用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灰树花多糖的菌株

摘要

本发明属于微生物应用技术和食品生物技术领域，公开了用米糠麸皮全料液态培养基生产多糖的灰树花菌株。灰树花Grifola sp.JSU1301已于2013年6月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为CCTCC M2013286，名称为一种灰树花Grifola sp.CCTCC M2013286。本发明通过附图紫外诱变方法，由Grifola sp.CCTCC M2011113出发得到能高产多糖的所述新菌株。该新菌株在米糠麸皮全料液态新培养基中快速发酵并高产多糖，摇瓶发酵和的菌丝干重和菌丝多糖产率较出发菌株增加了16.8％、8.57％，上罐发酵增加30.9％、29.7％，为目前最高水平。

权利要求

1.用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灰树花多糖的菌株，其特征在于，保藏于武汉中国典型培养物保藏中心的灰树花JSU1301(Grifola sp.JSU1301)，保藏号为CCTCC M2013286。

说明书

用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灰树花多糖的菌株

技术领域

[0001] 本发明涉及食品微生物应用技术领域，尤其涉及一株适合在米糠和麸皮全料复合液态培养基中生长并高产灰树花多糖的灰树花菌株的新诱变菌株。

背景技术

[0002] 自从Chihara等人(参考文献：Chihara G，Maeda Y，Hamuro J，et al.Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes(Berk.)sing[J].Nature，1969，222(5194)：687-688.)于1969年在《Nature》上发表论文，揭示香菇多糖具有抗肿瘤活性以来，已经发现具有抗肿瘤活性的药用真菌达两百多种，其中一部分还是食用真菌，如灰树花、猴头菌、灵芝等。这些食用菌的菌丝体、子实体、菌核或孢子中能产生诸如氨基酸、蛋白质、维生素、多糖、苷类、黄酮类及抗生素等多种活性成分或富集微量元素硒、锌等，具有提高人体免疫力、抗肿瘤、增强肝功能、抗氧化等多种功效。国内市场已有食用菌保健食品如灵芝胶囊、灰树花胶囊及冬虫夏草胶囊等在热销。国际上新西兰、日本、美国等均产有类似的产品。就灰树花多糖而言，针对灰树花多糖的研究表明：灰树花的多糖具有较好的调节免疫力、辅助抗肿瘤治疗、治疗肝炎、延缓衰老功能等的功效(参考文献：①Shi Baojun，Nie Xiaohua，Chen Lizhi，et al.Anticancer activities of a chemically sulfated polysaccharide obtained from Grifola frondosa and its combination with 5-Fluorouracil against human gastric carcinoma cells[J].Carbohydrate Polymers 2007，68687-692.②Nono I，N Ohno，M Ohsawa，et al.Modification of immunostimulating activities of grifolan by the treatment with(1--3)-beta-D-glucanase[J].Journal of pharmacobio-dynamics，1989，12(11)：671；③ Gu Changqing，Li Junwen，Chao Fuhuan.Inhibition of hepatitis B virus by D-fraction from Grifola frondosa：Synergistic effect of combination with interferon-in HepG2 2.2.15[J].Antiviral Research 2006，72：162-165.)。

[0003] 灰树花(Grifola frondosa)属于担子菌亚门，层菌纲，无革担子菌亚纲，非褶菌目，多孔菌科，树花属。国内灰树花已在一些省份如河北、浙江、福建等省得到栽培，用于鲜食或提取功能成分，具有良好的经济效益。目前，常见的灰树花生产技术有固态培养和液态培养。固态培养的优点是可以使用木屑、农产品加工副产品作为培养基，子实体用作蔬菜或药材原料等，缺点是占用一定的土地，生产周期相对较长，受气候限制。液态培养可用于生产灰树花多糖等产品，具有 工厂化生产，发酵周期短、产量可调、质量可控等优点。

