从香菇C91-3菌株中提取抗氧化、抗肿瘤Latcripin-3基因片段的方法

摘要

本发明公开一种从香菇C91-3菌株中提取抗氧化、抗肿瘤Latcripin-3基因片段的方法，依次按如下步骤进行：提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；将菌丝体总RNA反转录合成CDNA；以所得到的cDNA为模板，以插入BamHⅠ和XhoⅠ两个限制性内切酶位点的PCR反应引物进行PCR反应，上游引物BamHⅠ：( 5′-3′)GGCTGATATCGGATCCCTTGCCCAAGATCTTACCG下游引物XhoⅠ：( 5′-3′)GGTGGTGGTGCTCGAGGTCGGGGCAGTGAGGAATT；将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化750 bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。

权利要求

1.一种香菇C91-3菌株 Latcripin-3基因表达蛋白在制备治疗肺癌药物中的应用，所述香菇C91-3菌株Latcripin-3基因表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

说明书

从香菇C91-3菌株中提取抗氧化、抗肿瘤Latcripin-3基因

片段的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抗氧化、抗肿瘤蛋白结构功能域的制备方法，尤其是一种从香菇C91-3菌株中提取抗氧化、抗肿瘤Latcripin-3基因片段的方法。

背景技术

[0002] 真菌富含多种生物活性分子，包括核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素样蛋白、多糖和激酶。其中的抗肿瘤成分以不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面具有独到之处。香菇菌C91-3属真菌为担子菌亚门担子菌纲侧耳科，该菌种已于2013年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7354。香菇菌C91-3含有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，et a1．An Antitumor leetin from edible Mushroon Agroebe aegerita[J]．Bioehem J，2003，374：321—327]。香菇菌C91-3发酵液中含有多种蛋白成分，通过动物体内实验证实有些蛋白成分具有较好的抗肿瘤作用[黄敏，宁安红，张卓然等．香菇C91-3菌丝发酵液小鼠体内抗肿瘤作用的研究[J]．中国微生态学杂志，1996，8(3)：38-40]。体外实验也证实，其发酵液中的一些蛋白组分具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力[戴兵,黄敏,宁安红.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究.浙江医学，2004，26（9）；656 -658]。但是，迄今为止还没有关于从香菇C91-3菌中提取所表达的蛋白具有对抗氧自由基的抗氧化酶、可诱导肿瘤细胞凋亡的基因片段相关报道。

发明内容

[0003] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种从香菇C91-3菌株中提取抗氧化、抗肿瘤Latcripin-3基因片段的方法。

[0004] 本发明的技术解决方案是一种从香菇C91-3菌株中提取抗氧化、抗肿瘤Latcripin-3基因片段的方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

[0005] a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

[0006] b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

[0007] c.PCR扩增目标基因：

[0008] 以所得到的cDNA为模板，以插入BamHⅠ和XhoⅠ两个限制性内切酶位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：

[0009] 上游引物BamHⅠ：

[0010] ( 5′-3′)GGCTGATATCGGATCCCTTGCCCAAGATCTTACCG

[0011] 下游引物XhoⅠ：

[0012] ( 5′-3′)GGTGGTGGTGCTCGAGGTCGGGGCAGTGAGGAATT；

[0013] d.回收纯化DNA片段：

[0014] 将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化750 bpMarker附近的明[0015] 显条带，切胶回收DNA片段。

[0016] 所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，室温放置5min，然后加入氯仿，温和震荡后，4˚C, 12000r/min离心，15min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静止15min，再次4˚C，12000r/min离心，10min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。

[0017] 所述c步骤的PCR反应体系50 ul：Premix Taq 25 µl，cDNA模板2µl，上游引物1µl，下游引物1µl，灭菌蒸馏水21µl；反应条件：95℃预变性6min；94℃变性30s，55℃复性
45s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min；4℃冷却10min。

[0018] 本发明是从香菇C91-3菌丝体转录组中，克隆出一段特异性基因片段，命名为Latcripin-3基因片段，该基因片段所表达的蛋白具有对抗氧自由基的抗氧化酶，诱导肿瘤细胞凋亡等多种生物学功能。可将该基因片段进行基因重组，并于pET32-a原核表达体系中进行高效的可溶性表达，将表达产物通过亲和层析进行分离和提纯，获得该基因编码的蛋白质，该蛋白可用于研究细胞凋亡中的机制及其在细胞信号通路中的作用，也可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

