高效多环芳烃降解菌鞘氨醇杆菌工程菌株及其构建方法

摘要

本发明涉及多食鞘氨醇杆菌工程菌株（Sphingobacterium multivorum）SWH-21，菌种保藏编号：CGMCC No.6883。多食鞘氨醇杆菌工程菌株的构建方法是利用多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951，通过Tn5转座，将来自鞘氨醇杆菌的环羟化双加氧酶基因通过自杀性质粒整合到多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951的染色体上，使得到的微生物在降解石油及多环芳烃的基础上，增强和扩大其降解能力和降解范围，为获得高效降解石油及多环芳烃的工程菌株奠定了基础。

权利要求

1.多食鞘氨醇杆菌工程菌株（Sphingobacterium multivorum）SWH-21，申请人已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2012年11月26日，保藏编号：CGMCC No.6883。

2.权利要求1所述的多食鞘氨醇杆菌工程菌的用途，其特征在于用于石油及多环芳烃的降解。

3.权利要求1所述的多食鞘氨醇杆菌工程菌的用途，其特征在于用于生物修复菌剂的制备。

说明书

高效多环芳烃降解菌鞘氨醇杆菌工程菌株及其构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种高效多环芳烃降解菌鞘氨醇杆菌工程菌株及其构建方法。

背景技术

[0002] 多环芳烃（PAHs）是一类广泛分布于环境中的含有2个苯环以上的有毒有害污染物，是石油的重要组成部分，由于潜在毒性、致癌性及致畸诱变作用，通过生物累积及食物链传递，给生物体、生态环境和人体健康带来极大危害，已引起各国环境科学家的极大重视。土壤生物修复，尤其是微生物降解，被认定是清除自然界中石油及多环芳烃的主要途径。

[0003] 许多PAHs化合物均能被一种微生物或一个微生物群体全部或部分降解。积累在环境中引起污染的许多有机化合物，最初能抗微生物袭击，难以被降解。当环境条件发生变化后，某些微生物通过自然突变形成新的菌种，这些微生物经过一系列突变、基因重组及其他的遗传调控来创造新的酶促功能，以作用于外来化合物及其以后的代谢产物。这类基因发生遗传重组，或者和转移质粒结合，形成具有降解能力的质粒，也可以通过导入质粒的方法创造新菌株，获得新的降解能力。污染物的生物修复作用，本质上是开发利用微生物的新陈代谢能力及基因的多样性，把污染物转化为无污染的终产物，重新进入生物地球化学循环。

[0004] 微生物因其较高的繁殖速度、代谢的多样性、遗传变异性，微生物的酶系能够以最快的速度适应外界环境的变化，能在各种不同的自然环境中生长，具有降解或转化有机污染物的巨大潜力。在过去的几十年，学者们已筛选出多种石油降解菌，包含细菌和真菌共100余属，200多种。本实验室从辽河附近石油污染土壤中分离获得了一株多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951，以其为材料，采用PCR技术，从中分离了环羟化双加氧酶编码基因，利用该基因构建了自杀性重组载体，并利用三亲杂交将该基因整合到多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951染色体DNA中，为获得高效降解石油及多环芳烃的工程菌株奠定了基础。

[0005] 术语解释

[0006] cfu/ml：每毫升样品中含有的微生物群落总数。

[0007] cfu/g：每克样品中含有的微生物群落总数。

发明内容

[0008] 本发明针对现有技术的不足，提供一种高效降解多环芳烃的多食鞘氨醇杆菌工程菌株及其构建方法。

[0009] 本发明提供一株多食鞘氨醇杆菌工程菌株（Sphingobacterium multivorum）SWH-21，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2012年11月26日，保藏编号：CGMCC No.6883保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

