杀线虫晶体蛋白基因cry003-131及应用

摘要

本发明属于微生物基因工程技术领域。公开了一种来自于苏云金芽胞杆菌的杀线虫晶体蛋白基因的分离、克隆及其对线虫的生物活性效果。本发明从野生型苏云金芽胞杆菌Sbt003（中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M2012168）中分离得到一个新的杀虫晶体蛋白基因cry003-131；该基因的编码产物为一种新的杀虫晶体蛋白Cry003-131；该蛋白对南方根结线虫有很高的杀虫活性。本发明还包括表达杀虫晶体蛋白基因cry003-131的苏云金芽胞杆菌重组菌BMB1362的制备，该重组菌已保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2012058。

权利要求

1.苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)cry003-131基因在制备杀线虫晶体蛋白中的应用，其特征在于该基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

2.一种含有如权利要求1所述的杀线虫晶体蛋白基因cry003-131的重组苏云金芽胞杆菌BMB1362，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2012058。

3.如权利要求1所述基因的应用，其特征是将杀线虫晶体蛋白制备细菌杀线虫剂。

4.如权利要求1所述基因的应用，其特征是将杀线虫晶体蛋白基因用于转基因微生物或转基因植物的遗传操作上。

5.权利要求2所述的重组苏云金芽胞杆菌BMB1362在防治植物寄生线虫中的应用。

6.权利要求2所述的重组苏云金芽胞杆菌BMB1362在制备细菌杀线虫剂中的应用。

7.权利要求2所述的重组苏云金芽胞杆菌BMB1362在转基因微生物或转基因植物的遗传操作中的应用。

说明书

杀线虫晶体蛋白基因cry003-131 及应用

技术领域

[0001] 本发明属于农业生物防治和农业微生物基因工程领域。具体涉及一个具有杀线虫活性的杀虫晶体蛋白基因的分离、克隆以及其编码的蛋白在微生物杀虫剂和转基因作物中的应用。

背景技术

[0002] 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一类广泛分布于环境之中的革兰氏阳性细菌，在其生长发育的中后期可以形成内生芽胞，并且伴随芽胞形成的同时，能产生一类对多种昆虫具有特意毒杀活性的杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Protein,ICPs)，从而有别于蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus,Bc)和炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis,Ba)。Bt首次由日本学者于1901年从家蚕幼虫体内分离得到，并于1915年正式命名为苏云金芽胞杆菌(喻子牛，1990)，目前已经有4万多株菌株被分离鉴定。实验证明，苏云金芽胞杆菌对包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲的500多种昆虫具有毒杀作用，另外，它还可以有效地防治原生动物门、线形动物门、扁形动物门、疟原虫、血吸虫、螨类等多种虫害(Schnepf H E,Crickmore N,Rie J V，Lereclus D,Baum J,Feitelson J,Zeigler D R,Dean D H.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev,62:775-806)，因此苏云金芽胞杆菌被广泛应用与农林业重要害虫的生物防治和转基因抗虫育种，并且保持了近90年的安全使用记录。

[0003] 1981年，Schnepf和Whiteley首次从苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种菌株HD-1中分离了第一个杀虫晶体蛋白基因，此后人们陆续发现并鉴定了多个新的杀虫基因，并且将其成功地应用到微生物杀虫剂及转基因作物的领域，因此克隆新的杀虫基因一直是苏云金芽胞杆菌研究领域中的热点。随着新基因数目的增多，Crickmore等学者于1996年正式提出了苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白按氨基酸序列同源性进行分类的新的分离系统，规定了命名规则及分类原则。其中 基因必须是来自苏云金芽胞杆菌，编码伴胞晶体蛋白的杀虫基因；cyt基因是一种编码具有溶细胞活性的伴胞晶体蛋白，并与已知编码Cyt蛋白有明显的序列相似性的基因。根据全长基因推导的氨基酸序列的同源性将杀虫晶体蛋白基因分为四个等级。级与级之间的分类界线为同源性95%、78%和45%(Crickmore N,Zeigler DR,Feitelson J,Schnepf E,van Rie J,Lereclus D,Baum J,Dean DH.1998.Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813)。

