含有KGF2的植物油体凝胶剂

摘要

本发明公开了含有KGF2的植物油体，它是将人源KGF2的核苷酸序列连接到油体蛋白核苷酸序列的3’端，插入表达载体pOBT，转入油料作物油体中表达了KGF2，提取油体，与油体的凝胶基质混合，制得的含有KGF2的植物油体凝胶剂，所述的油体的凝胶基质，它是由以下述组份按重量%组成：羧乙基纤维素1%—5%、甘油5%—40%、尼泊金甲酯0.01%—0.1%、尼泊金丙酯0.01%—0.1%、加注射用水至100%；它可以混入30%的植物油体，制成的植物油体凝胶剂，37℃保存12个月，凝胶剂无霉变现象，其外观、pH等理化指标均未发生变化；4℃保存12个月，KGF2活性无明显变化。

权利要求

1.含有KGF2的植物油体凝胶剂，它包括油体的凝胶基质70-90%和含有KGF2的植物油体10-30%；

所述的油体的凝胶基质，它是由下述组成份重量%组成：羧乙基纤维素 1%—5%

甘油 5%—40%尼泊金甲酯 0.01%—0.1%尼泊金丙酯 0.01%—0.1%补加注射用水至 100%；

所述的含有KGF2的植物油体，它是将其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示的基因插入植物特异表达载体，获得的表达载体质粒，转化至油料作物中，收获种子提取的油体。

2.根据权利要求1所述的含有KGF2的植物油体凝胶剂，其特征在于：还包括人血白蛋白0.05-0.2%、肝素0.001-0.003%，各组份之和等于100%。

3.根据权利要求2所述的含有KGF2的植物油体凝胶剂，其特征在于：所述的人血白蛋白0.1%、肝素0.002%，各组份之和等于100%。

4.根据权利要求1、2或3所述的含有KGF2的植物油体凝胶剂，其特征在于：所述的油体的凝胶基质其重量%为：羧乙基纤维素 3%—4%

甘油 20%—30%尼泊金甲酯 0.03%—0.05%尼泊金丙酯 0.03%—0.05%补加注射用水至 100%。

5.根据权利要求1、2或3所述的含有KGF2的植物油体凝胶剂，其特征在于：所述的油体的凝胶基质其重量%为：羧乙基纤维素 1.2%

甘油 20%

尼泊金甲酯 0.05%

尼泊金丙酯 0.05%

补加注射用水至 100%。

6.根据权利要求1所述的含有KGF2的植物油体凝胶剂，其特征在于：所述的表达载体质粒为pOBT- KGF2，它是由下述方法制备的：

1）以p1301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用35S-F上游引物CGGGGTACCATCCGTCAACATGGTGGAGCACGACACGCTTGTCTACT和Bar-R下游引物CGGAATTCACTAGTTCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGACGGGGCGGAACC进行PCR，扩增得到35S-Bar基因，利用kpnI和SpeI酶切位点将其插入到pCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了p1301-35S-Bar-NOS基本质粒，简写为pO质粒；

2）用pstI和NcoI分别酶切并连接pO质粒和序列表SEQ ID NO.2所示基因，得中间载体pOB；

3）用HindⅢ和kpnI分别酶切并连接中间载体pOB和序列表SEQ ID NO.3所示基因，得植物特异表达载体pOBT；

4）用NcoI与HindⅢ分别酶切并连接植物特异表达载体pOBT和序列表SEQ ID NO.5所示基因，得表达载体质粒pOBT- KGF2。

7.根据权利要求1所述的含有KGF2的植物油体凝胶剂，其特征在于：所述的油料作物为红花、花生、亚麻芥或大豆。

说明书

含有KGF2的植物油体凝胶剂

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及含有KGF2的植物油体凝胶剂。

背景技术

[0002] 油体是由单层的磷脂膜，内包含TAG，表面上镶嵌油体蛋白、钙结合蛋白、固醇结合蛋白组成的。储存在油体中的TAG是为种子萌发提供能量的。油体蛋白，是油体中主要的膜蛋白。它是碱性的疏水蛋白，由三个部分组成：亲脂的N端和C端，和中间的疏水区域。N端和C端则镶嵌在油体表面，暴露在细胞质中。中间的疏水区域是通过磷脂膜进入到油体内部。因此它会产生电阻和静电排斥，使油体能够独立存在。油体蛋白具有表面活性剂，使其不能与油体结合。油体的这种非结合性非常适合用作乳化剂。比起来自矿物的乳化剂更加环保和可再生。