[0004] 1986年Ohno N等研究了灰树花液态培养方法。国内原江苏理工大学现江苏大学的朱建华教授等在1996年研制成功气升式食用菌液态培养罐。1999年江苏理工大学的汪维云的博士论文研究了灰树花液体深层发酵培养及微量元素的富集作用。2000年江南大学陈石良的博士论文则研究了灰树花深层发酵技术及灰树花的抗肿瘤多糖(参考文献：①汪维云.灰树花液体深层发酵培养及微量元素的富集作用研究[D].博士学位论文.镇江：江苏理工大学，1999.②陈石良.药用真菌灰树花深层发酵技术及其抗肿瘤多糖的研究[D].博士学位论文.无锡：江南大学，2000)。

[0005] 上述研究的内容主要涉及培养基配制、培养工艺、适宜菌种选育和产品的功能等。常见工艺的碳源优先大量选用葡萄糖或粮食类原料如淀粉、玉米、马铃薯等，而农副产品如米糠或麸皮可作为次要成分加入。米糠、麸皮是谷物加工过程的副产物，它们富含淀粉、蛋白质、纤维素、矿物质等多种营养成分，而且在我国产量大、价格低廉。米糠、麸皮富含等。灰树花自身产纤维素酶及其他酶，可将米糠和麸皮转化成自身的营养物质进行生长代谢，生产具有辅助肿瘤治疗等功能的灰树花多糖。为了高值化转化米糠和麸皮为保健食品，主要使用米糠和麸皮作为培养基成分，将米糠和麸皮加水后不过滤即米糠麸皮全料呈液态状发酵，就需要有适性的灰树花菌种，但市场的灰树花菌种在不添加葡萄糖或其他粮食类原料的米糠麸皮全料液态培养基上生长状态不佳，菌丝和菌丝多糖产量低，需要得到发酵此种培养基的灰树花新菌株。

[0006] 本专利发明人刘伟民近十年来指导课题组多名研究生对此问题进行了连续的研究，分阶段取得了创新成果，并正在深化该问题的研究。首先对原始的灰树花菌种在米糠培养基上液体发酵产灰树花多糖的可能性进行过研究，发现尽管对菌株也进行过初步紫外诱变的处理，如不添加较大量的葡萄糖，灰树花在米糠培养基上发酵不理想，所以刘伟民所指导的杨锁华和顾慧敏的硕士论文研究中，仍添加了较多的葡萄糖，故而只以农产品加工副产品为原料生产灰树花多糖以降低成本的设想并没有能得到真正的实现。随后，刘伟民指导的张建和郭春梅的硕士论文研究，利用多种复合诱变成功筛选出了在米糠麸皮过滤取汁培养基上或经纤维素酶酶解后再取汁的液体培养基上能快速生长的优势菌，分别为Grifola sp. CGMCC4179和Grifola sp.CCTCC M2011113，后者由前者再诱变而得，两株菌株均提交了发明专利申请，其中Grifola sp.CGMCC4179已经授权。因为培养基由米糠、麸皮进行取汁或酶解后取汁形成，米糠和麸皮的利用率仍有待继续提高，即仍需要深入的发明创造，得到利用米糠麸皮全料液态培养基的灰树花菌株。虽然郭春梅的硕士论文初步涉及了Grifola sp.CGMCC4179和Grifola sp.CCTCC M2011113两株菌对添加纤维素酶的米糠麸皮全料液态培养基的转化利用问题，但其研究结论是发酵效果不太理想，此问题并没有得到解决(见郭春梅硕士论文p57)。

[0007] 2011年刘伟民指导硕士研究生李永转，试图解决米糠麸皮全料液体发酵利用问题，试验了从Grifola sp.CCTCC M2011113出发，再次紫外诱变，但筛选菌株所用的培养基为置于培养皿中的加了琼脂呈固态的米糠和麸皮全料培养基(硕士论文p17米糠麸皮筛选培养基中加了琼脂)，试验时因为菌种诱变效果不显著，无法用米糠和麸皮全料液态摇瓶发酵进行诱变效果的评价，而改用米糠麸皮过滤取汁的发酵培养基进行发酵评价(硕士论文p17发酵培养基，与张建和郭春梅的试验相似)，走到了米糠麸皮取汁使用的旧路上。后来李永转为完成硕士论文，只能用刘伟民课题组张建所得到的菌种UVW-1(即Grifola sp.CGMCC4179)和Grifola sp.UVW-5进行米糠和麸皮全料液态发酵的初步研究。很显然李永转没有得到本发明专利所希望的用米糠麸皮全料进行液态发酵的新菌种及使用该新菌种进行米糠麸皮全料液态发酵的方法。据上所述，郭春梅和李永转都没有得到高效利用米糠麸皮全料液态培养基的灰树花新菌株。诱变得到新菌株的工作仍需要继续深入开展。