[0010] 本发明利用的原始菌株是在辽河油田污染土壤中获得的一株多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951，该菌株对石油和多环芳烃具有一定的降解效果，周石油降解率为46.3%，多环芳烃降解率为31.6%。本发明应用基因工程手段，通过Tn5转座，将来自鞘氨醇杆菌的环羟化双加氧酶编码基因通过自杀性质粒整合到菌株CGMCC No.1951的染色体上，增强和扩大多食鞘氨醇杆菌的多环芳烃降解能力和降解范围。

[0011] 上述鞘氨醇杆菌的具体菌株不做限定，凡具有环羟化双加氧酶活性的鞘氨醇杆菌均可。例如，保藏编号为CGMCC No.4400，CGMCC No.3326，CGMCC No.1951等鞘氨醇杆菌菌株均可。

[0012] 本发明所述的多食鞘氨醇杆菌工程菌株的构建方法，包括下列步骤：

[0013] 1）重组质粒pUTPHNA的构建

[0014] 根据环羟化双加氧酶编码基因序列设计引物phnNotl-F和phnNotl-R，利用PCR技术扩增环羟化双加氧酶编码基因，利用NotI分别酶切环羟化双加氧酶编码基因和质粒pUT-Km1，再将酶切后的环羟化双加氧酶编码基因和质粒pUT-Km1连接，转入大肠杆菌，得到重组质粒pUTPHNA；

[0015] 2）三亲杂交

[0016] 采用三亲杂交方法，在助手质粒pRK600的存在下，将步骤1）得到的重组质粒pUTPHNA转入多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951的染色体上，得到了42个单菌株。

[0017] 3）筛选

[0018] 通过无机盐培养基平板培养、PCR扩增和电泳技术和菲降解能力检测对步骤2）的58个单菌株进行筛选，获得获得1个对菲降解能力最高的单菌株，即为多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883。

[0019] 以上所说的多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883的筛选主要采用以下三个步骤进行：

[0020] （1）无机盐培养基平板检测

[0021] 将获得的58个转化子同时转接到含有卡纳霉素（Kana，100μg/ml）无机盐培养基平板上，28℃培养48h，共得到42株单菌落；

[0022] 上述步骤中所述培养基如下：

[0023] 无机盐培养基（/L）：Na2HPO4•2H2O 8.5g，KH2PO4 3.0g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1.0g，MgSO4•7H2O 0.5g，CaCl2 14.7g，CuSO4 0.4mg，KI 1.0mg，MnSO4•H2O 4.0mg，ZnSO4•7H2O4.0mg，H3BO3 5.0mg，H2MoO4•2H2O 1.6mg，FeCl3•6H2O 2.0mg。菲加到预先灭菌的无机盐培养基中，使其终浓度为0.025%，待用。

[0024] 固体培养基（g/L）：在无机盐培养基中加入10gNaCl，10g蛋白胨，5g酵母粉，10g琼脂粉。

[0025] （2）PCR扩增和电泳技术

[0026] 利用phnS-F和phnS-R通过PCR扩增和电泳技术对上述步骤（1）得到的42个单菌株进行突变子筛选，得到42个单菌株；

[0027] （3）菲降解能力检测

[0028] 采用气相色谱检测各个菌株对菲的降解能力，对上述步骤（2）得到的42个单菌株进行进一步的筛选，获得1株对菲降解能力最高的菌株，即为本发明的目标产物多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883。

[0029] 上述步骤1）的引物phnNotl-F和phnNotl-R优选序列如下：

[0030] phnNotl-F：5’-CGGCGGCCGCAGGAGGTTGATATGAGCGGCG-3’

[0031] phnNotl-R：5’- CGGCGGCCGCTCATTCGGCCGCGTTAAGCT-3’

[0032] 上述步骤1）中所用的质粒pUT-Km1由马塔构建，参见马塔，1990，用于革兰氏阴性菌外源基因染色体整合的含有非抗选择标记的转座载体的构建，细菌学报（Marta Herrero et al, Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative Bacteria, Journal of Bacteriology, 1990），该质粒的特性在于：