[0004] 杀虫晶体蛋白是Bt菌株最主要的杀虫物质，目前已有200多个 基因被鉴定克隆。传统的 基因的克隆方法主要包括：生物测定法、Southern杂交法、蛋白质测序法、构建文库法、各种PCR技术等，然而上述方法存在费时、费力及特异性差等缺点。申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室的叶 伟星博士利用第二代高通量测序技术建立了一种快速鉴定新型 基因的方法，从而有效地克服了上述缺点，具体方法参见图1及http://bcam.hzaubmb.org/BtToxin_scanner/。

[0005] 植物寄生线虫病是一种世界范围内普遍发生的由植物寄生线虫所引起的植物病害。据估计，植物寄生线虫造成全球主要农作物的年损失率约为12.3%，每年直接经济损失超过1000亿美元，在整个农业害虫造成的损失里几乎占到了一半，是排在全球气候变化和生态环境恶化之后的第三大农业影响因素（段玉玺,吴刚.植物线虫病害防治.北京:中国农业科技出版社.2002.）。根结线虫是植物寄生线虫中的一种，是植物根系定居性内寄生生物，是我国经济作物的重要病原线虫，其寄主植物超过3000种，分属于114科，其中以茄科、葫芦科、十字花科等植物受害尤为严重(汪来发等.根结线虫生物防治研究进展.南京林业大学学报(自然科学版),2002,26(1):64-68.)。目前用于防治根基线虫的方法有：植物检疫、农业防治、化学防治、生物防治。植物检疫是一种可以根治线虫的好方法，但其成本高，不适宜大规模推广；农业防治技术在理论上来说非常有效，但是在实际生产中存在严重的弊端；化学杀虫剂对环境污染严重，使用过程中对人畜不安全，许多杀虫剂已被禁用(刘维志,植物病原线虫学,北京:中国农业出版社,2000)。而与以上方法相比，生物防治由于具有稳定、经济、长效和相对安全的特点，同时还能除害增产、减轻污染、保护生态环境，逐渐受到广泛关注。上世纪80年代Bone等人通过研究首次证实了苏云金芽胞杆菌晶体蛋白对线虫有杀虫活性(Bone L W，Bottjer K P，Gill S S.Trichostrongylus colubriformis:Egg lethality due to Bacillus thuringiensis crystal toxin.Exp.Parasitol.,1985,60:314-322.)。之后，美国Mycogen公司的大量研究工作也进一步证实了苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对线虫的作用(Bradfish G A(1992).Process for controlling lepidopteranpests.EP19920920639.)。同时，我室的郭素霞博士也克隆得到了三个根结线虫具有杀虫活性的新基因。然而，随着Bt杀虫剂使用的不断推广，多种昆虫已产生了抗药性，另外，已有的杀虫晶体蛋白仍然不能有效地防治某些农业害虫，因此寻找并克隆更多新的杀虫晶体蛋白基因已经成为预防与控制目标害虫对Bt杀虫剂产生抗性的关键途径，是各种防治策略的核心内容。苏云金芽胞杆菌Sbt003是由申请人所在的农业微生物学国家重点实验室保存的野生型菌株，它能够在芽胞形成的同时产生球形、菱形及长米粒形的伴胞晶体，生物测定实验表明，其晶体蛋白对秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)和南方根结线虫(Meloidgyne hapla)具有较高的活性。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于从野生型苏云金芽胞杆菌Sbt003中克隆并表达了一个新型的杀线虫晶体蛋白基因cry003-131，生物测定实验表明该蛋白对线虫具有高毒力，预示着该基因在防治根结线虫杀虫制剂及转基因抗虫作物等研究领域有着良好的应用前景。