[0008] 正因为如此，2012年至今，刘伟民又指导了课题组硕士研究生李亚楠反复试验，进行了Grifola sp.CCTCC M2011113的多次紫外诱变处理，得到了效果较好的新菌株灰树花Grifola sp.JSU1301，并利用新得到的灰树花菌株，进行米糠和麸皮全料液态发酵的深入研究，得到了发明创造的成果，形成本发明专利内容。(参考文献见：杨锁华.灰树花发酵米糠制备多糖[D].硕士学位论文.镇江：江苏大学.2006；顾慧敏.灰树花在米糠培养基中液态培养产多糖和富集有机硒的研究[D].硕士学位论文.镇江：江苏大学.2009；张建.物理法诱变灰树花液体发酵米糠麸皮产多糖的研究[D].硕士学位论文.镇江：江苏大学，2010；郭春梅.灰树花的菌种诱变、液体发酵米糠麸皮产多糖及富硒研究[D].硕士学位论文.镇江：江苏大 学，2011；李永转.转化米糠和麸皮高产多糖的灰树花菌株诱变和已有菌的发酵试验[D].硕士学位论文.镇江：江苏大学，2012；刘伟民，张建，郭春梅，等.用于米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株[P]，10579078.5，2010；刘伟民，张建，郭春梅，等.使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法[P]，1010579048.4，2010；刘伟民，郭春梅，张建，等.用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株[P]，
10150888.3，2011(申请)；李亚楠.灰树花菌种诱变及发酵和产物性能研究[D].硕士学位论文.镇江：江苏大学，2013(该论文公开日期为2013年6月，与本专利的申请提交年月相同。经刘伟民和李亚楠校核，李亚楠的诱变出发菌株为Grffola sp.CCTCC M2011113，李亚楠硕士论文中出发菌株写成Grifola sp.CGMCC4179系李亚楠写作时对编号理解错误而产生的笔误。李亚楠十分确定从郭春梅的效果最好菌株出发，经刘伟民、郭春梅、李亚楠在写作本专利时核实李亚楠的出发菌株为Grifola sp.CCTCC M2011113))。

[0009] 本发明将得到高效利用米糠麸皮全料液态培养基的灰树花新菌株。特别说明：本发明所述的米糠麸皮全料液态培养基特指将米糠和麸皮做为培养基中唯一的碳源、氮源，不添加其他碳源、氮源，并且米糠、麸皮加水呈液态状，不过滤，即全料加以利用。

[0010] 本发明的关键问题之一为必须得到适宜在米糠麸皮全料液态培养基上生长的灰树花菌株，由于发明人现拥有的灰树花菌株能在过滤取汁的米糠麸皮培养基上生长，但在米糠麸皮全料液态培养基上还不能很好生长，所以需要对已有菌株进行诱变筛选并取得突破。目前微生物的物理选育方法主要有物理诱变、化学诱变、基因重组等。本发明将利用相对简单易行的紫外诱变技术，使出发菌株处于诱变的极端环境，最大限度扩大突变的位点范围，提高得到正突变菌株的可能性。本发明所得发酵米糠麸皮全料液态培养基的新灰树花菌株为首次发明获得。

发明内容

[0011] 本发明为了利用灰树花菌株高效高值化转化加水呈液态的米糠麸皮全料为灰树花多糖，需要诱变筛选出适合在米糠麸皮全料液态培养基上生长的灰树花菌株新菌株和得到相应的该菌株在所用培养基上生产灰树花多糖的方法。考虑紫外物理诱变技术简单易行，采用紫外诱变的方法进行诱变，并通过一系列的稳定性、遗传性等筛选方法，保证灰树花的优良性状，为工业化高效高值化转化低成本的米糠麸皮为灰树花多糖奠定基础。