[0033] （1）该质粒上含有卡那霉素抗性编码基因；

[0034] （2）该质粒具有Tn5转座子；

[0035] （3）该质粒Tn5转座序列中含有一个NotI酶切位点，用于携带外源基因，该酶切位点序列如下：GCGGCCGC。

[0036] 上述步骤1）中所说的大肠杆菌是含有λ-pir的大肠杆菌，具体选自E.coliDH5α（λ-pir），E.coli SM10（λ-pir），E.coliS17-1（λ-pir）或E. coli MV1190（λ-pir）等。

[0037] 上述步骤3）中所用的引物phnS-F和phnS-R，优选序列如下：

[0038] phnS-F:ACGCCACACTCGTAGACA

[0039] phnS-R:TACAGGAACGAGCGATTG

[0040] 上述步骤2）中所采用的三亲杂交方法为现有技术，具体参见周洪友，荧光假单胞菌2P24抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚生物合成的基因调控研究，中国农业大学博士学位论文。

[0041] 上述步骤2）中的pUT-Km1包含Tn5，Tn5作为转座子可以交错切开靶DNA，转座子两端连接到靶DNA的凸出单链上，最后填补空缺完成转座，这样就使几丁质酶基因整合到多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951染色体上。

[0042] 本发明重组的多食鞘氨醇杆菌工程菌株（CGMCC No.6883）的生物学特性研究：

[0043] （1）对得到的多食鞘氨醇杆菌工程菌株（CGMCC No.6883）进行稳定性测定[0044] （2）对得到的多食鞘氨醇杆菌工程菌株（CGMCC No.6883）进行生长曲线测定，参见图7。

[0045] （3）对多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.1951及其得到的工程菌株CGMCC No.6883各种多环芳烃的降解能力检测。

[0046] 以上述多食鞘氨醇杆菌（CGMCC1951）及获得的工程菌株（CGMCC6883）为主要成分的生物菌剂，由以下步骤分别进行制备：

[0047] （1）取多食鞘氨醇杆菌及CGMCC No.1951及工程菌株CGMCC No.6883接种于LB固体培养基上，28℃培养24h，将长出的单菌落转接到LB液体培养基内，28℃，180rpm摇床培养16h，最终得到多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951及工程菌株CGMCC No.6883的菌液。

[0048] 上述步骤（1）中LB培养基成分如下：

[0049] LB液体培养基（/L）：蛋白胨 10g，酵母抽提物 5g，NaCl 10g，pH 7.2[0050] LB固体培养基（/L）：在LB液体培养基中添加10g琼脂粉。

[0051] 上述培养基用于培养多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883时需要添加卡那霉素，卡那霉素使用浓度100μg/ml。

[0052] （2）将步骤（1）中制得的菌液按照体积比5%的比例转接到液体发酵培养基中，28℃，180rpm培养16h，最终得到多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883的发酵菌液。

[0053] 所述步骤（2）中发酵液中的有效活菌数为109cfu/ml。

[0054] 上述步骤（2）中液体发酵培养基成分如下：MgSO4•7H2O 0.5%，NaCl 0.5%，豆饼粉3%。

[0055] 用于培养菌株CGMCC No.6883的LB培养基和液体发酵培养基中均添加了卡那霉素，使用浓度为100μg/ml。

[0056] （3）将步骤（2）中所得的发酵液与灭菌的草炭按1:2（V:W）混匀，自然风干，备用。

[0057] 上述制备的生物修复菌剂进行盆土试验，步骤如下：

[0058] （1）从农田中采集土样，按照重量比5%加入新鲜石油，自然风干，粉碎，混匀。

[0059] （2）按照质量比5%向步骤（1）制得的含油土壤中加入生物修复菌剂，混合均匀，每周翻土一次，维持土壤含水量20～50 wt %，修复一个月后检测石油含量。

