L-谷氨酰胺在制备治疗高同型半胱氨酸血症药物中的应用

摘要

本发明公开了L-谷氨酰胺在制备治疗高同型半胱氨酸血症药物中的应用，涉及医药技术领域，由于本药品是常见的一种氨基酸，用本药来治疗同型半胱氨酸血症与目前临床上常用的治疗同型半胱氨酸血症的通用药物相比，具有以下优点：(1)疗效显著，特别是直接降低血清中同型半胱氨酸含量最为明显；(2)此药安全性高，无毒副作用；(3)比目前市场中常用的或已经报告过有效的药物价格要明显低廉，可以减轻病人的经济负担；(4)本药可结合治疗其它药物作为复方制剂；(5)本药在直接降低血液中同型半胱氨酸含量的同时也可以明显降低炎性反应，提高机体的抗氧化能力。

权利要求

1.L-谷氨酰胺在制备治疗高同型半胱氨酸血症药物中的应用。

说明书

L-谷氨酰胺在制备治疗高同型半胱氨酸血症药物中的应

用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种L-谷氨酰胺的新用途，特别是L-谷氨酰胺在制备治疗高同型半胱氨酸血症药物中的新医药用途，属于医药技术领域。

背景技术

[0002] 高 同型 半 胱 氨 酸(High homocysteine，HHcy)血 症 为同 型 半 胱 氨 酸(homocysteine，Hcy)在血液中升高所形成的一种代谢性疾病，HHcy血症是多种疾病的危险因子，一般而言，同型半胱氨酸水平升高可使心血管疾病死亡危险性增加4～6倍，有研究显示，当血浆总Hcy水平每升高5umol/L冠心病危险性男性则增加60％，女性则增加80％，而重度同型半胱氨酸血症多发生在伴有其它疾病的人群，特别是糖尿病、冠状动脉粥样硬化、老年性痴呆、中风、静脉栓塞等疾病，这些患者同型半胱氨酸血症水平明显高于正常人。过去有研究显示患者vitB12、vitB6的缺乏是造成高同型半胱氨酸血症的一个关键因素，但是通过对众多病例的研究发现，有大部分患者在补充vitB12、vitB6之后，同型半胱氨酸在血液中的含量并没有什么变化，这提示关于HHcy发病机制还没有完全明朗，寻找有效预防和治疗高同型半胱氨酸血症的新手段是十分必要的。

[0003] L-谷氨酰胺(L-Glutamine，L-Gln)，学名：2-氨基-5-羧基戊酰胺，是蛋白质合成中的编码氨基酸，在体内可以由葡萄糖转变而来。L-Gln是肠道粘膜细胞代谢必需的营养物质，对维持肠道粘膜上皮结构的完整性起着十分重要的作用(Li，Nan；Ma，Liya；Liu，Xueyan；Shaw，Lynn；Calzi，Sergio Li；Grant，Maria B；Neu，Jose.Arginyl-Glutamine Dipeptide or Docosahexaenoic Acid Attenuates Hyperoxia-induced Small Intestinal Injury in Neonatal Mice[J].Journal ofPediatric Gastroenterology＆Nutrition.2012，54(4)：499-504)。谷氨酰胺是体内还原型谷胱甘肽的重要来源之一，在机体内发挥着免疫调节的作用。谷氨酰胺是淋巴细胞分泌、增殖及其功能维持所必需的，同时谷氨酰胺也可以作为核酸生物合成的前体和能源，谷氨酰胺可促使淋巴细胞、巨噬细胞的有丝分裂和分化增殖，增加细胞因子TNF、IL-1等的产生和磷脂的mRNA合成。提供外源性谷氨酰胺可明显增加危重病人的淋巴细胞总数、T淋巴细胞和循环中CD4/CD8的比率，增强机体的免疫功能。另外谷氨酰胺还可以提高机体的抗氧化能力，补充谷氨酰胺，可通过保持和增加组织细胞内的GSH的储备，提高机体抗氧化能力，稳定细胞膜和蛋白质结构，保护肝、肺、肠道等重要器官及免疫细胞的功能，维持肾脏、胰腺、胆囊和肝脏的正常功能。谷氨酰胺在促进蛋白质代谢中有积极作用。谷氨酰胺可抑制炎性介质释放，减轻机体应激反应程度，缩短住院时间。谷氨酰胺还是少数几种能促进生长激素释放的氨基酸之一(一、Ting Han，Xiuli Li，Donglian Cai，Yan Zhong，Lingyun Chen，ShanhanGeng，Shaojun Yin.Effect of glutamine on apoptosis of intestinal epithelial cells of severe acute pancreatitis rats receiving nutritional support in different ways[J].Int J Clin Exp Pathol.2013；6(3)：503-509. 二、Claire Boutry，Hideki Matsumoto，Cécile Bos，Christophe Moinard，Luc Cynober，Yulong Yin，Daniel Tomé，Frangois Blachier.Decreased glutamate，glutamine and citrulline concentrations in plasma and muscle in endotoxemia cannot be reversed by glutamate or glutamine supplementation：a primary intestinal defect ？ [J].Amino Acids.2012，43(4)：1485-1498.)。近年来，国内外众多专家发现谷氨酰胺能增加人体血液中GLP-1的含量，随谷氨酰胺口服剂量的增加，血中GLP-1分泌增加，在空腹胰岛素的量并没有增加的情况下使空腹血糖下降，胰岛素敏感性增高、糖化血红蛋白下降、从而达到降低血糖，增加胰岛素敏感性，降低胰岛素抵抗的作用(Jerry R Greenfield，I Sadaf Farooqi，Julia M Keogh.Oral glutamine increases circulating glucagon-like peptide1glucagon，and insulin concentrations in lean，obese，andtype2diabetic subjects.The American Journal of Clinical Nutrition，2009，106(13)：106-113)，目前关于谷氨酰胺与高同型半胱氨酸血症的关系在国内外均没有报告。

