即通过荧光点亮模式测定CMC, 而其它报道的CMC荧光测定法是通过探针在胶束中的荧光信号变化来指示胶束的形成/拆卸过程，以荧光强度突变的最弱点来确定CMC，即通过荧光关闭模式测定CMC,。因此，本发明提供的CMC荧光测定法比报道的方法具有更高的灵敏度。

[0037] 本发明所设计的检测方法，也与现有的CMC荧光测定方法不同。现有的CMC荧光测定方法，在制备检测液时，都需要在稀释表面活性剂浓度的同时将荧光探针的浓度维持在一个水平上，而本发明所用的聚集诱导发光有机化合物作为荧光探针时使用现有的方法，无法获得良好的线性关系，也无法准确测量CMC。本发明突破性的同时稀释荧光探针和表面活性剂的浓度，寻找到了荧光强度随表面活性剂浓度变化的直线关系，从而准确地判断出表面活性剂的CMC。

[0038] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0039] （1）本发明所述的CMC荧光测定方法，是根据聚集诱导发光有机化合物的特性而建立的，是通过探针荧光强度突变的最强点确定CMC，而其它报道的CMC荧光测定方法是通过探针荧光强度突变的最低点确定CMC。因此，本发明的CMC荧光测定方法比报道的CMC荧光测定方法具有更高的灵敏度。

[0040] （2）现有的CMC荧光测定方法，在制备不同浓度表面活性剂检测液时，都需荧光探针的浓度维持在同一个水平上，因此在制备检测液时，要么需要在每个检测液中分别加入相同量的荧光探针，要么需要在稀释含有探针的表面活性剂浓溶液时加入相应量的荧光探针，本发明所述的CMC荧光测定方法，在制备不同浓度表面活性剂检测液时，不需要将荧光探针的浓度维持在同一个水平上，因此可以直接用稀释剂稀释含有探针的表面活性剂浓溶液配制，而无须加入相应量的荧光探针，因此，本方法不仅大大简化了操作步骤，还消除了由于多次量取荧光探针带来的误差。

附图说明

[0041] 图1为Ⅰ型和Ⅱ型荧光探针测定CMC的原理示意图；

[0042] 图2为本发明提供的CMC测定方法确定CMC的原理示意图；

[0043] 图3为实施例1中化合物1在不同浓度阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠溶液中的激发和发射光谱图；

[0044] 图4为实施例1中化合物1在不同浓度阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠溶液中最大发射波长处的荧光强度与十二烷基硫酸钠浓度的关系及确定CMC测定值的坐标图；

[0045] 图5为实施例2中化合物2在不同浓度阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠溶液中的激发和发射光谱图；

[0046] 图6为实施例2中化合物2在不同浓度阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠溶液中最大发射波长处的荧光强度与十二烷基硫酸钠浓度的关系及确定CMC测定值的坐标图；

[0047] 图7为实施例3中化合物3在不同浓度阳离子表面活性剂溴化三甲基十六烷基铵溶液中的激发和发射光谱图；

[0048] 图8为实施例3中化合物3在不同浓度阳离子表面活性剂溴化三甲基十六烷基铵溶液中最大发射波长处的荧光强度与溴化三甲基十六烷基铵浓度的关系及确定CMC测定值的坐标图；

[0049] 图9为实施例27中化合物13在不同浓度两性离子表面活性剂3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸内盐溶液中的激发和发射光谱图；

[0050] 图10为实施例27中化合物13在不同浓度两性离子表面活性剂3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸内盐溶液中最大发射波长处的荧光强度与3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸内盐浓度的关系及确定CMC测定值的坐标图；

[0051] 图11为对比例1中化合物13测定阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠CMC的激发和发射光谱图；

[0052] 图12为对比例1中化合物13测定阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠CMC的在最大发射波长处的荧光强度与十二烷基硫酸钠CMC浓度的关系及确定CMC测定值的坐标图；

[0053] 图13为对比例2中化合物13在不同浓度阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠溶液中的激发和发射光谱图；

[0054] 图14为对比例2中化合物13在不同浓度阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠溶液中最大发射波长处的荧光强度与十二烷基硫酸钠浓度的关系及确定CMC测定值的坐标图。