[0060] 本发明的多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883用于各种多环芳烃和石油的生物降解，包括本发明中涉及到的菲及所述的多环芳烃如萘、芴、蒽、荧蒽、芘、苯并蒽、苯并荧蒽等。因此，多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883可作为主要有效成分用于对石油及多环芳烃污染土壤的生物修复。

[0061] 本发明的优点是：针对目前石油及多环芳烃带来的环境污染严重等问题，应用基因工程手段，通过Tn5转座，将环羟化双加氧酶编码基因整合到多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951染色体上，是工程菌株在具有多环芳烃及石油降解能力的基础上，增强和扩大多食鞘氨醇杆菌的降解能力和降解范围。通过利用自杀性载体pUT-Km1，构建新的工程菌株，在原有的石油和多环芳烃降解能力的基础上，提高了该菌的降解功效。对菲的降解能力检测中，工程菌株CGMCC No.6883同多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951相比，对菲的降解能力有所提高，本发明多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883对菲的降解能力提高了22.86%，并且该工程菌株对多种多环芳烃均具有一定的降解作用。以其为主要成分的生物修复菌剂可用于石油及多环芳烃的生物降解。

[0062] 本实验室将来自鞘氨醇杆菌的环羟化双加氧酶编码基因通过自杀性质粒整合到多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951的染色体DNA上，获得了稳定高效的工程菌株CGMCC No.6883。对菌株的遗传改良是获得高效降解菌的有效途径，尤其是基因工程技术的出现可以有目的的对菌株进行改造。但由于不少菌株结构复杂，遗传操作比较困难，有关改良技术还需要进一步的研究。

附图说明

[0063] 图1是电泳照片，以phnA-F和phnA-R为引物进行PCR扩增，扩增产物大小1.3kb。

[0064] 图2是电泳照片，以phnSD-F和phnA-R为引物进行PCR扩增，扩增产物大小1.3kb。

[0065] 图3是电泳照片，以phnNotl-F和phnNotl-R为引物进行PCR扩增，扩增产物大小1.3kb。

[0066] 图4是电泳照片，以限制性内切酶NotI酶切重组质粒pUTPHNA进行验证。

[0067] 图5是电泳照片，以phnS-F和phnS-R为引物，以获得的42株多食鞘氨醇杆菌工程菌株为模板进行PCR扩增，扩增产物大小1kb。

[0068] 图6是多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951及其工程菌株CGMCC No.6883气相色谱图。

[0069] 图7是多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951及其工程菌株CGMCC No.6883的生长曲线图。

具体实施方式

[0070] 以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明并不局限于此。

[0071] 实施例1：环羟化双加氧酶编码基因的克隆

[0072] 根据GenBank上已有的环羟化双加氧酶编码基因序列，设计引物：

[0073] phnA-F：5’-CGATGAGCGGCGACGCCACA-3’

[0074] phnA-R：5’-CGTCATTCGGCCGCGTTAAGCT-3’

[0075] 采用CTAB/NaCl方法提取菌株多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951染色体DNA，，利用PCR技术扩增phnA基因。其中PCR反应体系（100μl）：10μl rTaq buffer（10×），2μl dNTP（10mm），4μl phnA-F（10mm），4μl phnA-R（10mm），1μl rTaq酶（2.5U/μl），2μl 基因组DNA，加ddH2O至100μl。反应条件：95℃ 4min；95℃ 1min，58℃ 50sec，72℃ 1min，共30个循环；72℃ 8min。

[0076] PCR扩增，产物大小约1300bp左右（图1），经纯化后同pMD18-T载体连接，转化E.coli Top10，得到重组质粒pTPHNA，由上海生工生物工程有限公司进行测序，环羟化双加氧酶编码基因（phnA）序列如下：