[0003] 油体自身的乳化剂可以在生产食品、饲料、药物、个人护理产品和工业产品等中得到广泛的应用。在食品和饲料的生产中，从向日葵等植物中获得的油体乳化剂较其他植物更经济健康，因为它富含不饱和脂肪酸和维他命E。它们可以被用来生产沙拉酱、冰淇林、鱼饲料、宠物食品和牲畜饲料等产品。

[0004] 油体在药物中应用包括治疗、诊断和传递三个方面。在疫苗生产中,油体乳化剂可以作为佐料，用于生产治疗皮肤病类药物和口服药中的成分。在这些产品中，油体可以携带药品直接作用于患处。在个人护理产品中，油体应用更为广泛，如护肤品和药用护肤品中的乳霜、化妆水、化妆品、头发护理产品等；浴室中的香皂、洗露等产品。在工业应用中，油体乳化剂可被应用于生产润滑油、油漆、涂料、油墨、抛光、薄膜、纸浆、橡胶等产品。在这些应用中，油体的纯度不做严格的要求。

[0005] 1962年动物生理学家winten通过猪体组织研究发现，聚乙烯薄膜覆盖的伤口的愈合率是暴露伤口的2倍，同时还发表了具有突破性的研究，水疮如果不予刺破，能促进上皮表皮细胞移动，有利于伤口的迅速愈合。1974年诞生了第一块先进敷料，并提出伤口湿性愈合的理论。湿性愈合在伤口愈合进程中，可缩短伤口的治疗时间；减少换药次数，节省敷料；减轻伤口的疼痛，并且降低了费用，同时减少护理工作量。

[0006] 角质细胞生长因子2（Keratinocyte growth factor2,KGF2）又称为成纤维细胞生长因子-10，是成纤维细胞生长因子超家族中角质细胞生长因子亚家族的一员。它是一种现代生物制品，它是人体内存在的内源性生物活性物质，它对多种软组织和神经系统的损伤具有快速修复作用，同时它又是一种神经营养因子。KGF2的生物学功能主要是通过受体的介导完成的，它能特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移，对脊椎动物多种组织和器官的发育起重要调控作用。KGF2有两种细胞膜表面受体即FGFR1-Ⅲb和FGFR2-Ⅲb。它们都由三部分组成:包括三个胞外免疫球蛋白结构域(D1、D2和D3)，一个单面跨膜螺旋结构域和胞内具有酪氨酸蛋白激酶活性的C端结构域。它不同于成纤维细胞生长因子家族其他成员的最重要一点是由成纤维细胞及其他间质细胞分泌产生,对肝素具有很强的亲和力,特异性作用于上皮细胞表面的酪氨酸激酶受体FGFR2Ⅲb和FGFR1Ⅲb。

[0007] 角质细胞生长因子KGF2能有效促进上皮细胞增生，明显改善皮肤损伤的修复。有研究表明，KGF2不仅直接促进角质细胞的增殖，而且还刺激角质细胞合成与分泌粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和血小板源性生长因子（PDGF-AB）,从而间接作用于参与组织修复的其它细胞如炎性细胞、内皮细胞、成纤维细胞以及角朊细胞自身，促进创面的再上皮化与肉芽组织形成。此外,体外实验及体内实验表明KGF-2对肿瘤细胞无明显的促增殖作用，因而是一个较为安全的治疗创面愈合的生长因子。