具体实施方式

[0055] 以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

[0056] 实施例1

[0057] S1. 将1,2,3-三苯基-1,2,3,6-四氢嘧 啶-4,5-二甲酸甲酯（dimthyl1,2,3,6-tetrahydro-1,2,3-triphenylpyrimidine-4,5-dicarboxylate, 化合物1）用乙醇配制成浓度为1 mM的储备液。

[0058]

[0059] 化合物1

[0060] S2. 在100mL的容量瓶中，加入288 mg 十二烷基硫酸钠（SDS），加双蒸水至样品溶解，再加入0.6 mL 由S1.制备得到的储备液，然后采用双蒸水进行定容，使得到无荧光的定溶液，定溶液中，SDS的浓度为10 mM，化合物1的浓度为6μM的溶液。

[0061] S3. 将S2.制备得到的无荧光定溶液配制成用于荧光及SDS临界胶束浓度（critical micelle concentration, CMC）测定的不同浓度SDS样品液。具体步骤如下：

[0062] 25℃下, 按表1分别取不同体积的按步骤S2.配制的定溶液于11个10 mL容量瓶中，加双蒸水至各容量瓶的刻度线，摇匀后立即测定11个样品在的激发和荧光光谱(分别以最大发射和激发波长测激发和发射光谱)，如图3所示，可以看出，化合物1的最大发射波长在478nm,并且在最大发射波长处，当SDS浓度为10~6.2mM之间，荧光强度呈上升趋势，浓度在6.2~3mM之间，荧光强度呈下降趋势。

[0063] 表1

[0064]

[0065] 由此可以初步推断，SDS的临界胶束浓度在6~6.4 mM之间。

[0066] 以图3中最大发射波长处的荧光强度与对应的SDS浓度作图，并在荧光强度上升区间及荧光强度下降区间分别求取线性关系，得到两条斜率相反的直线，如图4所示。两条直线相交的最高点为用化合物1测定的SDS精确CMC值。由计算可以知道此实施例以化合物1测定的SDS的精确CMC值为6.32 mM。

[0067] 实施例2

[0068] S1. 将2-苯基-1,3-二(4-溴苯基)-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸甲酯（dimethyl 1,3-bis(4-bromophenyl)-1,2,3,6-tetrahydro-2-phenylpyrimidine-4,5-dicarboxylate, 化合物2）用乙醇配制成浓度为1 mM的储备液。

[0069]

[0070] 化合物2

[0071] S2. 在100mL的容量瓶中，加入576 mg 十二烷基硫酸钠（SDS），加双蒸水至样品溶解，再加入1.2 mL 由S1.制备得到的储备液，然后采用双蒸水进行定容，使得到无荧光的定溶液，定溶液中，SDS的浓度为20 mM，化合物2的浓度为12μM的溶液。

[0072] S3. 将S2.制备得到的无荧光定溶液配制成用于荧光及SDS临界胶束浓度（critical micelle concentration, CMC）测定的不同浓度SDS样品液。具体步骤如下：

[0073] 27℃下, 按表2分别取不同体积的按步骤S2.配制的定溶液于11个10 mL容量瓶中，加双蒸水至各容量瓶的刻度线，摇匀后立即测定13个样品在的激发和荧光光谱(分别以最大发射和激发波长测激发和发射光谱)，如图5所示，可以看出，化合物2的最大发射波长在479nm,并且在最大发射波长处，当SDS浓度为20~6.6 mM之间，荧光强度呈上升趋势，浓度在6.6~3 mM之间，荧光强度呈下降趋势。

[0074] 表2

[0075]

[0076] 由此可以初步推断，SDS的临界胶束浓度在6.4~6.8 mM之间。

[0077] 以图5中最大发射波长处的荧光强度与对应的SDS浓度作图，并在荧光强度上升区间及荧光强度下降区间分别求取线性关系，得到两条斜率相反的直线，如图6所示。两条直线相交的最高点为用化合物2测定的SDS精确CMC值。由计算可以知道此实施例以化合物2测定的SDS的精确CMC值为6.77 mM。