[0012] 本发明所采取的技术方案如下：

[0013] 本发明提供的灰树花菌株Grifola sp.JSU1301，为可以在米糠麸皮全料液态培养基中快速生长和高产多糖的灰树花诱变株；该菌株中文名称为灰树花(拉丁文学名：Grifola sp.CCTCC M2013286)，已经于2013年6月25日保藏在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为CCTCC M2013286。

[0014] 在本发明的一个方面中，提供上述灰树花菌株Grifola sp.CCTCC M2013286的用途，用于发酵米糠麸皮全料液态培养基生产灰树花多糖。

[0015] 本发明的有益效果

[0016] 国内外多采用物理诱变技术选育灰树花高产菌株，本发明由实验室现有的灰树花出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113进行紫外诱变，以生长速率、菌丝混合干重和菌丝混合多糖为指标进行筛选，最终获得Grifola sp.CCTCC M2013286，在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮全料液态培养基中生产灰树花产多糖，与原始菌株Grifola sp.CCTCC M2011113相比产量更高，紫外诱变菌株Grifola sp.CCTCC M2013286的菌丝干重和菌丝混合多糖产率，摇瓶发酵时分别增加了16.8％和8.57％，而上罐发酵时分别增加了30.9％和29.7％，上罐发酵水平也是利用灰树花发酵米糠麸皮全料液态培养基产多糖所能达到的最高水平。

[0017] 本发明通过反复的紫外诱变筛选研究，最终获得了一株新的灰树花菌株Grifola sp.CCTCC M2013286，该新菌株在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮全料液态培养基中生长速度更快、多糖产量更高，且特性与出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113相比有变化，Grifola sp.CCTCC M2013286与出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113的拮抗试验、蛋白电泳谱图比对和过氧化物酶同工酶电泳谱图比对证明诱变后的菌株Grifola sp.CCTCC M2013286与出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113在遗传特性和发酵性能不同，属于一种新的微生物资源，体现出鲜明的发明创造性。以Grifola sp.CCTCC M2013286为基础，形成了新的发酵米糠麸皮全料液态培养基的方法，该方法改变了以往米糠麸皮过滤取汁或纤维素酶处理后取汁使得米糠麸皮利用率低的缺点，高效利用了廉价的米糠麸皮，可以降低生产成本，减少资源消耗，增加产量。所述诱变株Grifola sp.CCTCC M2013286在相同条件下摇瓶发酵米糠麸皮全料液态培养基，菌丝干重 较出发菌株提高了16.8％，多糖产量较出发菌株提高了8.57％，上罐发酵时上罐发酵时菌丝干重和菌丝混合多糖分别增加了30.9％和29.7％。新菌株Grifola sp.CCTCC M2013286加上发酵米糠麸皮全料液态培养基所能达到的多糖新的高产量，最终得到具有增强免疫力、辅助肿瘤治疗等功效的灰树花多糖。终端产品灰树花多糖目前在市场上价格较高，具有良好的经济价值，为高值化产品。由此可以认为，本发明利用已经具备了发明专利的独特性、创造性和实用性，产生了有益的效果。

附图说明

[0018] 图1为本发明菌株紫外诱变选育方法的流程图。

[0019] 图2为Grifola sp.CCTCC M2013286与出发菌株的拮抗图，注：图中左边为Grifola sp.CCTCC M2013286，右边为Grifola sp.CCTCC M2011113。

[0020] 图3为蛋白电泳谱图，注：从左至右普带表示：Marker、出发菌株Grifolasp.CCTCC M2011113、JSU1302、Grifola sp.CCTCC M2013286。

[0021] 图4为过氧化物酶同工酶电泳谱图，注：从左至右：出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113、JSU1302、Grifola sp.CCTCC M2013286。

具体实施方式

[0022] 本发明按照说明书附图1所示的流程，提供了通过紫外诱变，选育在米糠麸皮全料液态培养基上生长速度更快、多糖产量更高的诱变菌株Grifola sp.CCTCC M2013286的方法，所述方法包括下列步骤：