[0008] 研究表明KGF2在预防电离辐射损伤防护方面具有显著作用。它能增强细胞抗氧自由基损伤和增强DNA复制，抑制辐射诱导的细胞凋亡率，降低辐射引起的胃肠道损伤，预防黏膜炎的发生，保护小肠隐窝免受辐射损伤，提高骨髓对全身辐射的耐受性，并能调节和维持干细胞的分裂及存活。有研究表明KGF能促进损伤后的DNA修复，维持细胞内骨架稳定和保持细胞间的连接完整，KGF2对上皮样肿瘤均无刺激增殖效应，在临床肿瘤放化疗引起的黏膜炎等方面具有广阔的应用前景。

发明内容

[0009] 本发明的目的是提供含有KGF2的植物油体凝胶剂。

[0010] 含有KGF2的植物油体凝胶剂，它包括油体的凝胶基质70-90%和含有KGF2的植物油体10-30%；

[0011] 所述的油体的凝胶基质，它是由下述组成份重量%组成：

[0012] 羧乙基纤维素 1%—5%

[0013] 甘 油 5%—40%

[0014] 尼泊金甲酯 0.01%—0.1%

[0015] 尼泊金丙酯 0.01%—0.1%

[0016] 补加注射用水至 100%

[0017] 所述的重量%为：

[0018] 羧乙基纤维素 3%—4%

[0019] 甘油 20%—30%

[0020] 尼泊金甲酯 0.03%—0.05%

[0021] 尼泊金丙酯 0.03%—0.05%

[0022] 补加注射用水至 100%

[0023] 所述的重量%为：

[0024] 羧乙基纤维素 1.2%

[0025] 甘油 20%

[0026] 尼泊金甲酯 0.05%

[0027] 尼泊金丙酯 0.05%

[0028] 补加注射用水至 100%；

[0029] 所述的含有KGF2的植物油体，它是将其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示的基因插入植物特异表达载体，获得的表达载体质粒，转化至油料作物中，收获种子提取油体；

[0030] 所述的表达载体质粒为pOBT- KGF2，它是由下述方法制备的：

[0031] 1）以p1301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用35S-F上游引物CGGGGTACCATCCGTCAACATGGTGGAGCACGACACGCTTGTCTACT和Bar-R下游引物CGGAATTCACTAGTTCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGACGGGGCGGAACC进行PCR，扩增得到35S-Bar基因，利用kpnI和SpeI酶切位点将其插入到pCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了p1301-35S-Bar-NOS基本质粒，简写为pO质粒；

[0032] 2）用pstI和NcoI分别酶切并连接pO质粒和序列表SEQ ID NO.2所示基因，得中间载体pOB；

[0033] 3）用HindⅢ和kpnI分别酶切并连接中间载体pOB和序列表SEQ ID NO.3所示基因，得植物特异表达载体pOBT；

[0034] 4）用NcoI与HindⅢ分别酶切并连接植物特异表达载体pOBT和序列表SEQ ID NO.5所示基因，得表达载体质粒pOBT- KGF2 ；

[0035] 所述的含有KGF2的植物油体凝胶剂，还包括人血白蛋白0.05-0.2%、肝素0.001-0.003%；优选为人血白蛋白0.1%、肝素0.002%

[0036] 所述的油料作物为红花、花生、亚麻芥或大豆。

[0037] 所述的含有KGF2的植物油体凝胶剂，还包括人血白蛋白0.05-0.2%、肝素0.001-0.003%；优选为人血白蛋白0.1%、肝素0.002%。

[0038] 本发明提供了油体的凝胶基质，它是由以下述组份按重量%组成：羧乙基纤维素1%—5%、甘油5%—40%、尼泊金甲酯0.01%—0.1%、尼泊金丙酯0.01%—0.1%、加注射用水至
100%；它可以混入30%的植物油体，制成的植物油体凝胶剂， 37℃保存12个月，凝胶剂无霉变现象，其外观、pH等理化指标均未发生变化；本发明提供了含有KGF2的植物油体凝胶，它是将人源KGF2的核苷酸序列连接到油体蛋白核苷酸序列的3’端，插入表达载体pOBT中，转入油料作物油体中表达了KGF2，提取油体，与油体的凝胶基质混合，制得的含有KGF2的植物油体凝胶剂，4℃保存12个月，KGF2活性无明显变化。

