猪HOXA10基因片段作为猪产仔数性状的遗传标记及应用

摘要

本发明属于猪遗传标记制备与应用技术领域，具体涉及一种猪HOXA10基因外显子1基因片段作为猪产仔数性状的遗传标记。本发明通过制备得到一种与猪产仔数性状相关的遗传标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，在序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2第339bp处有一个碱基突变，该突变导致PCR-MslI-RFLP多态性。本发明还公开了该遗传标记的制备方法及其在猪产仔性状关联分析中的应用。本发明为猪产仔数性状标记检测提供了新的遗传标记资源。

权利要求

1.一种遗传标记在大白猪产仔数性状检测中的应用，其特征在于该遗传标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，在序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2第339bp处有一个碱基突变，该突变导致PCR-MslI-RFLP多态性。

说明书

猪HOXA10基因片段作为猪产仔数性状的遗传标记及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及猪遗传标记制备技术领域，具体涉及一种猪HOXA10基因第一外显子SNP作为猪产仔数性状相关的遗标记及应用，它包括猪HOXA10基因第一外显子序列突变位点的检测方法与应用。

背景技术

[0002] 猪的产仔数是繁殖性状中重要的经济性状,直接关系到养猪业的经济收益。在英国，如果每头母猪的产活仔数每胎提高l头,英国的养猪业每年就可增加利润7亿英镑,整个欧盟养猪业可多获利20亿英磅；在我国,如果母猪产仔数每胎提高1头,每年也将增收190亿人民币的纯利（王莉兴等,2008）。母猪产仔数性状是一个由排卵、受精、着床、胎儿发育等多个具有时间顺序特征的组分性状构成的复合性状。从目前的研究情况来看，猪早期胚胎丢失率和中期胎儿死亡率是决定母猪产仔数的主要原因之一。母猪早期胚胎丢失与子宫内环境密切相关，而胚泡异常发育与着床失败是导致母猪早期胚胎丢失的主要原因。

[0003] HOXA10基因是同源异型基因的一种，在进化上高度保守，其表达产物是一种转录因子。目前，在人及其他哺乳动物中的研究表明，HOXA10基因是调控子宫微环境、影响子宫内膜容受性和胚胎着床的关键因子，该基因在子宫内膜上皮细胞中持续上调是正常妊娠的必要条件。HOXA10基因在“着床窗口期”高表达，雌激素和孕酮分别通过它们的受体直接调控该基因的表达（Taylor HS et al.,1998;Daftary and Taylor,2006;Godbole et al.,2007），与其辅因子PBX2及Meisl相互作用形成不同的异源二聚体或三聚体（Sanro JL，2005），调控β3（Daftary GS et al.,2002）、EMX2（Troy PJ et al.,2003）、IGFBP-1（Kim et al.,2003)、EP3、EP4（Svingen T and Tonissen KF,2006）等下游基因，参与雌性生殖系统的发育和正常子宫内膜形态的构建，并对子宫内膜的增殖与分化、子宫内膜容受性的建立、胚胎的定位及粘附、胞饮突的形成、子宫内膜的蜕膜化以及血管通透性的增强发挥着重要作用。在猪中的研究表明，妊娠14d母猪连续注射雌二醇戊酸盐处理后，子宫内膜中HOXA10基因表达量显著高于未处理的对照组，但低于正常妊娠12d的母猪子宫内膜，差异不显著（Chen et al.,2010）。猪在妊娠第12d和15d猪子宫内膜中HOXA10基因的表达量显著高于妊娠第10d和11d（Blitek et al.,2010）。取发情期第9d的猪子宫内膜细胞，进行体外培养，并加入雌激素（1-100nM）和孕激素（10-1000nM）后，HOXA10基因和PGHS-2（前列腺素合成基因）基因的表达量上升，表明HOXA10基因在母猪发情周期的分泌中期子宫内膜中的表达受到雌激素和孕激素的调控（Blitek et al.,2010）。猪妊娠第15d的子宫内膜中HOXA10基因的表达量显著高于发情周期15d的子宫内膜，并且体外培养实验表明，雌激素和孕激素可以上调子宫内膜间质细胞的HOXA10基因的表达（Blitek et al.,2011）。另外，阻碍成体母鼠子宫内膜中HOXA10基因的表达导致胚胎附植和窝产仔数降低（Akbas GE et al.,2004）。鉴于HOXA10基因在物种间的高度保守性，因此推测HOXA10基因的表达可能与猪的产仔数性状相关。