[0007] 实现本发明的技术方案如下所述：

[0008] 申请人从野生型苏云金芽胞杆菌Sbt003的基因组信息中分析并克隆到一个新的杀虫晶体蛋白基因 （详细信息请参见《具体实施方式》）。经过进一步测序发现本发明的 其编码区由3439个碱基组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。经序列分析发现， 编码的蛋白Cry003-131由1179个氨基酸组成，其蛋白质的序列如SEQ ID NO:2所示，预测分子大小为131kDa。通过构建苏云金芽胞杆菌重组菌及生物测定实验证明杀虫晶体蛋白基因 编码的蛋白Cry003-131对南方根结线虫具有毒杀作用。

[0009] 本发明提供的上述基因序列是一种新的杀线虫晶体蛋白基因，该基因在防治根结线虫杀虫制剂及转基因抗虫作物等研究领域具有广泛的应用价值。

[0010] 更详细的实施方案参见实施例中的描述。

附图说明

[0011] 序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白基因的核苷酸序列及其编码的蛋白质的序列。

[0012] 序列表SEQ ID NO:2是本发明分离克隆的苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白的蛋白质的序列。

[0013] 图1：是本发明实施例中杀虫晶体蛋白基因 的分析策略。

[0014] 图2：是本发明实施例中克隆载体pEMB1412的构建图及其物理图谱。

[0015] 图3：是本发明实施例中穿梭表达载体pBMB1422的构建图及其物理图谱。

[0016] 图4：是本发明实施例中杀线虫晶体蛋白基因 在重组菌BMB1362中表达纯化的SDS-PAGE电泳分析结果，图中：

[0017] M：蛋白质分子量标准；

[0018] 1：杀虫晶体蛋白Cry003-131晶胞混合物蛋白。具体实施方案

[0019] 以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，没有限制作用。有关实施例中所提到的DNA的标准操作方法和所使用的试剂均可参见《分子克隆实验指南》中所描述的方法(参见萨姆布鲁克和拉塞尔，2001，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。本发明中所涉及的其他各项实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日前的各种常用工具书、科技文献或相关说明书、手册等加以实施。

[0020] 实施例1苏云金芽胞杆菌Sbt003中杀虫晶体蛋白基因 的克隆

[0021] 本发明以野生型苏云金芽胞杆菌Sbt003（该野生型苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)Sbt003于2012年05月15日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO:M2012168）作 为杀线虫晶体蛋白基因 的来源菌株，该菌株能够在芽胞形成的同时产生球形、菱形及长米粒形的伴胞晶体，生物测定实验表明，其晶体蛋白对秀丽小杆线虫和南方根结线虫具有较高的活性。

[0022] 1.苏云金芽胞杆菌Sbt003总DNA的抽提

[0023] 采用常用的碱裂解法小量提取。其实验步骤如下：

[0024] 将野生型苏云金芽胞杆菌Sbt003于28℃摇床中进行过夜活化，按1/100(v/v)的接种量转接至7mL新鲜的LB液体培养基中，于28℃以12000r/min震荡培养至对数生长中期；将培养好的Sbt003菌液分装至1.5mL离心管内，收集菌体(12000r/min，1min)，并用STE溶液(10mM Tris·HCl[pH8.0]，1mM EDTA[pH8.0]，100mMNaCl)洗涤1次；将上述菌体悬于100μL溶液Ⅰ(50mM蔗糖，25mM Tris·HCl[pH8.0]，10mM EDTA[pH8.0])，加入20μL溶菌酶(50mg/mL)混匀，冰上静置2～3h或过夜；加200μL 2%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，轻缓混匀后于55℃干浴锅处理30min；加100μL 5MNaCl溶液，轻缓混匀后至于冰上，静置10min；以12000r/min离心5min，吸取上清液至一个新的离心管中，分别加入RNase和蛋白酶K至终浓度10μg/mL和10μg/mL，混合均匀后至于37℃水浴锅温浴30min；用苯酚/氯仿/异戊醇溶液(体积比为24:25:1，v/v/v)抽提2次；吸取上清，并加入2倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇，于室温静置30min或-20℃静置2h后，以12000r/min 4℃离心5min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀1次；常温干燥沉淀，用20～30μL TE溶液(10mM Tris·HCl[pH8.0]，1mMEDTA[pH8.0])溶解沉淀，即为制备的总DNA样品。