[0004] 当前在临床中并没有治疗HHcy血症的特效药物，针对诸多危险因素进行预防，是降低该病发病率的根本性措施，临床中治疗HHcy血症措施主要有3个方面：1、应用抗氧化剂，诸如银杏制剂，维生素C、E，β-胡萝卜素，超氧化物歧化酶(SOD)等，2、应用叶酸，维生素B6、B12等促进同型半胱氨酸代谢的药物，3、应用抗炎制剂，如阿司匹林、消炎痛等。在以上治疗方法中，抗氧化剂和抗炎性药物主要是单纯性的起到预防和延缓病发生和发展的作用，而应用叶酸、维生素B6、B12三者一起应用，可以降低血液中HHcy的含量，但是个体的差异性明显，有些患者是无效的；本发明应用谷氨酰胺治疗HHcy血症，相较于临床中常用的药物，优势明显，主要表现在不仅可以明显的降低血液中高同型半胱氨酸的含量，同时也可以明显的降低大鼠炎症反应、提高抗氧化能力，同时治疗后每只大鼠均明显有效，这些是上面陈述的三大类药物不能比拟的。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种L-谷氨酰胺的新用途，即L-谷氨酰胺在制备治疗HHcy血症药物中的应用。

[0006] 本发明所述的L-谷氨酰胺的新用途，是将L-谷氨酰胺用作治疗HHcy血症的新药物，即以L-谷氨酰胺为药物主要成分，在治疗HHcy血症这一疾病中的应用。

[0007] 本发明所述的治疗HHcy血症的药物的主要成分(或有效成分)为L-谷氨酰胺，还可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，以改善药物吸收效果或便于服用，如制成胶囊或丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等。

[0008] 本发明在制备治疗HHcy血症药物时可以添加包括药学领域常见的填充剂、稀释剂、粘合剂、吸收促进剂，稳定剂等辅料服用，必要时还可以加入香味剂和甜味剂等。

[0009] 本发明提供了L-谷氨酰胺的一种新用途，即在制备治疗高同型半胱氨酸血症药物中的应用，动物实验结果：(1)HHcy组大鼠同型半胱氨酸的平均含量为16.43±6.28μmol/L明显的要高于正常组(5.24±1.17μmol/L)，在用L-谷氨酰胺治疗后(给予谷氨酰胺溶液灌胃，每天2次，每次0.5g/kg大鼠体重)可以明显的降低大鼠血液中同型半胱氨酸的含量(最终降低到7.74±1.17μmol/Lg/ml，降低的比例高达53％)，甚至个别大鼠还好于空白对照组；血液维生素B12相较于模型组明显升高(模型对照组550+203pmol/L，L-GLn治疗组7904±43pmol/L，空白对照组990±188pmol/L)；大鼠体内叶酸水平几乎恢复到正常水平(模型对照组18.5+14.3nmoL/L，L-GLn治疗组34.7±4.3nmoL/L，空白对照组39.6+7.8nmoL/L)；(2)高同型半胱氨酸血症大鼠模型在接受L-GLn治疗8周后，IL-6、IL-1、NF-kB、CRP等相关炎性因子得到明显的改善；(3)高同型半胱氨酸血症大鼠模型在接受L-GLn治疗8周后，SOD、MDA、GSH、T-AOC等相关的氧化和抗氧化能力明显的恢复到正常水平；(4)大鼠同型半胱氨酸代谢的二种关键酶CBS与MTHFR得到了明显的改善，由以上实验结果证明，谷氨酰胺可以用于高同型半胱氨酸血症且疗效相当显著。