[0078] 实施例3

[0079] S1. 将2-苯基-1,3-二对甲苯基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸甲酯（dimethyl 1,2,3,6-tetrahydro-2-phenyl-1,3-dip-tolylpyrimidine-4,5- dicarboxylate, 化合物3）用四氢呋喃配制成浓度为1 mM的储备液。

[0080]

[0081] 化合物3

[0082] S2. 在100mL的容量瓶中，加入72.8 mg 溴化十六烷基三甲铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB），加双蒸水至样品溶解，再加入1 mL S1.制备得到的储备液，然后采用双蒸水进行定容，使得到无荧光的定溶液，定溶液中，CTAB的浓度为2 mM，化合物3的浓度为10μM的溶液。

[0083] S3. 将S2.制备得到的无荧光定溶液配制用于荧光及CTAB临界胶束浓度（critical micelle concentration, CMC）测定的不同浓度CTAB样品液。具体步骤如下：

[0084] 按表3分别取不同体积的按步骤S2.配制的定溶液于12个10 mL容量瓶中，加双蒸水至各容量瓶的刻度线，摇匀后，在23℃下静置30min，测定12个样品的激发和荧光光谱(分别以最大发射和激发波长测激发和发射光谱)，如图7所示，可以看出，化合物3的最大发射波长在490nm,并且在最大发射波长处，当CTAB浓度为2~0.8 mM之间，荧光强度呈上升趋势，浓度在0.8~0.2 mM之间，荧光强度呈下降趋势。

[0085] 表3

[0086]

[0087] 由此可以初步推断，CTAB的临界胶束浓度在0.7~0.84 mM之间。

[0088] 以图7中最大发射波长处的荧光强度与对应的CTAB浓度作图，并在荧光强度上升区间及荧光强度下降区间分别求取线性关系，得到两条斜率相反的直线，如图8所示。两条直线相交的最高点为用化合物3测定的CTAB精确CMC值。由计算可以知道此实施例以化合物3测定的CTAB的精确CMC值为0.80mM。

[0089] 实施例4~14

[0090] 实施例4~14测定阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）临界胶束浓度（CMC）的方法同实施例1，仅将实施例1中聚集诱导发光的五取代四氢嘧啶化合物1换成相应的式（Ⅰ）的其它化合物3~13。表4列出了化合物1~13的结构、及其测定阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）的临界胶束浓度（CMC）以及测定最大发射波长、激发波长、定溶液中化合物浓度、静置时间、测定温度。

[0091]

[0092] （Ⅰ）

[0093] 表4

[0094]

[0095] 化合物5的结构数据如下：

[0096] 1,3- 二 苯 基 -2-(4- 吡 啶 基 )-1,2,3,6- 四 氢 嘧 啶 -4,5- 二 甲 酸甲 酯（dimethyl 1,2,3,6-tetrahydro-1,3-diphenyl-2-(pyridin-4-yl)pyrimidine-4,5-dicarboxylate）。

[0097] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.70 – 6.96 (m, 14H), 6.16 (s, 1H), 4.31 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 3.69 (s, 3H), 3.68 (s, 3H), 3.63 (d, J = 17.6 Hz, 1H)；13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.80, 164.80, 149.41, 144.93, 144.29, 138.23, 129.30,129.15, 129.05, 128.36, 126.89, 126.05, 124.00, 121.51, 118.95, 101.32,
52.50, 51.39, 42.49.

[0098] 化合物6的结构数据如下：

[0099] 1,3- 二 苯 基 -2-(2- 噻 吩 基 )-1,2,3,6- 四 氢 嘧 啶 -4,5- 二 甲 酸甲 酯（dimethyl 1,2,3,6-tetrahydro-1,3-diphenyl-2-(thiophen-2-yl)pyrimidine-4,5-dicarboxylate）。

[0100] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 ~6.97 (m, 13H), 6.30 (s, 1H), 4.34 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 3.89 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.66 (s, 3H); MS + + + + 13(ESI): m/z 435(M H, 100), 436(M H, 26)；C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.71,
164.69, 148.49, 144.23, 143.91, 142.15, 129.32, 129.21, 127.08, 126.61,
126.46, 126.27, 124.17, 121.87, 119.06, 102.03, 52.52, 51.49, 42.66.[0101] 化合物11的结构数据如下：