附图说明

[0019] 图1是本发明实施例所提取的香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA1.0%琼脂糖凝胶电泳图。

[0020] 图2是本发明实施例PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳图。

[0021] 图3是本发明实施例重组表达质粒的表达宿主菌经1％琼脂糖凝胶电泳图。

[0022] 图4是本发明实施例目的蛋白的可溶性表达1％琼脂糖凝胶电泳图。

[0023] 图5是本发明实施例目标蛋白Western-blotting鉴定显色试剂盒显色示意图。

[0024] 图6是本发明实施例纯化后的目标蛋白12%SDS-PAGE电泳图。

[0025] 图7是本发明实施例纯化后的目标蛋白目标蛋白的SRB实验结果示意图。

[0026] 香菇C91-3菌株保藏日期：2013年3月15日；

[0027] 分类命名：香菇（Lentinula edodes）；

[0028] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；

[0029] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

[0030] 保藏号：CGMCC No.7354。

具体实施方式

[0031] a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA：

[0032] 取用培养基培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，室温放置5min，然后加入0.2ml氯仿，温和震荡后，4˚C, 12000r/min离心，15min；吸取上层水相溶液0.5ml并转移至另一干净的1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静止15min，再次4˚C,12000r/min离心，10min，弃上清，然后加入75%乙醇1ml洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

[0033] 紫外分光光度计验证纯度，OD260/280比值在1.8~2.0之间。

[0034] 进行1.0%琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示，表明RNA提取纯度较高。

[0035] b. 将菌丝体总RNA反转录合成CDNA；

[0036] 使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒反转录合成cDNA，本试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司

[0037] 反应体系：香菇菌丝体总RNA (1 ug/ul) 1 ul、3’ RACE Adaptor (5 uM) 1 ul、dNTP Mixture (10 mM each) 1 ul、RNase Free dH2O 4.5 ul；

[0038] 反应条件：70℃，10 min 立即冰上放置2分钟；

[0039] 然后加入下列组分：5× M-MLV Buffer 2 ul、 RNase Inhibitor (40 U/ul) 0.25 ul、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) (200 U/ ul) 0.25 ul，体系总体积达到10 ul。

[0040] 反应条件： 42℃，60 min 70℃，15 min 得到反转录反应液（cDNA）。

[0041] c. PCR扩增目标基因；

[0042] 以所得到的cDNA为模板，以插入BamHⅠ和XhoⅠ两个限制性内切酶位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：

[0043] 上游引物BamHⅠ：

[0044] ( 5′-3′)GGCTGATATCGGATCCCTTGCCCAAGATCTTACCG

[0045] 下游引物XhoⅠ：

[0046] ( 5′-3′)GGTGGTGGTGCTCGAGGTCGGGGCAGTGAGGAATT；

[0047] 引物委托宝生物（大连）公司合成。

[0048] PCR反应体系50 ul：Premix Taq 25 ul，cDNA模板2µl，上游引物1 ul，下游引物1 ul，灭菌蒸馏水21 ul。反应条件：95℃预变性6min；94℃变性30 s，55℃复性45 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸10min；4℃冷却10min。PCR 产物经1％琼脂糖凝胶电泳如图2所示，证明成功克隆了该基因片段。

[0049] d.回收纯化DNA片段；

[0050] 将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化750 bpMarker附近的明[0051] 显条带，切胶回收DNA片段，名命为Latcripin-3基因片段。

[0052] 实验：

[0053] 1. Latcripin-3基因片段序列测定：将实施例回收的Latcripin-3基因片段与pMD19-T克隆载体相连，构建重组质粒pMD19T- Latcripin-3，转化感受态大肠杆菌JM109。重组载体测序由大连宝生物公司测定，香菇C91-3 Latcripin3基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3。

[0054] 2. Latcripin-3基因片段的克隆表达

[0055] 2.1 Latcripin-3基因片段重组表达质粒的构建：用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切消化pET32a(＋)，选择1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，用DNA gel extraction回收纯化线性pET32a(＋)载体片段，用T4DNA 连接酶连接pET32a(＋)载体片段及本发明实施例获得的Latcripin3基因片段，然后获得重组表达质粒pET32a(+)-Latcripin3基因片段。重组表达质粒转化大肠杆菌JM109，将转化产物均匀涂布于在羧苄青霉素的LB 平板上，于37℃培养14个小时。挑取单克隆阳性菌落，分别接种于3ml含羧苄青霉素的LB 液体培养基中，于37 ℃下，190 rpm / min 振荡培养过夜；用Plasmid Miniprep Kit V3.l抽提质粒，并进行核酸测序鉴定。核酸测序鉴定结果表明序列与Latcripin-3基因片段序列一致。

