吸附金和锑的赖氨酸芽孢杆菌

摘要

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株具有锰氧化能力的细菌M14及其在吸附回收金方面的应用。本发明的特征是从锰污染的土壤中分离得到一株对可溶二价锰有氧化作用的细菌M14。该菌株可以将可溶的二价锰离子氧化成不溶于水的锰氧化物，再利用这种锰氧化物去吸附水中的三价金离子和三价锑离子，从而达到贵重金属的吸附回收及重金属污染治理的目的。本发明菌株被命名为Lysinibacillus sp.M14，属于一种锰氧化物产生细菌，该菌保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2012084。初步研究表明，本发明的菌株在吸附水中的重金属金和有毒金属锑方面具有良好的应用前景。

权利要求

1.一种吸附和回收重金属金和锑的锰氧化物产生菌赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)M14菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M2012084。

2.一种吸附和回收重金属金和锑的锰氧化物产生菌赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)M14菌株在吸附和回收重金属金和锑中的应用，其特征在于，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M2012084。

说明书

吸附金和锑的赖氨酸芽孢杆菌

技术领域

[0001] 本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株对二价锰离子具有氧化作用的锰氧化物产生菌，即锰氧化物产生菌赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)M14菌株的筛选、其代谢产生生物锰氧化物的能力，本发明还包括该菌在吸附回收重金属金和氧化吸附锑方面的用途。

背景技术

[0002] 重金属一般以天然浓度广泛存在于自然界中，但由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少含重金属的废液如金、银、铂、钌、锑等，大量含重金属的废液被排放，不仅造成了重金属资源的浪费还污染了环境。黄金是一种十分贵重的金属，其矿藏资源十分稀少，在地壳中的含量大约只占一百亿分之五，而且非常分散，目前黄金价格越来越昂贵，所以从含金溶液中吸附金成为了一种回收利用贵重金属的重要途径。锑是一种广泛存在的毒性金属，环境中主要以正三价和正五价形式存在，锑对生物和人体有慢性毒性，严重的还会致癌(何孟常，万红燕，2004)，所以对锑的解毒变得日益重要。

[0003] 目前已知，从浸金液中回收金的主要方法有①置换沉淀法：置换沉淀技术主要有锌粉置换和铝粉置换两种方法。虽然这种方法对金的回收率很高，但同时其成本也很高。②活性炭吸附法：炭吸附技术在是指在浸出槽或吸附槽中加入活性炭，用活性炭的吸附作用从矿浆中吸附回收金。此法可直接用于从矿浆中回收金，但这种方法的推广与应用较难。
③树脂吸附法：金在强碱、强碱与弱碱混合型树脂上能有效的被吸附和解吸，虽然此法有载金量高、用量少等优势，但其强腐蚀性及毒性，极易造成二次污染。④溶剂萃取法：是指利用醇类、醚类、酮类、胺类等有机试剂作为金的萃取剂，但其对操作人员的身体的损伤极大。⑤电积冶金法：金属的浸出过程实质上是金属与氧化剂之间的一个氧化还原反应，是将该浸出过程设计为一原电池，但此方法有成本高、易造成二次污染、适用范围窄等缺点。

[0004] 而目前常用的地下水除锑方法有化学沉淀法、电化学方法、离子交换法、化学合成锰氧化物去除法等。化学沉淀法是指通过外加化学试剂等使水中的锑离子形成复合物沉淀下来，以达到去除的目的。电化学方法是指让酸性废水通过充满焦炭和铁屑的柱状反应器，使金属离子如锑在阴极(焦炭)发生还原反应形成单质而滞留，然后出水加碱中和。离子交换法是利用离子交换树脂和活性氧化铝的强吸附能力来吸附重金属离子，达到了百分之九十以上，但缺点也十分明显，如适用范围窄，成本高，处理量小，易造成二次污染等。

[0005] 在申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室的前期工作中，申请人已经发现几株锰氧化细菌对多种重金属(如As、Ni、Co、Cd、Zn等)具有很强的吸附、沉淀等作用(王文明，2008)，而且生物锰氧化物还可以将毒性强的As(III)氧化成毒性弱的As(V)然后吸附去除，因此，生物锰氧化物在重金属吸附回收及重金属污染治理中具有很高的应用潜力。如专利号为2008101979019(发明名称：净化重金属污染的芽胞杆菌MK3-1及用途)的专利文献中涉及到一株对锰有氧化吸附作用的产生菌MK3-1，该菌对二价锰氧化及吸附有一定的效果，主要用于二价锰离子的氧化吸附，并不涉及对金和锑离子的吸附。目前利用生物锰氧化物对金和锑的氧化吸附的研究很少，本发明分离的菌株就是利用其产生的生物锰氧化物来吸附金和锑离子的。