[0102] 1,2,3-三（4-溴苯基)-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸甲酯（dimethyl1,2,3-tris(4-bromophenyl)-1,2,3,6-tetrahydropyrimidine-4,5-dicarboxylate）。

[0103] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.77 –6.76 (m, 12H), 5.96 (s, 1H), 4.21(d, J = 19.2 Hz, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.55 (d, J = 18.4 Hz, 1H); MS + + + + 13(ESI): m/z 665(M H, 100), 667(M H, 97)；C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.27,
164.38, 148.10, 143.80, 143.10, 136.51, 132.49, 132.44, 132.31, 128.55,
125.04, 122.87, 120.67, 119.64, 114.36, 102.89, 79.48, 52.79, 51.64, 42.55.[0104] 实施例15~26

[0105] 实施例15~26测定阳离子表面活性剂十六烷基三甲铵（CTAB）临界胶束浓度（CMC）的方法同实施例3，仅将实施例3中聚集诱导发光的五取代四氢嘧啶化合物2换成相应的式（Ⅰ）的其它化合物1~2和4~13。表5列出了化合物1~13的结构、及其测定阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲铵（CTAB）的临界胶束浓度（CMC）以及测定最大发射波长、激发波长、定溶液中化合物浓度、静置时间、测定温度。

[0106]

[0107] （Ⅰ）

[0108] 表5

[0109]

[0110] 实施例27

[0111] S1. 将1,2,3-三苯基-1,2,3,6-四氢嘧 啶-4,5-二甲酸乙酯（diethyl1,2,3,6-tetrahydro-1,2,3-triphenylpyrimidine-4,5-dicarboxylate, 化合物13）用乙醇配制成浓度为1 mM的储备液。

[0112]

[0113] 化合物13

[0114] S2. 在100mL的容量瓶中，加入615 mg 3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸内盐（CHAPS, 分子量614.88），加双蒸水至样品溶解，再加入1 mL 由S1.制备得到的储备液，然后采用双蒸水进行定容，使得到无荧光的定溶液，定溶液中，CHAPS的浓度为10 mM，化合物13的浓度为10μM的溶液。

[0115] S3. 将S2.制备得到的无荧光定溶液配制成用于荧光及CHAPS临界胶束浓度（critical micelle concentration, CMC）测定的不同浓度CHAPS样品液。具体步骤如下：

[0116] 25℃下, 按表2分别取不同体积的按步骤S2.配制的定溶液于11个10 mL容量瓶中，加双蒸水至各容量瓶的刻度线，摇匀后立即测定13个样品在的激发和荧光光谱(分别以最大发射和激发波长测激发和发射光谱)，如图9所示，可以看出，化合物13的最大发射波长在484nm,并且在最大发射波长处，当CHAPS浓度为10~7.8 mM之间，荧光强度呈上升趋势，浓度在7.5~3 mM之间，荧光强度呈下降趋势。

[0117] 表6

[0118]

[0119] 由此可以初步推断，CHAPS的临界胶束浓度在7.5~7.8 mM之间。

[0120] 以图9中最大发射波长处的荧光强度与对应的CHAPS浓度作图，并在荧光强度上升区间及荧光强度下降区间分别求取线性关系，得到两条斜率相反的直线，如图10所示。两条直线相交的最高点为用化合物13测定的CHAPS精确CMC值。由计算可以知道此实施例以化合物13测定的CHAPS的精确CMC值为7.55 mM。