附图说明

[0039] 图1含有KGF2的植物油体的活性测定结果。

具体实施方式

[0040] 实施例1 KGF2转基因种子的获得

[0041] 由上海生工生物工程有限公司合成人源KGF2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

[0042] 取拟南芥种子，提取DNA基因组，以P1和P2为引物（P1：CCATGGCGGATACAGCTAGAGG和P2：CACCGGGTGGAGTAGTGTGCTGG）进行扩增拟南芥油体蛋白基因，经测序，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示；将其克隆到T载体。然后以人工合成的KGF2基因和拟南芥油体蛋白基因为模板，设计引物：

[0043] O1：CCATGGCGGATACAGCTAGAGGAACCCATCAC；

[0044] O2：CATGTCCTGACCAAGGGCAGTAGTGTGCTGG C；

[0045] O3： GCCAGCACACTACTGCCCTTGGTCAG GACATG；

[0046] O4：CCCAAGCTTCTATTATGAGTGTACCA CCATTGGAAGAAAG；

[0047] 进行融合PCR，扩增获得融合基因Oleosin-KGF2；其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示；将融合基因Oleosin-KGF2经NcoI及HindⅢ双酶切后连接到pOBT植物油体表达载体上（以p1301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用35S-F上游引物47bp cggggtaccAtccgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctact和Bar-R下游引物54bp cggaattcactagttcagatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggaacc进行PCR，扩增得到35S-Bar基因，利用kpnI和SpeI酶切位点将其插入到pCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了p1301-35S-Bar-NOS基本质粒，简写为pO质粒，然后将菜豆启动子（其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示）与基本质粒pO连接，转化大肠杆菌，获得pOB中间载体；将pUC57-终止子的克隆载体用HindIII和kpnI消化，回收菜豆终止子（其碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示）；，同时用这两个酶HindIII和kpnI消化pOB中间载体，将终止子与酶切后的pOB载体连接，转化大肠杆菌，获得植物油体特异表达载体pOBT），获得重组质粒pOBT-KGF2；将重组质粒pOBT-KGF2 转入农杆菌，侵染转化植物外植体；筛选转基因抗性植株，得到抗性植物转化苗，移栽培养，获得T1代转基因种子，继续扩繁，获得T3代转基因KGF2的种子。

[0048] 实施例2 油体的提取

[0049] 取种子30g，在无菌环境下，灭菌纯水洗涤3次，加入5倍体积的缓冲液Ⅰ（0.1M Tris-KOH pH7.0,10mM KCl，1mM MgCl2,1mM EDTA, O.6M蔗糖）破碎、匀浆，三层纱布过滤后，6000g 4℃离心20分钟；上层固体物质用含有0.6M蔗糖的缓冲液Ⅰ重悬，缓慢加入等体积含0.1M蔗糖的缓冲液Ⅰ，15000g、4℃离心20分钟，重复1次；上层固体物质用含有0.1M蔗糖的缓冲液Ⅰ重悬， 15000g、4℃离心20分钟，重复1次。上层固体物质用不含蔗糖的缓冲液Ⅰ充分重悬，15000g、4℃离心20分钟，重复2次。得到的上层片状物即为油体，4℃备用。

[0050] 实施例3 含有KGF2油体的活性测定

[0051] NIH 3T3细胞株用完全培养基于37℃,5% CO2培养，细胞处于对数生长期，用于生4 5
物学活性测定。消化收集细胞，用完全培养液配成5.0×10-1.0×10 个/mL细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL, 37℃,5% CO2培养,24小时后换维持培养液（0.3-1%血清）换液，37℃,5% CO2培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液，加入供试品溶液，每孔100μL，37℃,5% CO2培养48小时，每孔20μL MTT溶液，37℃,5%CO2培养4-6小时。
弃去板中液体后，向孔中加入DMSO 100μL，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，于
570nm处测定吸光度，记录测定结果。计算供试样品的生物学活性。由图1可知，与野生型植物油体相比，含有KGF2的植物油体具有促进NIH3T3增值的活性。