[0077] 1 ATGAGCGGCG ACGCCACACT CGTAGACACT GTCAATGCTA GCCAGTCCCG TCAGGTGTTC[0078] 61 TGGGACAGAG ACGTTTATGA TCTTGAAATA GAGCGGATTT TTTCCCGGGC ATGGTTGATG[0079] 121 CTCGGCCACA AATCGCTTGT GCCCAAACCG GGCGACTTCA TCACGACCTA CATGGCCGAA[0080] 181 GACAAGGTCA TCCTCTCGCA CCAGAGCGAC GGGACCTTCC GCGCCTTTAT CAATTCGTGC[0081] 241 ACGCACCGCG GCAACCAGAT CTGCCACGCC GACAGCGGTA ACGCCAAGGC GTTCGTCTGC[0082] 301 AATTATCACG GCTGGGTGTA CGGGCAGGAT GGATCGTTGG TCGATGTCCC ACTCGAGTCG[0083] 361 CGCTGTTACC ACAACAAACT CGATAAGCAA GAGCTGGCGG CGAAGTCTGT TCGGGTCGAA[0084] 421 ACCTACAAGG GTTTCATTTT CGGTTGCCAT GATCCCGAAG CGCCTAGCCT TGAAGACTAT[0085] 481 CTGGGCGAAT TCCGTTTTTA TCTCGACACC ATCTGGGAAG GAGGGGGCGC TGGGCTGGAA[0086] 541 CTGCTCGGTC CGCCGATGAA GAGCCTGCTT CACTGCAACT GGAAAGTGCC GGTCGAAAAT[0087] 601 TTTGTCGGCG ACGGATATCA TGTCGGATGG ACCCATGCGG CGGCGCTTGG TCAGATCGGT[0088] 661 GGTCCGTTGG CGGGACTGGC CGGCAACCGC GCGGACATTC CCTTCGACGA TCTTGGATTG[0089] 721 CAGTTCACGA CCCGGCATGG TCATGGCTTT GGGGTGATCG ACAACGCGGC GGCTGCGATC[0090] 781 CACCGAAAGG GCGACGGCTG GAACAAATAT CTTGAGGACA CCCGCGGCGA GGTGCGCCGC[0091] 841 AAGTTTGGCG CGGATCGCGA ACGGCTTTAT GTCGGGCACT GGAACGGCGC GATCTTCCCC[0092] 901 AATCGCTCGT TCCTGTATGG CACCAACACC TTCAAAATCT GGCATCCACG CGGGCCGCAC[0093] 961 GAGATTGAAG TATGGACCTA TACCATGGTG CCGAGCGATG CCGATCCCGC TACCAAGAGT[0094] 1021 GCGATACAGC GCGAAGCGAC GAGAACATTC GGAACCGCCG GGACGCTGGA AAGCGACGAC[0095] 1081 GGCGAAAACA TGTCTTCGGC AACCTACGTG AACCGTGGCG TGATCACGCG TGACGGCATG[0096] 1141 ATGAATTCGA CCATGGGCGT CGGCTACGAA GGACCGCATC CGGTTTATCC CGGAATCGTC[0097] 1201 GGCATCAGCT TCATTGGCGA GACATCCTAC CGGGGCTTCT ACCGGTTCTG GAAGGAAATG[0098] 1261 ATCGATGCCC CCGATTGGGC GAGCGTGAAG GCAAACGGCG ACAATTGGGA TTCGGTCTTC[0099] 1321 ACGAATCGCA ATTTCTGGAA CGAAAAGCTT AACGCGGCCG AATGA