[0025] 2.苏云金芽胞杆菌Sbt003基因组序列测定及新型杀虫晶体蛋白基因预测[0026] 将上述抽得苏云金芽胞杆菌Sbt003的总DNA送深圳华大基因有限公司进行全基因组测序及序列拼接，根据测得的信息通过申请人所在华中农业大学农业微生物学国家重点实验室的网站中的Bt-toxin预测软件进行预测(http://bcam.hzaubmb.org/BtToxin_scanner/)，得到候选杀虫晶体蛋白基因。

[0027] 3.苏云金芽胞杆菌Sbt003中杀虫晶体蛋白基因 的克隆

[0028] 根据苏云金芽胞杆菌Sbt003基因组信息及生物信息学预测结果设计一对特异性引物，该引物对的DNA序列如下所示：5Ac-LF：5’-TGCATTCAATGCGCTAGGTAA-3’，5Ac-LR：5’-GTTTGAAGGGACTAAGGTGATTTC-3’，并以苏云金芽胞杆菌Sbt003总DNA为模板进行PCR扩增以获得目标基因，PCR反应的体系和程序如下：

[0029] 20μL反应体系包括：2μL 10×PCR反应缓冲液，1.6μL dNTP，各0.5μL特异性引物5B-LF和5B-LR(20mM)，0.2μL模板，0.2μL Ex-taq酶，加去离子水补充至20μL。

[0030] PCR反应程序和参数为：94℃，5min，1个循环；94℃，30s，52℃，30s，72℃，3.5min，30个循环；72℃，10min，1个循环；24℃，5min，1个循环。

[0031] 将上述扩增得到的目标片段通过PCR回收试剂盒(购自Omega公司产品)纯化回收后，进行T/A克隆，连接到载体pMD18-T(购自宝生物工程大连有限公司，即Takara公司产品)上，即得到含有杀虫晶体蛋白基因 的重组载体pEMB1412(见图2)。将上述连接产物转化大肠杆菌DH5α，对得到的重组子进行抽质粒及酶切验证，将验证正确的重组子送样测序(测序工作由北京奥科生物技术有限公司完成)。测序结果显示上述扩增得到的目标片段含有如序列表SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列，申请人将该基因命名为 (在本发明中，被命名的基因以斜体小写字母表示)。通过生物学软件分析发现，该基因可编码一段如序列表SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列和对应的氨基酸序列，预测其分子量为131kDa，申请人将其命名为Cry003-131(本发明中，被命名的蛋白以正体大写字母表示)。

[0032] 4.苏云金芽胞杆菌Sbt003中杀虫晶体蛋白基因 的序列分析

[0033] 经过进一步序列分析发现本发明的 其编码区由3439个碱基组成，其编码的蛋白Cry003-131由1327个氨基酸组成，预测分子大小为131kDa，在NCBI数据库上进行BlastP分析发现，该氨基酸序列与Cry5Ac蛋白有最高的相似性，其一致性为50%，根据晶体蛋白基因的命名原则(参见文献Crickmore N,Zeigler DR,Feitelson J,Schnepf E,van Rie J,Lereclus D,Baum J,Dean DH.1998.Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813)，该基因被归为II类新型 基因。

[0034] 实施例2杀线虫晶体蛋白基因 在重组菌株BMB1362中的表达纯化及生物活性测定

[0035] 1.杀线虫晶体蛋白基因 穿梭表达载体的构建

[0036] 将实施例1中的含有 基因的重组质粒pEMB1412和穿梭表达载体pHT304分别进行SacI和SphI双酶切，然后将酶切产物通过1%的琼脂糖凝胶分离出目标片段，并通过凝胶回收试剂盒(Omega公司产品)进行回收，利用T4 DNA连接酶(购自宝生物工程大连有限公司，即Takara公司产品))进行连接，从而获得了含有 基因的重组质粒pBMB1421(见图3)，将上述连接产物转化大肠杆菌DH5α，并对重组子进行酶切验证，与预期结果一致，即可确定已经将杀线虫晶体蛋白基因 插入到了穿梭表达载体pHT304（见图3）中。