发明内容

[0006] 本发明目的在于克服现有技术的缺陷，分离得到一株吸附回收重金属金和锑的锰氧化物产生菌赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp)M14，该菌株可以将可溶的二价锰离子氧化成不溶的锰氧化物，利用这种生物锰氧化物来吸附溶液中的金及氧化吸附锑，可应用于对溶液中贵重金属的吸附或净化重金属污染的水体。

[0007] 本发明通过以下技术方案实现：

[0008] 本发明人从中国天津市西青区玛钢厂锰原料仓库的表层土壤样品中分离、筛选到一株吸附回收重金属金和锑以及锰的锰氧化物产生菌赖氨酸芽孢杆菌M14，其分类命名Lysinibacillus sp，申请人于2012年3月15日将该菌株送交中国.湖北.武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2012084。

[0009] 本发明的锰氧化物产生细菌M14的筛选方案参见图1所示的技术流程。所述M14菌株的分离物来自中国天津市西青区玛钢厂锰原料仓库的表层土壤样品，加一定浓度(见后面的详细描述，下同)MnCl2进行富集培养，再对富集培养的土样进行稀释并涂布含20mmol/L羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanic acid，简称HEPES，调pH至7.0)和0.3mmol/L MnCl2的K固体培养基平板(参照文献：van Waasbergen，1993)，28℃温箱培养一周。挑取表面为棕褐色的菌落划线得单克隆，再用LBB法(Krumbein et al.,1973)检测以确定是否为锰氧化菌，再对检测出的锰氧化菌做16S核糖体RNA基因(16S rDNA)测定等相关鉴定工作，最终得到一株吸附和回收重金属金和锑的锰氧化物产生菌M14，申请人将其命名为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)M14菌株。

[0010] 本发明的积极效果是：

[0011] 目前，由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少像金和锑等重金属的废液，不仅造成了资源的浪费还引起了严重的环境污染。本发明分离筛选到的Lysinibacillus sp.M14产生的生物锰氧化物可以吸附金离子及氧化吸附锑离子，从而达到重金属的去除目的。因此，生物锰氧化在贵重金属的吸附回收及重金属污染的治理和修复中具有很高的应用潜力。

[0012] 本发明与本申请人前期工作的比较，其对比效果如表1所述。

[0013] 表1 本发明与专利号为2008101979019文献相比具有的积极效果

[0014]

[0015] 更详细的技术步骤见《具体实施方式》所述(刘颜军，周静晓，王革娇，2009)。

附图说明

[0016] 序列表SEQ ID NO：1是本发明分离的(Lysinibacillus sp.)M14基因组16S rDNA基因的核苷酸序列。

[0017] 图1：是本发明的锰氧化物产生菌(Lysinibacillus sp.)M14的分离、筛选技术流程图。

[0018] 图2：是本发明的锰氧化物产生菌(Lysinibacillus sp.)M14菌落的LBB检测结果。图中：菌株M14在含MnCl2的K培养基上培养4d后的菌落形态：褐色为肉眼观察菌落颜色；亮蓝色为LBB指示法检测的菌落颜色。

[0019] 图3：是本发明的锰氧化物产生菌(Lysinibacillus sp.)M14菌体细胞的扫描电镜图片。

[0020] 图4：是本发明的锰氧化物产生菌(Lysinibacillus sp.)M14氧化去除锰的效果图。图中：M14菌对Mn(II)的锰氧化、去除曲线标记：◆,Mn(II)去除曲线；█,Mn(II)吸附曲线；▲,Mn(II)氧化曲线；○，空白对照。

[0021] 图5：是本发明的锰氧化物产生菌(Lysinibacillus sp.)M14产生物锰氧化物吸附金的效果图。图中锰氧化物及菌体对Au(III)的吸附曲线标记：■，加入生物锰后上清液中Au(III)浓度的变化曲线；●，空白对照，不加任何锰氧化物，Au(III)的初始浓度为200μM。

[0022] 图6：是本发明的锰氧化物产生菌(Lysinibacillus sp.)M14产生物锰氧化物氧化吸附锑的效果图。生物锰氧化物对Sb(III)的氧化吸附曲线中标记：■，空白对照，初始Sb(III)浓度为30μM，无任何锰氧化物，溶剂为去离子水；▲，加入生物锰后上清液中Sb(III)浓度的变化曲线；◆，加入生物锰后上清液中Sb(V)浓度的变化曲线。