[0004] 目前与猪重要经济性状有关的分子标记进行了一定的研究，但其遗传效应还不明确，能真正应用于育种生产的分子标记更是屈指可数。也没有深入到调控基因表达和基因遗传效应产生的根本原因。而关于猪的HOXA10基因的研究非常少，迄今为止，尚未将该基因作为猪产仔数性状的分子标记。因此，本研究分析了猪HOXA10基因的结构及多态性，成功分离出了猪HOXA10基因第1外显子的序列，建立了第1外显子突变体的检测方法，并分析了其多态性与产仔数之间的相关性，为产仔数性状改良提供新的标记。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于获得一种与猪产仔数性状相关的遗传标记，克隆HOXA10基因第1外显子序列，寻找突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪产仔数性状检测提供一种遗传标记和方法。

[0006] 本发明的技术方案如下：

[0007] 本发明获得了一种与猪产仔数性状相关的遗传标记，它包含猪(国外血缘猪大白猪和中国地方猪血缘猪梅山猪)HOXA10基因第1外显子534bp的序列（其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2所示）；通过上述序列进行ClusterW比对提供了位于该扩增片段内部339bp处的C/T碱基变异，导致PCR-MslI-RFLP多态性，如图1所示。

[0008] 一种扩增猪(大白猪和梅山猪)HOXA10基因第1外显子片段的引物，其DNA序列如序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

[0009] 一种筛选与猪产仔数性状相关的遗传标记的方法，按照以下步骤：

[0010] 选择两个猪品种(1头为国外血缘猪大白猪和2头中国地方猪品种梅山猪)为实验材料，从猪耳缘组织中提取DNA；根据猪HOXA10基因组序列设计引物（其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示)，对包括其第一外显子534bp的核苷酸序列（其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)进行PCR扩增；对PC R产物进行纯化、克隆和序列测定，进而进行序列比对，筛查SNP，然后再利用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列进行片段扩增，将PCR扩增片段进行MslI酶切分型及检测。

[0011] 本发明提供了鉴定上述序列339bp处C/T变异的MslI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法。

[0012] 进一步本发明提供了利用MslI-RFLP方法确定的不同基因型个体与产仔数性状间的关联分析。

[0013] 更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

[0014] 序列表SEQ ID NO:1是本发明扩增的国外血缘猪种大白猪的核苷酸序列，序列长度为534bp；

[0015] 序列表SEQ ID NO:2是本发明扩增的中国地方猪血缘猪种梅山猪的核苷酸序列，序列长度为534bp；

[0016] 序列表SEQ ID NO:3是本发明制备SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2特异基因片段所用的正向引物，也是实施猪C/T变异MslI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物；

[0017] 序列表SEQ ID NO:4是制备SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2特异基因片段所用的反向引物，也是实施猪C/T变异MslI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的反向引物。

[0018] 图1：为本发明两个猪种HOXA10基因序列测序结果和SNP位点；

[0019] 图2：为本发明包括猪HOXA10基因第1外显子的基因片段琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为2%，图中M泳道为DNA Marker DL2000，泳道1为序列表SEQ IDNO:3和SEQ IDNO:4所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为534bp；

[0020] 图3：为猪HOXA10基因MslI-RFLP检测结果。琼脂糖凝胶浓度为2%，图中M泳道为DNA Marker DL2000，CC基因型片段大小分别为476bp和58bp，TT基因型片段大小分别为277bp、199bp和58bp，而杂合基因型TC片段大小分别476bp、277bp、199bp和58bp。

[0021] 图4：为本发明扩增的大白猪的核苷酸序列，在该序列的339bp处存在一个等位基因突变（显示突变的基因是C）。

[0022] 图5：为本发明扩增的梅山猪的核苷酸序列，在该序列的339bp处存在一个等位基因突变（显示突变的基因是T）。

具体实施方式

[0023] 实施例1：基因片段的获得及多态性检测方法的建立

[0024] 猪HOXA10基因第一外显子部分序列扩增

[0025] （1）采集耳组织样

[0026] 选择一个外来猪种(大白猪)和一个中国猪种(梅山猪，来自中国湖北省武汉市华中农业大学试验猪场)为试验材料，在仔猪出生当天，采取猪的耳缘组织；

[0027] （2）基因组DNA提取

[0028] 从猪的耳缘组织中提取猪的基因组DNA（方法参照熊远著《猪生化及分子遗传实验导论》中国农业出版社，1999介绍的方法）。

[0029] （3）引物设计

[0030] 根据猪HOXA10基因（GenBank基因登录号为JN_836600）的第一外显子序列，设计一对特异引物。其中

[0031] 正向引物为HOXA10-SNP-F1 5′-GCACAAGAAATGTCAGCCAGAA-3′，

[0032] 反向引物为HOXA10-SNP-R1 5′-CGAGTCGTAGAGGCAGTAGG-3′；

[0033] （4）聚合酶链式反应

[0034] 用此引物利用PCR法，以抽提的大白猪和梅山猪基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为200μmol/L，每条引物浓度为0.4μmol/L，2U的LaTaq DNA聚合酶(购自宝生物工程大连有限公司)，12.5μL GC buffer，加去离子水至总体积25μL；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共34个循环；72℃延伸5min。长度为534bp的PCR产物经纯化、克隆后，进行序列测定，得到如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所述的核苷酸序列。将不同猪种的PCR产物序列测序峰图结果见图1。位于该片段的339bp处的C/T变异引起了MslI酶切位点(CAYNN′NNRTG)多态性。