[0100] 环羟化双加氧酶氨基酸序列如下：

[0101] 1 MSGDATLVDT VNASQSRQVF WDRDVYDLEI ERIFSRAWLM LGHKSLVPKP GDFITTYMAE[0102] 61 DKVILSHQSD GTFRAFINSC THRGNQICHA DSGNAKAFVC NYHGWVYGQD GSLVDVPLES[0103] 121 RCYHNKLDKQ ELAAKSVRVE TYKGFIFGCH DPEAPSLEDY LGEFRFYLDT IWEGGGAGLE[0104] 181 LLGPPMKSLL HCNWKVPVEN FVGDGYHVGW THAAALGQIG GPLAGLAGNR ADIPFDDLGL[0105] 241 QFTTRHGHGF GVIDNAAAAI HRKGDGWNKY LEDTRGEVRR KFGADRERLY VGHWNGAIFP[0106] 301 NRSFLYGTNT FKIWHPRGPH EIEVWTYTMV PSDADPATKS AIQREATRTF GTAGTLESDD[0107] 361 GENMSSATYV NRGVITRDGM MNSTMGVGYE GPHPVYPGIV GISFIGETSY RGFYRFWKEM[0108] 421 IDAPDWASVK ANGDNWDSVF TNRNFWNEKL NAAEZ

[0109] 实施例2：多食鞘氨醇杆菌工程菌株的构建

[0110] 1）重组质粒pMSDPHNA的构建

[0111] 根据环羟化双加氧酶编码基因设计引物：

[0112] phnSD-F：5’-GCAGGAGGTTGATATGAGCGGCGACGCCACA-3’

[0113] phnA-R：5’-CGTCATTCGGCCGCGTTAAGCT-3’

[0114] 在该基因起始密码子上游加上核糖体结合位点，目的是当环羟化双加氧酶基因转录时，能被核糖体所识别结合，并起始翻译。以重组质粒pTPHNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增和电泳技术参见实施例1，PCR扩增产物同pMD18-T连接，转化E.coli Top10，提取阳性菌株质粒，PCR验证（图2）和酶切检测，最终得到重组质粒pTSDPHNA。

[0115] 2）重组自杀载体pUTPHNA的构建

[0116] 根据环羟化双加氧酶编码基因序列设计引物：

[0117] phnNotl-F：5’-CGGCGGCCGCAGGAGGTTGATATGAGCGGCG-3’

[0118] phnNotl-R：5’- CGGCGGCCGCTCATTCGGCCGCGTTAAGCT-3’

[0119] 利用PCR技术扩增环羟化双加氧酶基因（图3），PCR扩增和电泳技术参见实施例1。PCR扩增后得到的环羟化双加氧酶编码基因前后两端加上NotI酶切位点，利用NotI分别酶切PCR产物和pUT-km1，连接、转化E.coli DH5α（λ-pir）。通过菌体PCR及酶切鉴定（图4），最终获得重组质粒pUTPHNA。

[0120] 3）多食鞘氨醇杆菌工程菌株的构建

[0121] 将重组质粒pUTPHNA转化到E.coli DH5α（λ-pir）感受态细胞中，用其作为供体菌，以菌株CGMCC No.1951为受体菌，采用三亲杂交方法，使环羟化双加氧酶整合到野生菌CGMCC No.1951染色体上。即将过夜培养的供体菌悬液、受体菌悬液、助手菌悬液以1∶1∶1（体积比）于1.5ml离心管中混合，收集菌体，无菌水冲洗一次，再次收集菌体悬浮于100μl的无菌水中，将菌液点接于LB固体培养基平板上，28℃培养6-8h后，用无菌水收集菌体，稀释后涂于LB固体培养基（含卡那霉素，100μg/ml）平板上，28℃培养24h，得到
58个单菌株。

[0122] 4）多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883的筛选

[0123] 主要采用以下三个步骤进行多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883的筛选：

[0124] （1）以菲为唯一碳源的无机盐培养基平板筛选

[0125] 将得到的58个单菌株同时转接到以菲为唯一碳源的无机盐培养基平板（含卡那霉素，100μg/ml）上，28℃培养48h，最终得到42个单菌落。

[0126] （2）PCR扩增和电泳技术

[0127] 利用引物phnS-F和phnS-R通过PCR扩增和电泳技术对上述步骤中的42个单菌株进行突变子筛选，PCR扩增体系见实施例1，反应条件：95℃ 4min；95℃ 40sec，50℃30sec，72℃ 40sec，共30个循环；72℃ 8min。经PCR扩增和电泳技术检测上述得到的42个单菌株均能扩增到环羟化双加氧酶部分片段，结果见图5。