[0023] ·取实验室保藏的灰树花为出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113；

[0024] ·将灰树花菌株接种于PDA培养基上进行活化培养；

[0025] ·菌体培养后用无菌生理盐水洗脱制得孢子悬液；

[0026] ·将孢子悬液稀释所需倍数，在紫外灯下照射进行诱变后，避光培养，一次筛选出生长速率较快、比较稳定的菌株；将筛选的菌株进行遗传稳定性试验，二次筛选出生长速率较快，比较稳定的菌株；

[0027] ·用米糠麸皮全料液态培养基进行摇瓶发酵，三次筛选出高生长速率和高多糖产量的菌株；

[0028] ·进行遗传性分析及鉴定；

[0029] 在一个实施方案中，所用的PDA培养基为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L， 蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B110mg/L，琼脂20g/L，pH自然。

[0030] 在一个实施方案中，所述恒温为28℃。

[0031] 在一个实施方案中，所述紫外诱变采用红光暗操作，在距离功率为30W的紫外灯20cm下分别照射80s。

[0032] 在一个实施方案中，所述避光培养为在28℃下避光培养3天。

[0033] 在一个实施方案中，所述避光培养所用培养基为米糠、麸皮固体平板培养基：米糠20g/L，麸皮30g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B110mg/L，琼脂20g/L，pH自然(米糠、麸皮为全料)。

[0034] 在一个实施方案中，所述筛选方法为平板直径测定法。

[0035] 在一个实施方案中，所述一次筛选步骤为：从紫外诱变避光培养的平板上挑取生长良好的单菌落分别接种至新的米糠麸皮固体平板培养基中，从紫外诱变中挑选出6株生长速度快且浓密的诱变株，对其传代培养，从中选出相对于出发菌株生长快、形状好、稳定性高的菌株。

[0036] 在一个实施方案中，所述二次筛选步骤为：将紫外诱变选出的较优菌株分别进行平板传代培养5代，挑取生长良好的单菌落分别接种至新的米糠麸皮固体平板培养基中，分别挑选出2株生长速度快、健壮、纯正的变异株。

[0037] 在一个实施方案中，所述三次发酵筛选步骤为：二次筛选确定的高生长速率变异株作为三次筛选的对象，与出发菌株一起进行三次发酵筛选从而确定变异株优良性状稳定表达的菌株。将二次筛选菌株和出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113进行摇瓶发酵试验，连续发酵5代，按指标确定目的诱变株。

[0038] 在一个实施方案中，所述摇瓶为250mL锥形瓶。

[0039] 在一个实施方案中，所述米糠、麸皮液体发酵培养基为：米糠20g/L，麸皮30g/L(米糠、麸皮加水煮3h，不取汁，全料加以利用)，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B110mg/L，pH自然。

[0040] 在一个实施方案中，所述指标为菌丝多糖和菌丝干重，特指混有少量米糠麸皮原料的菌丝多糖和菌丝干重。

[0041] 在一个实施方案中，所述遗传性分析包括拮抗分析、蛋白质相对分子质量和过氧化物酶同工酶电泳分析。

[0042] 实施例1灰树花紫外诱变

[0043] ①孢子悬液的制备

[0044] 将PDA培养基上的灰树花Grifola sp.CCTCC M2011113接种于无菌固体培养基平板上，28℃下培养3d。然后用10mL无菌生理盐水冲洗，用灭菌的接种铲轻微来回刮扫菌丝表面，收集洗液，并稀释适当倍数。

[0045] ②紫外诱变效应曲线及紫外线诱变剂量的选择

[0046] 将盛放孢子悬液的10个平皿依次放在震荡混匀器上，打开皿盖，在距离功率为30W的紫外灯20cm下分别照射0s、5s、10s、20s、35s、55s、80s、110s、145s、185s，秒表计时后-1 -2
及时加盖，以防染菌。将紫外照射后的孢子悬液稀释10 、10 两个数量级，然后用无菌移液枪分别取这三个浓度的孢子悬液0.2mL涂布米糠麸皮筛选培养基平板上(每个浓度做三次平行试验)。用报纸包裹接种好的平皿后，置于闭光的28℃恒温箱培养约3天，待其长出菌落后，计数。每组菌落数取三个平皿菌落数的平均值。按公式计算诱变致死率，以诱变致死率为指标选择紫外诱变剂量，以照射时间为横坐标，以致死率为纵坐标，画出灰树花孢子紫外诱变剂量效应曲线。