[0037] 2.杀线虫晶体蛋白Cry003-131的表达及纯化

[0038] 将上述穿梭表达载体pBMB1422通过电转化的方式（具体方法参见文献D Peng,Y Luo,S Guo,H Zeng,S Ju,Z Yu,M Sun.2009.Elaboration of an electroporation protocol for large plasmids and wild-type strains of Bacillus thuringiensis.Journal of Applied Microbiology.106(6):1849-58）导入到表达宿主菌苏云金芽胞杆 菌BMB171（He J,Shao X,Zheng H,Li M,Wang J,Zhang Q,Li L,Liu Z,Sun M,Wang S,Yu Z.2010.Complete genome sequence of Bacillus thuringiensis mutant strain BMB171.J Bacteriol.192(15):4074-5）中，得到了含有 基因重组菌株BMB1362（见图3）。具体方法是：将苏云金芽胞杆菌BMB1362过夜活化后，转接到40mLICPM培养基(蛋白胨0.6%，葡萄糖0.5%，CaCO3 0.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，K2HPO4 0.05%，pH7.0) 中，于28℃摇床培养32-48h，至芽胞基本脱落。12000r/min 4℃离心2min收集菌体，依次用1M NaCl-10mMEDTA溶液及ddH2O分别洗涤沉淀3次，然后向洗涤后的晶胞混合物加入适量的
50mM Na2CO3(pH10.5，含3%β-巯基乙醇)，充分混匀，于37℃处理40min。12000r/min，4℃离心2min收集上清，在离心两次，以充分去除芽胞及营养体细胞。用4M NaAc-HAc溶液(pH4.5)调节溶液pH值至晶体蛋白等电点附近，冰上沉淀4-5h或过夜。12000r/min，4℃离心10min收集沉淀，并用无菌去离子水洗涤3次，于-80℃保存备用，使用前用碱性Heps溶液溶解。将最终的纯蛋白进行SDS-PAGE检测，结果如图4所示，目标蛋白大小与预期大小基本吻合，证明本发明的杀线虫晶体蛋白Cry003-131在宿主菌苏云金芽胞杆菌BMB171（文件见上）中得到了成功表达。申请人将上述重组菌命名为重组苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis） BMB1362，于2012年3月6日将其送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCNO：M2012058。

[0039] 3.杀线虫晶体蛋白Cry003-131对南方根结线虫生物活性的测定

[0040] 以南方根结线虫的二龄幼虫作为靶标生物检测杀虫蛋白Cry003-131对线虫的生物活性。取被南方根结线虫感染过的番茄根，将番茄根用自来水轻轻冲洗干净，从根部将南方根结线虫卵块剥离出来，用0.5%NaClO对卵块消毒2次，并用去离子水洗涤3次，然后置于25℃培养箱中孵化3-5天，孵化出的南方根结线虫即可作为生物测定的靶标。生物测定实验是在96孔板中进行，每孔中加入40-50头线虫，生测体系为100μL(具体方法参见：余子全等，苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫生物测定方法的建立和高毒力菌株的筛选，农业生物技术学报，2007（15）：867-871)。整个实验设3个浓度梯度，每个浓度设3个重复，用去离子水作为阴性对照。5天后统计死亡率，将死亡率校正后换算成几率值，结果显示本发明的杀线虫晶体蛋白Cry003-131在浓度为400μg/mL时对南方根结线虫的校正致死率为44.44%。

[0041] 以上实验结果说明本发明的晶体蛋白Cry003-131对南方根结线虫具有高毒力，该蛋白为防治根结线虫提供了一种新的资源。