具体实施方式

[0023] 实施例1：从锰污染土壤中分离并鉴定赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)M14

[0024] (1)样品采取：2007年6月下旬从中国天津市西青区玛钢厂锰原料仓库的表层土壤中采集得到本试验的锰土样品。

[0025] (2)样品富集：取100g的土样，向土样中添加无菌MnCl2溶液使其终浓度为989.55mg/Kg，轻轻搅匀置28℃温箱中培养一周，注意补加无菌水，确保样品湿度。

[0026] (3)锰氧化菌分离：精确称取经MnCl2富集过的土样10g于装有90ml无菌生理盐水的三角瓶中，置28℃摇床中振荡半小时，再依次取1ml加入到9ml无菌生理盐水中逐步稀-2 -3 -4释至10 ，10 ，10 ，分别取0.1ml涂布含20mmol/L羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanic acid，简称HEPES，调pH至7.0)和0.3mmol/L MnCl2的K固体培养基平板(van Waasbergen et al.,1993)，每个稀释度涂布3个平板，置28℃温箱中培养一周，将表面为棕褐色的菌落定为疑似锰氧化菌，将平板置4℃冰箱中待用。上述K固体培养基配方如下：酵母膏0.5g，蛋白胨2g，琼脂15g，1L人工海水(1L人工海水:NaCl
13.14g，KCl 0.56g，MgSO4·7H2O 9.24g，CaCl20.83g)。

[0027] (4)划线分离：将步骤(3)中得到的疑似锰氧化菌挑取不同的菌落划线，确保得到单克隆，划线用K培养基平板，待菌长出后置于4℃冰箱中待用并用甘油冷冻管保存一份于-80℃冰箱中。

[0028] (5)菌株锰氧化性质鉴定：将步骤(4)中得到的单克隆转接到含20mmol/L HEPES(pH 7.0)和0.3mmol/LMnCl2K固体培养基平板中，置28℃培养箱中培养，待平板上产生棕褐色菌落时，将Berbelin blue-I(LBB,N.N'-Dimethylamino-p,p'-triphenyhnethane-o"-sulphonicacid)滴在棕褐色菌落上检测其氧化性。若溶液颜色没有变化则说明该菌没有锰氧化性，若颜色由浅蓝色变为深亮蓝色则说明该菌有锰氧化性(见图3，LBB是氧化3+/4+ 2+
还原剂的染色剂，Mn +LBB(reduced)>Mn +LBB(oxidized)，被氧化的LBB为深亮蓝色)。
LBB的配制方法如下：用100ml的40mmol/L醋酸水溶液4℃暗处过夜溶解40mg的LBB。

[0029] (6)锰氧化菌的分类鉴定：使用菌落PCR方法扩增16S rDNA：用牙签挑取单克隆的菌株于50μL无菌双蒸水中混匀；100℃热击5min，-20℃5min，冷热击重复2～3次后，12000r/min离心3min，得到的上清液直接用作为PCR扩增模板，扩增体系为50μL体系，通用引物：27(5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3')和1492R(5'GGYTACCTTGTTACGACTT3')。扩增条件为：预变性，95℃，5min；变性，94℃，45sec；退火，49℃，45sec；延伸，72℃，1.5min变性-延伸，35个循环；延伸：72℃，10min。得到如序列表SEQID NO：1所示的核苷酸序列，序列长度为1395bp。用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳来检测PCR产物。用购买的上海赛百威基因技术有限公司生产的柱式DNA回收试剂盒对PCR产物纯化，按照说明书操作，送至三博远志公司进行测序。将得到的16S rDNA基因序列(序列表见SEQ ID NO：1)与GenBank文库中已有序列进行比对(比对结果见图1)。

[0030] 本发明分离的锰氧化物产生菌赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.M14)的菌学特征：

[0031] 菌体短杆状，革兰氏阳性菌，适宜生长温度28-30℃，适宜pH 7.0-7.5，在不含MnCl2的K固体培养基上，菌落成圆形，乳白色，凸起，表面湿润，边缘不整齐。在含0.3mmol/L的MnCl2K培养基上，菌落表面为棕褐色(见图2)；该菌扫描电镜图见图3。

[0032] 赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)M14的保藏方法如下：

[0033] Lysinibacillus sp.M14可以在K液体或固体培养基(配方同上)上28℃培养，培养后可在4℃下作短期保藏。若长期保藏，可使用甘油冷冻管或冷冻干燥管(赵斌，何绍江，2002)保藏本菌株比较合适。

[0034] 实施例2：锰氧化物产生菌赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)M14的锰氧化去除曲线