[0047]

[0048] 式中，A为诱变后菌落再生数；B为诱变前菌落数。

[0049] ③紫外诱变

[0050] 将震荡混匀器放于无菌操作台下灭菌30min后，将装有10mL新制备的孢子悬液的平皿放在震荡混匀器上，打开皿盖，在距离功率为30W的紫外灯20cm下照射所选计量秒数，秒表计时后及时加盖，以防染菌。

[0051] ④诱变菌株的筛选

[0052] 取紫外照射的菌悬液0.2mL，用无菌玻璃涂棒均匀地涂满米糠、麸皮筛选培养基上，每批涂3个平皿，诱变10代，将再生的优势单菌落分别接种至新的平皿中，挑选出19株较优良诱变株，对其传代培养，以菌丝生长速率为指标进行筛选，从中选出6株生长速度相对较快、形状较好、稳定性较高的变异株。

[0053] ⑤第二次筛选诱变菌株

[0054] a诱变菌株遗传稳定性试验

[0055] 将紫外诱变所选出的较优菌株进行平板传代培养5代，并与出发菌株比较，以菌丝生长速度为指标考察其稳定性。

[0056] b高产多糖、菌丝诱变株的筛选

[0057] 将稳定性试验所选2株变异菌株进行5代摇瓶发酵试验，以菌丝干重、菌丝多糖及胞外多糖为指标，筛选出目的诱变株。

[0058] 将上述所选灰树花诱变株进行摇瓶发酵试验，以菌丝多糖、菌丝干重为指标，筛选出目的诱变株。

[0059] 表1选出菌株各代发酵菌丝干重

[0060]

[0061] 表2选出菌株各代发酵菌丝体多糖

[0062]

[0063] 从表1和2中可以看出变异菌株2号各代发酵的菌丝干重较4号波动幅度小，并且2号多糖产量高于出发菌株和4号，综合两表，不论在菌丝干重还是菌丝多糖两方面指标中，2号诱变菌株优于4号，2号的菌丝干重和菌丝多糖产率分别增加了16.8％和8.57％，菌株JSU1301于2013年6月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏菌株编号为Grifola sp.CCTCC M2013286。

[0064] 试验一变异菌株的分析

[0065] 遗传性分析

[0066] (1)拮抗性分析

[0067] 取变异菌株和出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113接种在米糠麸皮筛选培养基平板上，将两菌株相距一定的距离，放在28℃的培养箱中培养，3d后观察菌落间的拮抗现象。

[0068] 拮抗现象不仅在食用菌的不同种间存在，而且在同种但遗传特性有差异的菌 株之间也存在，菌株之间拮抗作用的强弱反映了菌株间遗传差异性的大小，因此可鉴定菌株是否产生变异。本试验将出发菌株与变异菌株接于平板上后，产生了一定的拮抗，从说明书附图2，可以看出Grifola sp.CCTCC M2013286与Grifola sp.CCTCC M2011113的拮抗线清晰，并且变异菌株的菌丝生长致密、生长速度大于出发菌株，说明了变异菌株与出发菌株产生了遗传差异性。

[0069] (2)蛋白质相对分子质量的测定

[0070] 蛋白质相对分子质量的测定试验包含以下步骤。

[0071] ①提取蛋白

[0072] 称米糠麸皮取汁后的液态发酵培养基中生长并干燥后的菌丝0.5g，加6mL缓冲液(内含0.065mol/L Tris-柠檬酸，pH8.2)，置于研钵中，冰浴下加入液氮使其冷冻，并将冷冻后的固形物快速研磨成糊状，4℃下离心(10000r/min，10min)，取上清液放于4℃冰箱保存备用(上清液保存时间超过15小时须重新配置)。