[0035] （5）限制性内切酶酶切反应，多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测[0036] 采用MslI-RFLP方法对猪HOXA10基因第一外显子SNP进行基因分型，具体酶切反应操作步骤为：:取取8.5μL PCR产物加入0.5μL(10U/μL)限制性内切酶和1μL110×Buffer)，37℃MslI酶切4h，取5μL酶切产物用浓度为2%的琼脂糖进行电泳检测，在紫外灯下观察并记录酶切结果。此扩增片段大小为534bp，MslI酶切多态性位点位于该片段的339bp处，当该处变异位点为T碱基时，会产生限制性内切酶MslI的酶切位点(CAYNN′NNRTG)，由于在扩增片段58bp存在另外一个MslI酶切位点，所以MslI消化PCR产物后会产生3个片段(277bp、199bp和58bp)，基因型为TT；当该处变异位点为C碱基时，则不存在MslI酶切位点，MslI消化PCR产物后会产生2个片段(476bp和58bp)，基因型为CC；当该处变异位点为T/C杂合基因型时，MslI消化PCR产物后会产生4个片段(476bp、
277bp、199bp和58bp)，基因型为TC。

[0037] 实施例2：本发明制备的遗传标记在不同猪群中的多态性分布检测[0038] 采用PCR-RFLP的方法对PCR-MslI-RFLP多态性位点在国内外6个品种共844头猪中的基因型与等位基因频率分布情况进行了检测，其结果见表1。其包括中国地方猪种梅山猪、通城猪和藏猪，国外猪种包括长白猪、大白猪与杜洛克猪。检测结果表明，长白猪、大白猪和通城猪中该多态位点的三种基因型即TT及CC、TC基因型均有分布，而在梅山猪、杜洛克猪和藏猪中没有检测到CC基因型。其中在大白猪中C等位基因占明显的优势；而梅山猪、杜洛克猪和藏猪中T等位基因的频率分别达到约90%、79%和60%；在通城猪中T等位基因频率略高于C等位基因，而长白猪中这两个等位基因基本没有差别。对这6个猪种之间2
基因型频率的差异比较的χ 检验结果如表2所示。

[0039] 表1 6个不同品种中猪HOXA10基因外显子PCR-MslI-RFLP多态性的基因型和基因频率

[0040]

[0041] 表2不同品种猪中HOXA10基因PCR-MslI-RFLP多态性基因频率卡方检验的结果[0042]

[0043] 注：*<0.05,**<0.01.χ20.05(df＝5)=11.07050,χ20.01(df＝5)=15.08627。

[0044] 实施例3：本发明制备的遗传标记与产仔数性状的关联分析

[0045] 为了确定猪HOXA10基因PCR-MslI-RFLP与猪表型差异是否相关，本申请人采用SAS软件对猪HOXA10基因外显子PCR-MslI-RFLP多态性位点与广东温氏水台繁殖猪群的302头长白猪的总产仔数和产活仔数等繁殖性状进行了初步的关联分析。所用模型为：

[0046] yi=μ+αi+bj+pk+ei

[0047] yi代表性状值，μ代表总体平均数，αi代表基因型效应值（i=TT,TC,CC），[0048] bj代表品种效应（j=1,2），pk代表第k个胎次固定效应，ei代表随机误差。

[0049] 该多态位点在302头长白猪中的CC基因型有114个，TT基因型有109个，而TC基因型有79个。统计分析结果表明，长白猪的部分繁殖性状与该多态位点呈显著相关，详细结果见表3。

[0050] 表3分析结果可见，PCR-MslI-RFLP多态性位点与总产仔数（P=0.0427）显著相关，而与产活仔数（P=0.0045）呈极显著相关，并且，TC基因型的母猪总产仔数和产活仔数最多(表3)。

[0051] 表3猪HOXA10基因外显子PCR-RFLP-MslI多态性位点基因型与部分繁殖性状关联分析

[0052]

[0053]

[0054] 注：*差异显著（p<0.05），**差异极显著（p<0.01）。

[0055] 参考文献

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