[0035] 准备3瓶已灭菌的液体K培养基(配方同上)，每瓶100mL。加入20mmol/L已过滤除菌的羟乙基呱嗪乙硫磺酸(HEPES)，同时加入1mol/L的无菌MnCl2母液使终浓度为0.3mmol/L。接着接种对数期的(OD600值约为0.7)M14菌液，按体积比1％的接种量接种。
混匀后立即取样10mL，该样作为首次取样，置于干净的离心管中。将各三角瓶置于28℃，
160r/min摇床中震荡培养。此后取样间隔为24h，该实验设置三重复。取样结束后样品作以下处理：

[0036] 1)每次取得的10mL样品，以8000r/min高速离心6min，保留上清液，用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤，滤液置于-20℃保存。申请人将该部分溶液中存在的Mn(II)称之为“剩余的Mn(II)”。

[0037] 2)离心得到的沉淀按以下方法处理：用去离子水重复3次洗涤离心后，加入4mL浓度为0.1mol/L的CuSO4溶液，用移液器将菌体打散，以160r/min的速度振荡12h。然后取出，管中的菌悬液用去离子水定容至10mL，8000r/min高速离心6min，保留上清液，用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤，滤液置于-20℃保存。申请人将该部分溶液中存在的Mn(II)称之为“吸附的Mn(II)”。

[0038] 3)剩余的沉淀做如下处理：再次用去离子水重复3次洗涤后，加入4mL盐酸羟氨母液(0.1mol/L)，用移液器将菌体打散，以160r/min的速度振荡12h。然后取出，管中的菌悬液用去离子水定容至10mL，8000r/min高速离心5min后，保留上清液，用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤，滤液置于-20℃保存。申请人将该部分溶液中存在的Mn(II)称之为“氧化的Mn(II)”。

[0039] 用火焰原子吸收分光光度计测定样品中所含有的Mn(II)的浓度，以测得的样品的Mn(II)浓度为纵坐标，以时间为横坐标作图。

[0040] 在M14菌对Mn(II)的氧化去除实验中，因锰氧化菌对到浓度的Mn(II)会产生应激反应，分泌蛋白类物质，所以为更好地了解该菌株氧化去除Mn(II)的趋势，选择的Mn(II)初始浓度为30mM。图4为M14菌氧化去除Mn(II)的曲线图，从图中可以看到，本发明分离的M14菌株对锰的去除率随着时间的推移不断加大，尤其是在3～7d时，去除速率最快，可能是由于这期间菌株开始氧化溶液中的Mn(II)，产生锰氧化物，在10d时，“剩余的Mn(II)”浓度达到最低，去除率达到92.62％。从反应开始时，开始有Mn(II)被吸附在菌体或锰氧化物表面，在5d前呈不断增大趋势，但5d后则有所降低，可能是有部分被吸附的Mn(II)被氧化，最终，“吸附的Mn(II)”浓度约为0.04mM。申请人发现，锰氧化曲线一直处于不断上升趋势，在3～7d时，溶液中剩余的Mn(II)不断减少，但“氧化的Mn(II)”却不断增加，而吸附的Mn(II)并没有大幅度增加，说明绝大部分的Mn(II)被氧化了，在10d时，本发明分离的M14菌氧化效率达到最高，约为82.66％(见图4)。

[0041] 实施例3：赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)M14产生物锰氧化物在含金溶液中吸附金能力的测定

[0042] 将本发明的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)M14菌体接种于含5mM Mn2+的K培养基(配方同上)中，置于28℃,150r/min的摇床中培养10d，培养基总量为3000mL，待培养基中有棕黑色沉淀生成后，以8000r/min高速离心培养物，去掉上清，将沉淀在-56℃下冷冻干燥、研磨、过100目筛。将1.87g的生物锰氧化物加入到装有100mL双蒸水的三角瓶中，三角瓶在实验前需包上黑色塑料以防止Au(III)见光变色，待摇匀后加入200μL100mmol/L的氯金酸，混匀后取样3mL作为首次取样。将各三角瓶置于28℃,150r/min的摇床中，前1h，每隔0.5h取一次样，其后每隔1h取一次样离心过滤。取样6h，每次取出的
3mL悬浮液在8000r/min高速离心5min，保留上清液，用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤，滤液置于干净的5ml离心管中，-20℃冻存待检测。取样结束后，用火焰原子吸收分光光度计测定剩余Au(III)浓度。