[0010] 与目前临床上常用的治疗脂肪肝药物相比，本发明的药物具有以下优点：(1)疗效显著；(2)安全性高，由于是一种普通的氨基酸，几乎无毒副作用。(3)价格低廉，可以减轻病人的经济负担。(4)本药在直接降低血液中同型半胱氨酸含量的同时也可以降低血液中炎性反应，提高机体的抗氧化能力。(5)疗效显著，对每个个体都有用，适用性广。

[0011] 由于谷氨酰胺治疗高同型半胱氨酸血症的应用属于首次发现，因此，无论是L-谷氨酰胺作为单体药物来使用，还是利用L-谷氨酰胺作为主要成分配合其它药物做成复方试剂的应用，均在本发明的保护范围内。

附图说明

[0012] 图1是本发明L-谷氨酰胺治疗高同型半胱氨酸血症后的大鼠血清中同型半胱氨酸含量比较结果示意图；

[0013] 图2是本发明L-谷氨酰胺治疗高同型半胱氨酸血症后的大鼠血清中叶酸和维生素B12的含量比较结果示意图，其中A是叶酸含量；B是维生素B12的含量；

[0014] 图3是本发明L-谷氨酰胺治疗高同型半胱氨酸血症后大鼠血清氧化能力指标SOD、MDA变化结果图，其中A是SOD结果；B是GSH结果；

[0015] 图4是本发明L-谷氨酰胺治疗高同型半胱氨酸血症后大鼠血清氧化能力指标GSH、T-AOC的变化结果图，其中A是MDA结果；B是T-AOC结果；

[0016] 图5是本发明L-谷氨酰胺治疗高同型半胱氨酸血症后大鼠血清中的大鼠部分炎性因子IL-6、IL-1的变化示意图，其中A是IL-1结果；B是IL-6结果；

[0017] 图6是本发明L-谷氨酰胺治疗高同型半胱氨酸血症后大鼠血清中的大鼠部分炎性因子NF-kB、CRP的变化图，其中A是NF-kB结果；B是CRP结果；

[0018] 图7是本发明L-谷氨酰胺治疗高同型半胱氨酸血症后大鼠CBS、MTHFR蛋白的western表达示意图；

具体实施方式

[0019] 下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

[0020] 实施例1：L-谷氨酰胺治疗高同型半胱氨酸血症后的大鼠血清中同型半胱氨酸、叶酸、维生素B12的含量研究

[0021] 实验中采用的实验动物为SD大鼠，大鼠均为雄性，体重为180-200g，由昆明医科大学实验动物中心提供，大鼠采用大笼12只，小笼6只隔离饲养，饲养为常规饲料，自由饮食和饮水。

[0022] 实验中采用的药品为L-谷氨酰胺为日本株式会社提供，造模药品蛋氨酸购自北京鼎国生物技术公司；检测大鼠同型半胱氨酸、叶酸、维生素B12等指标的Elisa试剂盒购于Bio-Swamp公司。

[0023] 40只大鼠随机分为空白对照(CON)组13只，模型对照(HFD)组13只，L-谷氨酰胺组14只，CON组给予基础饲料喂养，HFD组、L-Gln组给予普通饲料+蛋氨酸溶液灌胃喂养(蛋氨酸的每天的喂养量为每天早上一次，每千克大鼠每次1g，喂养时用10mi水稀释)。喂养12周后，每组各取二只大鼠处死，取血清做相关指标学检查(蛋氨酸停止喂养1周后，血清学检查血液中同型半胱氨酸含量为15.00μmol/L以上证实造模成功)，证实模型建立成功后，L-Gln组给予一天二次、每次0.5g/kg大鼠体重L-谷氨酰胺灌胃治疗，HFD组给予等量的蒸馏水灌胃治疗，空白组仍然只喂食基础饲料，治疗期为8周。