[0073] ②凝胶配制

[0074] 5％浓缩胶组成为：Tris-HCl缓冲液(pH6.8)5mL、Ars/Bis贮液3.4mL、10％AP0.3mL、TEMED20μL、20％SDS 100μL、双蒸水11.2mL。10％分离胶组成为：Tris-HCl缓冲液(pH8.8)5mL、Ars/Bis贮液6.5mL、10％AP0.20mL、TEMED20μL、20％SDS100μL、双蒸水8.5mL。

[0075] 灌好分离胶后在液面上方轻轻加入少许蒸馏水，静置40分钟，凝胶与水层之间形成平直清晰的界面。凝胶配制过程要迅速，注胶过程避免气泡产生。配制浓缩胶，倾斜倒出分离胶表面水分并用滤纸吸干，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入梳子，静置40分钟。室温放置约60min，待浓缩胶凝固后迅速拔出梳子，用100μL微量注射器抽取电极缓冲液清洗加样孔。取下凝胶及玻璃板，放入电泳仪下槽，电极缓冲液先加入上槽，然后再加下槽。

[0076] ③加样与电泳

[0077] 样品预处理：取50μL上样缓冲液和50μL样品液，混匀，于沸水浴中加热1～2min，去掉亚稳态聚合。进样：用微量注射器吸取样品预处理液30μL，针头插入样品槽底部胶面上，缓慢推动样品进入样品槽底部，加样毕，轻轻抽出进样器。加打开电源，开始稳压
70V，待溴酚蓝进入分离胶后加大电压至120V，待溴酚蓝指示剂达到分离胶底部边缘上约
0.5～1cm时，即刻停止电泳。

[0078] ④染色

[0079] 电泳结束后，放掉电极缓冲液，用刀片背面轻轻撬动玻璃板，除去浓缩胶，取出凝胶，并切角做记号。染色：凝胶放入染色盘中，凝胶完全被染色液覆盖，将染色盘置于脱色摇床，室温染色1～2h。脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。保存：脱色完成后将凝胶保存于7％的醋酸溶液中。

[0080] ⑤电泳图谱分析

[0081] 染色后的胶板用卡尺测量指示剂及各条酶带的迁移距离，按式计算迁移率Rf值。

[0082]

[0083] 式中，x1为酶带迁移距离；x2为指示剂迁移距离。图谱见说明书附图3。

[0084] 电泳分析结果为：

[0085] 图3可以看出，出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113、JSU1302和Grifola sp.CCTCC M2013286具有相同的谱带数，其相对位置没有发生变化。但是普带颜色发生变化，普带颜色变深，浓度变高。出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113颜色最浅，Grifola sp.CCTCC M2013286颜色深于出发菌株，即诱变菌株颜色深于出发菌株。说明诱变菌株和出发菌株之间的遗传特性发生了变化。

[0086] (3)同工酶电泳分析

[0087] 同工酶电泳分析试验包含以下步骤。

[0088] ①提取蛋白

[0089] 称米糠麸皮取汁后的液态发酵培养基中生长并干燥后的菌丝0.5g，加6mL缓冲液(内含0.065mol/LTris-柠檬酸，pH8.2)，置于研钵中，冰浴下加入液氮使其冷冻，并将冷冻后的固形物快速研磨成糊状，4℃下离心(10000r/min，10min)，取上清液放于4℃冰箱保存备用(上清液保存时间超过15小时须重新配置)。

[0090] ②凝胶配制

[0091] 浓缩胶组成为：Tris-HCl缓冲液(pH6.7)0.625mL、10％AP0.25mL、Ars/Bis贮液0.7mL、TEMED10μL、0.04g/L核黄素溶液1mL、双蒸水2.7mL。分离胶组成为：Tris-HCl缓冲液(pH8.9)1.8mL、10％AP0.15mL、TEMED10μL、Ars/Bis 贮液3.5mL、0.04g/L核黄素溶液
2mL、双蒸水7.7mL。

[0092] 灌好分离胶后在液面上方轻轻加入少许蒸馏水，静置40分钟，凝胶与水层之间形成平直清晰的界面。凝胶配制过程要迅速，注胶过程避免气泡产生。配制浓缩胶，倾斜倒出分离胶表面水分并用滤纸吸干，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入梳子，静置40分钟。室温放置约60min，待浓缩胶凝固后迅速拔出梳子，用100μL微量注射器抽取电极缓冲液清洗加样孔。取下凝胶及玻璃板，放入电泳仪下槽，电极缓冲液先加入上槽，然后再加下槽。