[0128] （3）菲降解能力检测

[0129] 将上述得到的42个菌株同时接种到LB液体培养基中，28℃摇床培养过夜，取1ml菌液，5000rpm离心10min，弃上清，用ddH2O悬浮菌体，再次5000rpm离心10min，用ddH2O8
调整菌体浓度10cfu/ml，按照体积比5%的量加入到以菲为唯一碳源的无机盐培养基（添加卡那霉素，100μg/ml）中，摇床培养1周，通过气相色谱检测菌株对菲的降解能力，其中以未接菌和接入原始菌株CGMCC No.1951对照，每个处理三个重复。

[0130] 样品处理：等体积加入三氯甲烷，萃取完全，有机相取出10ml，用无水硫酸钠去除样品中的水分，待用。

[0131] 利用气相色谱（Agilent Technologies，仪器型号7890A）检测样品中菲的浓度分析菌株对菲的降解效率。配置FID检测器，熔融石英毛细管柱（30m×0.25mm ID，0.25μm膜厚度），氮气作载体，进样程序为：柱温150℃，进样器温度180℃，检测器温度220℃，初始80℃停留1min，15℃/min升温至240℃，停留1min。进样量1.0μl。

[0132] 结果见图6。菌株在无机盐培养基中培养1周后，进行气相色谱检测。根据气相色谱结果，发现原始菌株CGMCC No.1951对菲的降解率为41.45%，42株工程菌株中，只有菌株SWH-21的降解率达到了64.32%，较原始菌株降解率提高了22.86%。因此选用菌株SWH-21进行后续试验，该菌株已在中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏号CGMCC No.6883。

[0133] 实施例3：多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883的生物学特性

[0134] 1）多食鞘氨醇杆菌工程菌株（CGMCC No.6883）稳定性测定

[0135] 将工程菌株CGMCC No.6883接种到不含任何抗生素的以菲为唯一碳源的固体无机盐平板培养基上，转接15代后，在含Kan的LB培养基上划线，检测多食鞘氨醇杆菌工程菌CGMCC No.6883的生长情况。同时将多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883接种到不含抗生素的液体培养基中，转接15代后，将菌液稀释到一定的倍数，涂到不含抗生素的固体培养基中，将长出的菌落转接到含抗生素的固体培养基上，检测菌株生长情况。结果在不加抗生素的固体和液体培养基中培养的菌株，均能在含抗生素的平板上生长，说明外源基因已经整合染色体上，并且具有遗传稳定性。

[0136] 2）多食鞘氨醇杆菌工程菌株（CGMCC No.6883）生长曲线测定

[0137] 将28℃液体培养的多食鞘氨醇杆菌稀释到A600=0.2，以1∶100（体积比）的比例接种于100ml的LB液体培养基中，28℃，150rpm培养，每隔2h测定各菌株在A600的吸光值。

[0138] 结果显示（图7），多食鞘氨醇杆菌工程菌株染色体上增加了环羟化双加氧酶编码基因的拷贝，其生长曲线与鞘氨醇杆菌野生菌株SWH-2相比，具有明显的差异，表明增加了环羟化编码基因的拷贝影响到其菌株本身的生长。由图7中可以看出，多食鞘氨醇杆菌工程菌株SWh-21的生长速度慢于野生菌株SWH-2，在14h后进入对数生长期，较野生菌株SWH-2推迟了2h。说明环羟化双加氧酶编码基因整合到多食鞘氨醇杆菌SWH-2染色体中，改变了它的生长速度。

[0139] 3）多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951及其工程菌株CGMCC No.6883对各种多环芳烃降解能力检测