[0024] 用大鼠同型半胱氨酸、叶酸、维生素B12相关Elisa试剂盒检测大鼠血清中同型半胱氨酸含量、叶酸、维生素B12的含量，从图1与图2中可看出：L-Gln治疗组与模型组相比，血清中同型半胱氨酸含量明显降低，经检验治疗后p值小于0.05；L-Gln治疗组叶酸及维生素B12与模型组相比，检验治疗后p值也小于0.05；实验结果证明：谷氨酰胺治疗HHcy血症可以明显的降低血清中Hcy的含量，同时提高血清中叶酸与维生素B12的含量，从而达到直接降低血液中Hcy的作用。

[0025] 实施例2：L-谷氨酰胺治疗高同型半胱氨酸血症后大鼠血清中抗氧化能力指标含量的研究

[0026] 本实验中所采用的动物和实验药品和实施例1相同，检测SOD、MDA、GSH、T-AOC等指标的试剂盒购自南京生物工程研究所。

[0027] 本实验中大鼠造模和治疗方法和实施例1中所采用的方法相同。

[0028] 用相应试剂盒检测大鼠血清SOD、MDA、GSH、T-AOC四个指标。

[0029] L-Gln治疗组与模型组相比，得到了明显的改善，经检验治疗后四个指标p＜0.05，说明谷氨酰胺治疗HHcy血症可以明显的提高大鼠抗氧化能力，从图3与图4中可看出：

[0030] SOD：模型对照组33.6+18.6U/mgprot，L-GLn治疗组70.65+19.34U/mgprot，空白对照组92.67±23.34U/mgprot；MDA：模型对照组3.15±1.30nmol/mgprot，L-GLn治疗组1.67±1.22nmol/mgprot，空白对照组1.02±0.86nmol/mgprot；GSH：模型对照组0.98±1.03mmol/L，L-GLn治疗组3.70±1.23mmol/L，空白对照组4.6±0.84mmol/L；
T-AOC：模型对照组7.5±5.6u/L，L-GLn治疗组14.7±4.3u/L，空白对照组19.6+4.8u/L。

[0031] 实施例3：谷氨酰胺对HHcy血症的炎性因子影响的研究

[0032] 实验中所采用的动物和实验药品和实施例1相同，检测大鼠IL-6、IL-1、NF-kB、CRP炎性因子等Elisa试剂盒购于Bio-Swamp公司。

[0033] 实验中大鼠造模和治疗和实施例1中所采用的方法相同。

[0034] 用相应试剂盒检测大鼠血清IL-6、IL-1、NF-kB、CRP四个指标。发现L-Gln治疗组与模型组相比，四个指标均有明显好转(IL-6：模型对照组1640±424pg/ml，L-GLn治疗组1255±315pg/ml，空白对照组813±234pg/ml；IL-1：模型对照组518±186pg/ml，L-GLn治疗组325±193pg/ml，空白对照组243±574pg/ml；NF-kB：模型对照组404±136umol/g，L-GLn治疗组137±82umol/g，空白对照组94±27umol/g；CRP；模型对照组423±116pg/ml，L-GLn治疗组227±45pg/ml，空白对照组183±49pg/ml)，提示：L-Gln可以明显的降低HHcy血症大鼠机体炎性反应，经检验治疗后四个组p值均小于0.05，详见图5与图6。

[0035] 实施例4：谷氨酰胺对高同型半胱氨酸血症大鼠CBS、MTHFR蛋白的表达实验[0036] 实验中所采用的动物和实验药品和实施例1相同，采用的CBS、MTHFR以及β-actin一抗抗体购自Santa公司，二抗抗体购自于中杉金桥公司。

[0037] 实验中大鼠造模和治疗方法和实施例1中所采用的方法相同。

[0038] 用Western检测CBS、MTHFR蛋白的表达，方法如下：取肝脏组织用组织细胞裂解液制作匀浆，BCA法测定蛋白质含量，取各样本80tg进行SDS-PAGE电泳，半干转法将蛋白转移至PVDF膜，5％的脱脂牛奶封闭2h后分别加入多克隆一抗，4℃过夜，洗膜后加入相应的HRP标记的二抗孵育，洗涤后与ECL发光试剂反应，曝光洗片，扫描图像后用Image J软件计算各条带的灰度值，以β-actin作为内参进行标准对照，每组实验重复3次。大鼠治疗后，谷氨酰胺治疗组与模型组相比，CBS、MTHFR的表达几乎恢复到正常值的水平，P＜0.05，结果见图7。