[0121] 从表4，表5和实施例27测定的表面活性剂临界胶束浓度结果可以看出，采用本发明提供的表面活性剂临界胶束浓度的测定方法，及本发明所述的式（Ⅰ）化合物既可用作阴离子表面活性剂（如十二烷基硫酸钠，SDS）临界胶束浓度的荧光探针和阳离子表面活性剂（如溴化十六烷基三甲铵，CTAB）临界胶束浓度的荧光探针，又可用作两性离子表面活性剂（如3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸内盐，CHAPS）的荧光探针。文献报道的SDS的CMC值为6.02~8.5 mM (Journal of the American Chemical Society 1947,69, 679–683；Analytical Chemistry 1998, 70, 4212-4217；Chemical Communs 2011,
47, 5527-5529)，CTAB的CMC值为0.80~0.92 mM (Journal of the American Chemical Society 1947, 69, 679–683；Journal of the American Chemical Society 1977；99,
2039-2044, Langmuir1990, 6, 1078-1083；Chemical Communs 2011, 47, 5527-5529)。
用化合物1~13测定的阴离子和阳离子表面活性剂SDS和CTAB的CMC值除化合物1测定CTAB的CMC值稍微低于文献报道值外，其它全部与文献符合。化合物13测定的CHAPS的CMC（7.55）在文献报道的范围内(7.4~10 mM，Analytical Biochemistry 1984, 139,
408-412；Analytical Biochemistry 1983, 130, 72-82)。作为对照，我们采用文献报道的方法（Journal of the American Chemical Society 1977, 99, 2039-2044; Chemical Communs 2011, 47, 5527-5529）用芘作为荧光探针测定了SDS，CTAB和CHAPS的CMC，测定值分别为6.32, 0.88和7.52 mM。 6.32 mM与表4中化合物1测定结果完全一致，0.88 mM表5中化合物11和12测定结果基本一致，7.52 mM与实施例27中化合物13测定的结果基本一致。

[0122] 文献报道的CMC荧光探针，均为通过荧光最弱处的突变点来确定CMC值，即均为荧光关闭探针。本发明提供的CMC荧光探针是通过荧光最强处的突变点来确定CMC值，是荧光点亮探针，比荧光关闭探针具有更高的灵敏度。另外，本发明提供的荧光点亮探针测定方法是根据本发明提供的根据聚集诱导发光特性建立的方法，不同于已报道的方法，具有操作简单、速度快、灵敏度高的特点。

[0123] 对比例1

[0124] 将化合物13配制成1mM乙醇储备液，按现有的方法(Analytical Biochemistry1984, 139 (2), 408-412, Inorganica Chimica Acta 2012, 381 (0), 181-187, Analyst 2011, 136 (16), 3343-3348, The Journal of Physical Chemistry B 2007,
111 (45), 12985-12992) 将十二烷基硫酸钠 （SDS）配成10 mM浓溶液，25℃下，按表7先加入不同体积的SDS浓溶液于11个不同的容量瓶中，再在各个容量瓶中加入100 μL化合物13储备液，用双蒸水稀释至刻度，得11个含10 μM化合物13的不同浓度表面活性检测液，放置30min后，进行荧光测定，测得的激发及发射光谱图见图11，可以看出化合物13的最大发射波长为484 nm。

[0125] 表7

[0126]

[0127] 以图11中最大发射波长处的荧光强度与对应的SDS浓度作图12，如图12所示，荧光强度与SDS浓度之间不存在好的线性关系，因此无法用化合物的荧光变化测定SDS的CMC值。

[0128] 对比例2

[0129] 将化合物13配制成1mM的乙醇储备液，按现有的方法 (Journal of the American Chemical Society 1947, 69 (3), 679–683, Analytical Biochemistry 2011, 408 (1), 64-70) 制备含10 μM化合物13的十二烷基硫酸钠 （SDS）10 mM浓溶液，25℃下，按表8取不同体积的SDS浓溶液于11个不同的容量瓶中，再在各个容量瓶中加入不同体积的化合物13储备液以保持各容量瓶中的浓度一致，用双蒸水稀释至刻度，得11个含10 μM化合物13的不同浓度表面活性检测液，放置30min后，进行荧光测定，测得的激发及发射光谱图见图13，可以看出化合物13的最大发射波长为484 nm。

[0130] 表8

[0131]

[0132] 以图13中最大发射波长处的荧光强度与对应的SDS浓度作图14，如图14所示，荧光强度与SDS浓度之间不存在好的线性关系，因此无法用化合物的荧光变化测定SDS的CMC值。