[0052] 实施例4 凝胶剂制备

[0053] 羧甲基纤维素钠 3.2g

[0054] 甘油 25.6g

[0055] 尼泊金甲酯 0.05g

[0056] 尼泊金丙酯 0.05g

[0057] 补加注射用水至 100g

[0058] 充分溶胀，搅拌均匀，形成透明凝胶，121℃、30分钟高压灭菌。冷却备用。

[0059] 蛋白除菌过滤：将人血白蛋白及肝素，加入冷却的注射用水充分混匀，在无菌条件下0.22μm滤膜过滤除菌；

[0060] 凝胶剂制备：无菌条件下，将含有KGF2的红花油体20g、羧甲基纤维素钠凝胶基质80g及人血白蛋白0.1g、肝素2mg充分混合、分装。

[0061] 实施例5 凝胶剂制备

[0062] 羟乙基纤维素 1.2g

[0063] 甘油 20g

[0064] 尼泊金甲酯 0.05g

[0065] 尼泊金丙酯 0.05g

[0066] 补加蒸馏水至 100g

[0067] 常温搅拌1h；

[0068] 充分溶胀，搅拌均匀，形成透明凝胶，121℃、30分钟高压灭菌。冷却备用。

[0069] 蛋白除菌过滤：将人血白蛋白及肝素，加入冷却的注射用水充分混匀，在无菌条件下0.22μm滤膜过滤除菌；

[0070] 凝胶剂制备：无菌条件下，将含有KGF2的红花油体20g、羟乙基纤维素凝胶基质80g及人血白蛋白0.1g、肝素2mg充分混合、分装。

[0071] 实施例6 凝胶剂制备

[0072] 羧乙基纤维素 1g

[0073] 甘油 40g

[0074] 尼泊金甲酯 0.01g

[0075] 尼泊金丙酯 0.1g

[0076] 补加注射用水至 100%

[0077] 其它同实施例5。

[0078] 实施例7 凝胶剂制备

[0079] 羧乙基纤维素 5g

[0080] 甘油 5g

[0081] 尼泊金甲酯 0.1g

[0082] 尼泊金丙酯 0.01g

[0083] 补加注射用水至 100%

[0084] 其它同实施例5。

[0085] 实施例8 凝胶剂外观观察

[0086] 肉眼即可观察及色度仪检测数据表明，以羟乙基纤维素为基质比羧甲基纤维素钠为基质的含有KGF2的凝胶剂外观白，见表1。两者的粘稠度为9.545-9.560pa.s。同时在4℃条件下存放30天，羧甲基纤维素钠为基质的凝胶剂出现分层；而羟乙基纤维素为基质的凝胶剂4℃条件下外观无变化。

[0087] 表1 二种凝胶剂白度数据

[0088]

[0089] 实施例9 测定凝胶剂的活性

[0090] NIH 3T3细胞株用完全培养基于37℃,5% CO2培养，细胞处于对数生长期，用于生4 5
物学活性测定。消化收集细胞，用完全培养液配成5.0×10-1.0×10 个/mL细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL, 37℃,5% CO2培养,24小时后换维持培养液（0.3-1%血清）换液，37℃,5% CO2培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液，加入供试品溶液，每孔100μL，37℃,5% CO2培养48小时，每孔20μL MTT溶液，37℃,5%CO2培养4-6小时。
弃去板中液体后，向孔中加入DMSO 100μL，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，于
570nm处测定吸光度，记录测定结果。计算供试样品的生物学活性。

[0091] 实施例10 测定凝胶剂的稳定性结果

[0092] 通过测定不同温度下，凝胶剂的稳定性结果表明（表2，表3），在4℃、25℃、37℃保存12个月，凝胶剂无霉变现象，其外观、pH等理化指标均未发生变化；载药植物油体凝胶剂的生物学活性在室温条件下，稳定性差，放置4个月后活性明显降低，而低温对载药植物油体凝胶剂的存放无明显影响。

[0093] 表2 以羟乙基纤维素为基质含有KGF2的植物油体凝胶剂在25℃稳定性实验结果[0094]

[0095] 表3以羟乙基纤维素为基质的含有KGF2的植物油体凝胶剂在4℃稳定性实验结果[0096]