[0056] 2.2重组表达质粒的表达宿主菌转化选择冻融法，将重组表达质粒pET32a(+)-Latcripin3基因片段转入表达宿主菌大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)感受态细胞中，涂布于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB平板上，37 ℃ 过夜培养。选取平板上生长的单克隆阳性菌落接种于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB液体培养基于37 ℃ 培养14小时，保存菌株，同时采用宝生物公司Plasmid Miniprep Kit V3.l 抽提质粒，经过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切消化后，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测验证，1.0％琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，图3中1为空pET32a(+)双酶切，2为pET32a(+)-Latcripin3双酶切，表明目的pET32a(+)-Latcripin3基因片段已成功转化到Rosetta-gami(DE3)的菌株中。

[0057] 2.3Latcripin3蛋白的可溶性表达

[0058] 将2.2步骤保存的菌株按1：100比例接种于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素为高浓度）的TB养基中，其中含有1%的葡萄糖，于37 ℃ 下，190 rpm / min 振荡培养5小时左右，待菌液浓度OD600=0.8时，加入IPTG使其溶液终浓度为1mmol/L，16℃过夜诱导，次日早晨4 ℃，8000r/min，10 分钟回收细菌。用PBS将细菌洗涤3次，用适量的PBS重悬，加入PMSF碎冰孵育超声裂解，低温（4℃）离心10000rpm/min，5min，将上清蛋白做12%SDS-PAGE电泳检测（如图4）,图4中1为Latcripin-3目标蛋白，2为pET-32a空载体表达蛋白，初步表明Latcripin3目标蛋白有表达。

[0059] 2.4目标蛋白Western-blotting 鉴定分析

[0060] 将2.3步骤所得可溶性蛋白样品进行Western blot鉴定，用湿转膜的方式转印到NC膜上，经5%脱脂牛奶室温封闭液封闭120分钟后，第一抗Mouse Anti-His Tag Monoclonal Antibody，4℃孵育过夜，再加入第二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L)室温孵育90分钟，显色试剂盒显色（如图5），表明Latcripin3目标蛋白成功表达。

[0061] 2.5目标蛋白的纯化

[0062] 将上述2.4步骤所得可溶性蛋白样品与含有10mM咪唑的binding buffer等体积混合，通过镍柱，利用HIS标签的亲和层析进行蛋白的纯化，通过不同浓

[0063] 度咪唑的梯度洗脱(浓度为200mM、300mM、500mM)，得到单一的目的蛋白12%SDS-PAGE电泳验证（如图6），1全菌蛋白，2流传液，3洗脱液；收集浓缩蛋白。电泳验证结果表明：经镍柱纯化后可成功获得Latcripin3目标蛋白。

[0064] 2.6蛋白活性分析

[0065] a.采用现有方法对2.5步骤纯化浓缩的目标蛋白进行测序，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，命名Latcripin-3蛋白。

[0066] 氨基酸序列及功能结构域分析分析：通过DNASTAR软件包对本发明实施例核酸的编码产物进行分析。

[0067] 采用Protean模块，分析多肽的一般性质；

[0068] 相似性比较在NCBI 站点上用BLAST 完成；

[0069] 采用Pfam数据库，将已知蛋白序列进行检索分析，预测peroxidase蛋白其功能域，具有抗氧化蛋白酶活性，具有清除自由基的及抗肿瘤活性。分析表明，Latcripin3蛋白结构域与 peroxidase蛋白有一定的序列相似性，说明Latcripin-3蛋白具有抗氧化蛋白酶活性，具有清除自由基的及抗肿瘤活性。

[0070] b.将纯化浓缩的Latcripin-3目标蛋白进行微量BCA蛋白定量后，选用人肺癌A549细胞进行细胞毒SRB实验。SRB（Sulforhodamine B磺酰罗丹明B）是一种能与生物大分子的碱性氨基酸结合的水溶性蛋白染料，其结合于细胞中量的多少可以反映总蛋白量进而反映细胞数的多少。在515 nm波长处的OD值与活细胞数呈良好的线性关系。目标蛋白的SRB实验结果如图7所示，说明本发明基因表达的蛋白对人肺癌A549细胞有显著地抑制作用，在蛋白浓度为15ug/ml时的，抑瘤率接近30%，并呈浓度依赖性。