[0140] 挑取多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.1951及其工程菌株CGMCC No.6883单菌落分别接种到LB液体培养基中，在转速为180rpm的摇床上28℃培养24h，按照体积比5%的接种量接种到原油培养基中，28℃摇床培养7d，转速为180rpm。以不接菌的原油培养基为空白对照，培养结束后，按照实施例1菲降解能力检测方法进行样品处理。按照实施例1气相色谱检测方法检测菌株对石油中多环芳烃的降解能力。

[0141] 结果见表1。多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951及其工程菌株CGMCC No.6883对各种多环芳烃均具有一定的降解能力，尤其是工程菌株CGMCC No.6883对荧蒽、屈、苯并(b)荧蒽的降解率均达到了60%以上，其中对荧蒽的降解率同野生菌株CGMCC No.1951相比，提高了21.97%，但该工程菌株对苯并(a)芘、苯并(k)荧蒽、苯并(a)蒽的降解能力显著下降。上述结果说明环羟化双加氧酶编码基因整合到多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951染色体DNA上，影响了菌株CGMCC No.1951对多环芳烃的降解作用。

[0142] 表1 多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951及其工程菌株CGMCC No.6883对各种多环芳烃的降解

[0143]

[0144] 实施例4 可修复石油污染土壤的高密度菌剂的制备

[0145] （1）种子培养

[0146] 将-80℃保存的多食鞘氨醇杆菌菌株CGMCC No.1951及工程菌株CGMCC No.6883接种于LB固体培养基上，28℃培养24h，将长出的单菌落转接到LB液体培养基内，28℃，180rpm摇床培养16h，最终分别得到多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951及工程菌株CGMCC No.6883的菌液。

[0147] （2）液体发酵

[0148] 将步骤（1）中制得的菌液按照体积比5%的比例分别转接到液体发酵培养基中，28℃，180rpm培养16h，最终得到多食鞘氨醇杆菌工程菌株CGMCC No.6883的发酵菌液菌液。经检测，多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951及工程菌株CGMCC No.6883的菌液中的有效
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活菌数分别为3.4×10cfu/ml，,4.2×10cfu/ml。

[0149] 上述步骤（2）中液体发酵培养基成分如下：MgSO4•7H2O 0.5%，NaCl 0.5%，豆饼粉3%。

[0150] 用于培养菌株CGMCC No.6883的LB培养基和液体发酵培养基中均添加了卡那霉素，使用浓度为100μg/ml。

[0151] （3）菌剂制备

[0152] 将草炭进行高压灭菌，121℃灭菌2h，将步骤（2）中所得的发酵液与草炭按1:2（V:W）混匀，自然风干，备用。

[0153] 实施例5：生物修复菌剂的应用效果试验

[0154] 采用实施例3制备的生物修复菌剂进行盆土试验。

[0155] 石油污染的土壤制备方法如下：从农田中采集土样，按照重量比5%加入新鲜石油，自然风干，粉碎，混匀。

[0156] 将上述石油污染的土壤分别制备三组土样做对照实验：

[0157] 一组土样：称取石油污染的土壤1.0kg，加入以CGMCC No.1951为主要成分的生物修复菌剂50g；

[0158] 二组土样：称取石油污染的土壤1.0kg，加入以CGMCC No.6883为主要成分的生物修复菌剂50g；

[0159] 三组土样：称取石油污染的土壤1.0kg。

[0160] 实验步骤如下：

[0161] 将上述三组土样，分别装入花盆，调节土壤含水量至20～50 wt %，疏松土壤，室温放置一个月。

[0162] 采用常规的重量法测定石油含量，计算公式为：

[0163] 石油总烃（g/kg）＝蒸发瓶中残留物重/鲜土重*(1－含水率％)*1000。

[0164] 经过一个月的修复，一组土样的石油降解率为29.36%，二组土样的石油降解率为36.98%，三组土样的石油降解率为9.3%。

[0165] 由此可以看出，环羟化双加氧酶编码基因整合到多食鞘氨醇杆菌CGMCC No.1951染色体DNA中确实能够较大的提高该菌株的石油降解能力。