[0043] 以时间为横坐标，Au(III)浓度为纵坐标作图，绘制生物锰氧化物吸附金体系中剩余的Au(III)的变化曲线(见图5)。

[0044] 本实施例设两个反应体系，分别为空白对照和生物锰氧化物吸附体系，各反应体系按实施例3所述方法进行实验，M14菌生成的锰氧化物收集、预处理后对Au(III)的吸附能力见图5。

[0045] 在空白实验中，含金溶液中没有添加任何锰氧化物，Au(III)的初始浓度为200μM，在6h内，溶液中As(III)的浓度始终处于较稳定状态，但比初始浓度降低了约
21.53μM Au(III)，分析可能是通过其他方式被吸附，如三角瓶瓶体。

[0046] 生物锰氧化物对Au(III)吸附体系由100ml双蒸水、200μM Au(III)及1.87g M14菌产生物锰氧化物组成。在刚开始的0.5h内，Au(III)吸附量快速上升，在1h后，生物锰氧化物对Au(III)的吸附达到平衡，吸附效率接近100％。

[0047] 实施例4：赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)M14产生物锰氧化物在锑溶液中氧化吸附锑能力的测定

[0048] 利用实施例3中所述的方法培养生物锰氧化物及对其进行处理，将1.87g的生物锰氧化物加入到装有100mL双蒸水的三角瓶中，待摇匀后加入30μL 100mmol/L的酒石酸锑钾，混匀后取样1mL作为首次取样，实验设置三重复。将三角瓶置于28℃,150r/min的摇床中，0.5h时取一次样，其后每隔2h取一次，取样12h，每次取出的1mL悬浮液在8000r/min高速离心5min，保留上清液，用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤，滤液置于干净的2ml离心管，-20℃冻存待检测。取样结束后，用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法HPLC-HG-AFS(High performance liquid chromatography hydride generation atomic fluorescence spectrometry)测定剩余Sb(III)及Sb(V)浓度。

[0049] M14菌生成的锰氧化物收集、预处理后对Sb(III)的氧化吸附能力见图6。生物锰氧化物氧化吸附Sb(III)体系中，上清液中Sb(III)浓度在30min内急速下降，从初始30μM减少至6.5μM，其后在6h内上清液中Sb(III)浓度减少为0μM，即Sb(III)被完全去除。Sb(III)的减少伴随着Sb(V)的产生，但Sb(V)的产生迟缓于Sb(III)的减少，Sb(III)浓度在0～6h内有急剧的下降过程，这时间段内上清液中基本没有检测到Sb(V)，在6h后，上清液中Sb(V)浓度才有所上升，但浓度也十分低，说明绝大部分的Sb被生物锰氧化物吸附了，包括Sb(III)和Sb(V)。

[0050] 在空白实验中，含锑溶液中没有添加任何锰氧化物，在12h内，溶液中Sb(III)的浓度始终保持稳定，但比初始浓度降低了约7μM Sb(III)，分析可能是通过其他方式被吸附，如三角瓶瓶体的吸附。

[0051] 在M14产生物锰氧化物对锑的氧化吸附实验中发现，生物锰氧化物在6h内能有效去除30μM的Sb(III)，达到了对锑的解毒作用。

[0052] 参考文献

[0053] 1.何孟常，万红燕.环境中锑的分布、存在形态及毒性和生物有效性.化学进展，2004，16(1)：131-135

[0054] 2.刘颜军，周静晓，王革娇.锰氧化菌Bacillus sp.MK3-1的Mn(II)氧化特性和除锰能力研究.微生物学通报，2009，36(4)：1-6

[0055] 3.王文明.深海锰氧化细菌Brachybacterium sp.Mn32对Mn(II)的氧化及生物锰氧化物对Zn(II)、Ni(II)的吸附研究.[硕士学位论文].武汉：华中农业大学图书馆，http://www.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx？dbcode＝CMFD&QueryID＝0&CurRec＝18&dbname＝CMFD0911&filename＝2008203105.nh&uid＝WEEvREcwSlJHSldTTGJhYlN2V1pHa3VQdHhQTXNLZ0dJcCtidUhx Y1hJUHdRS0N1M0x1NTdZN3NaMVpvWmRROA＝＝，2008[0056] 4.赵斌，何绍江.微生物学实验.第一版.科学出版社.2002：202-205

[0057] 5.Krumbein W E et al.A new method for the detection and enumeration of manganese oxidizing and reducing microorganisms.Helgoland MarineResearch,1973,25:347-356

[0058] 6.van Waasbergen L G,Hildebrand M,Tebo B M.Identification and characterization of a gene cluster involved in manganese oxidation by spores of the marine Bacillus sp.strain SG-1.Journal of Bacteriology,1996,178(12):3517-3530