[0093] ③加样与电泳

[0094] 样品预处理：取一定量的样品液和等量的40％蔗糖溶液混合，加总体积1/5的0.2％的溴酚蓝溶液(作为指示剂)，混匀。进样：用微量注射器吸取样品预处理液30μL，插入样品槽底部胶面上，推动样品液进入样品小槽底部，加样毕，轻轻抽出进样器。加打开电源，开始稳压70V，待溴酚蓝进入分离胶后加大电压至120V，待溴酚蓝指示剂达到分离胶底部边缘上约0.5～1cm时，即刻停止电泳。

[0095] ④染色

[0096] 电泳结束后，放掉电极缓冲液，用刀片背面轻轻撬动玻璃板，除去浓缩胶，取出凝胶，并切角做记号。染色：凝胶放入染色盘中，且凝胶被染色液完全覆盖至液面下，将染色盘置于脱色摇床，37℃保温染色30min，待酶带清晰后倒去染色液，用蒸馏水冲洗干净。保存：脱色完成后将凝胶保存于7％的醋酸溶液中。

[0097] ⑤电泳图谱分析

[0098] 染色后的胶板用卡尺测量指示剂及各条酶带的迁移距离，按式计算迁移率Rf值。

[0099]

[0100] 式中，x1为酶带迁移距离；x2为指示剂迁移距离。图谱见说明书附图4。

[0101] 电泳分析结果为：

[0102] 如图4所示，出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113和诱变菌株Grifola sp.CCTCC M2013286、JSU1302在图谱上显有2条谱带，三株菌之间的位置没有发生相对迁移，但酶带颜色深浅发生变化。在位置Rf1＝0.231处时，Grifola sp.CCTCC M2011113的谱带颜色浅于Grifola sp.CCTCC M2013286。在Rf2＝0.692 处，Grifola sp.CCTCC M2013286的颜色略低于Grifola sp.CCTCC M2011113；总的来说，诱变前后菌株的酶活发生了改变，即诱变菌株遗传特性相对发生了变化。

[0103] 试验二诱变菌株Grifola sp.CCTCC M2013286和出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113产量比较

[0104] 经筛选的诱变菌株和出发菌株进行发酵罐发酵，比较发酵性能。

[0105] 灰树花菌株分别采用诱变菌株Grifola sp.CCTCC M2013286和出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113。发酵罐装样量为发酵罐容积的80％，培养温度为28℃，通风量1：0.8v/v/mim，搅拌速度60r/min，罐表压0.05MPa，接种量8％，培养时间5d，发酵培养基为米糠60g/L，麸皮20g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，pH自然。称重法测定菌丝干重，苯酚硫酸法测定菌丝多糖。将液体培养所得的菌丝混合体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝混合干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在100℃水浴中浸提3h，定量到一定容积，用苯酚-硫酸法测定菌丝混合多糖含量。试验结果为：(1)诱变菌株Grifola sp.CCTCC M2013286和出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113在相同条件和培养基中发酵，菌丝干重分别为36.0g/L和27.5g/L，诱变菌株Grifola sp.CCTCC M2013286的菌丝干重较出发菌株提高了30.9％。(2)Grifola sp.CCTCC M2013286突变菌株Grifola sp.CCTCC M2013286和发菌株在相同条件和培养基中发酵，菌丝多糖两者分别为2.53g/L和1.95g/L，突变菌株JSU10的菌丝多糖较出发菌株提高了29.7％。该试验的数据表明诱变菌株Grifola sp.CCTCC M2013286的菌丝干重和菌丝多糖也比李永转硕士论文(p48)所报道的最好水平的UVW-1的菌丝干重27g/L、菌丝多糖1.95g/L都显著提高。发酵试验表明，突变菌株Grifola sp.CCTCC M2013286和出发菌株Grifola sp.CCTCC M2011113相比，发酵性能发生了变化，多糖产量水平也达到此类方法目前最高。