用于治疗脊髓损伤的重组基因、重组载体和重组细胞

摘要

本发明公开了一种用于治疗脊髓损伤的重组基因，由LIF基因、IRES序列与NT-3基因沿转录方向依次连接而成，或者由NT-3基因、IRES序列与LIF基因沿转录方向依次连接而成。本发明还公开了所述重组基因与基因载体构建而成的用于治疗脊髓损伤的重组载体。本发明所述的重组基因和重组载体，能够同时表达NT-3和LIF，从而针对脊髓损伤的不同发病环节进行治疗，发挥协同作用，从而更好地促进脊髓上下行神经纤维的再生，修复自主运动功能。

权利要求

1.一种用于治疗脊髓损伤的重组载体pIRES2-LIF/NT-3的制备方法，包括以下步骤：(1)克隆LIF基因：以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，得到LIF基因；

(2)在LIF基因中引入特异性酶切位点：以LIF基因为模板，用含有EcoRI和BamHI酶切位点序列的LIF特异性引物进行PCR扩增，得到含有EcoRI和BamHI酶切位点的LIF基因片段；

(3)构建重组载体pIRES2-LIF-EGFP：用限制性内切酶EcoRI和BamHI，分别酶切pIRES2-EGFP质粒以及步骤(2)得到的LIF基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接，得到重组载体pIRES2-LIF-EGFP；

(4)克隆NT-3基因：以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，用含有BstXI和NotI酶切粘性末端的NT-3特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到NT-3基因片段混合物，其中的一种NT-3基因片段具有BstXI和NotI酶切粘性末端；

(5)构建重组载体pIRES2-LIF/NT-3：用限制性内切酶BstXI和NotI酶切步骤(3)得到的重组载体pIRES2-LIF-EGFP，将步骤(4)得到的NT-3基因片段混合物与酶切后线性化的重组载体pIRES2-LIF-EGFP混合，采用T4DNA连接酶进行连接，得到重组载体pIRES2-LIF/NT-3其中，步骤(1)所述的克隆LIF基因包括以下步骤：

A)以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，用LIF-1特异性引物进行PCR扩增，得到含有LIF外显子1的L1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，所述的LIF-1特异性引物为：LIF-1-5'端引物：5'-TCTCCCATGCGGCCATTGTTG-3'，LIF-1-3'端引物：5'-CCTCCCTGCCATCTCCTGTCAGTATC-3'；

PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min；

B)以步骤A)得到的L1基因片段为模板，用LIF-2特异性引物进行PCR扩增，得到LIF外显子1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述的LIF-2特异性引物为：LIF-2-5'端引物：5'-TTGGCGGCAGGAGTTGTGCC-3'，LIF-2-3'端引物：5'-CTGGGCTGTGTAATAGAGAATAAAGAGGG-3'；

PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min；

C)以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，用LIF-3特异性引物进行PCR扩增，得到LIF外显子2基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，所述的LIF-3特异性引物为：LIF-3-5'端引物：5'-CTTTATTCTCTATTACACAGCCCAGG-3'，LIF-3-3'端引物：5'-CTAGAAGGCCTGGGCCAACACG-3'；

PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min；

D)将步骤B)得到的LIF外显子1基因片段和步骤C)得到的LIF外显子2基因片段混合，在DNA聚合酶的作用下进行重叠延伸PCR反应，得到所述的LIF基因。

步骤(2)所述的LIF特异性引物为：

LIF上游引物：5'-CGGAATTCATGAAGGTCTTGGCGGCAGG-3'，LIF下游引物：5'-CGGGATCCCTAGAAGGCCTGGGCCAACACG-3'；

PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，10个循环；72℃最终延伸5min；

步骤(4)所述的NT-3特异性引物包括NT-3第一引物对和NT-3第二引物对，所述的NT-3第一引物对由NT-3上游短引物和NT-3下游短引物组成，所述的NT-3第二引物对由NT-3上游长引物和NT-3下游长引物组成：NT-3第一引物对为：

NT-3上游短引物：5'-ATGTCCATCTTGTTTTATGTGATATTTCTCGC-3'，NT-3下游短引物：5'-GCTCATGTTCTTCCGATTTTTCTCGAC-3'；

NT-3第二引物对为：

NT-3上游长引物：5'-AACCATGTCCATCTTGTTTTATGTGATATTTC-3'，NT-3下游长引物：5'-GGCCGCTCATGTTCTTCCGATTT-3'；

PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min；

杂交PCR的反应条件为：95℃5min，80℃1min，70℃1min，65℃1min，60℃1min，

55℃1min，40℃1min，16℃保存。

2.一种用于治疗脊髓损伤的重组载体pVAX1-LIF/IRES/NT-3的制备方法，包括以下步骤：(I)按照权利要求1所述的制备方法，制得重组载体pIRES2-LIF/NT-3；

(II)获取LIF/IRES/NT-3基因片段：用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切所述的重组载体pIRES2-LIF/NT-3，回收LIF/IRES/NT-3基因片段；

(III)构建重组载体pVAX1-LIF/IRES/NT-3：用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切pVAX1质粒，混合步骤(II)得到的LIF/IRES/NT-3基因片段和酶切后线性化的pVAX1质粒，并采用T4DNA连接酶进行连接，得到重组载体pVAX1-LIF/IRES/NT-3。

说明书

用于治疗脊髓损伤的重组基因、重组载体和重组细胞

技术领域

[0001] 本发明涉及一种重组基因、重组载体和重组细胞，特别是涉及一种用于治疗脊髓损伤的重组基因、重组载体和重组细胞。

背景技术

[0002] 脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是中枢神经系统的严重创伤，常导致伤者截瘫，损伤平面以下神经功能受损或丧失，严重者造成身体多个系统功能障碍甚至造成死亡。脊髓是中枢神经系统的重要组成部分，脊髓损伤后，上下神经传导束的断裂、溃变，是造成损伤平面以下肢体感觉和运动功能障碍的直接原因；神经元和胶质细胞坏死和凋亡，损伤部位抑制因子的高表达，是脊髓损伤后神经再生困难的主要因素；损伤区坏死空洞的形成以及后期空洞周围反应性增生星形胶质细胞包绕空洞形成胶质瘢痕则，是阻碍神经再生的物理屏障。

[0003] 传统的治疗脊髓损伤的方法，主要是应用物理治疗和临床康复治疗的手段来改善伤者的生活质量，但都不能从根本上突破神经再生的医学难题。目前临床治疗脊髓损伤的目的主要是减轻继发性损伤，防止并发症的发生；治疗的关键是如何使损伤区上下轴突再生，穿越损伤区，与靶神经元重新建立联系。然而，脊髓损伤后，体内会出现一些抑制轴突再生的因素，例如促进轴突生长的神经营养因子的缺乏等。因此，提高脊髓损伤局部神经营养因子的表达水平，将会对脊髓损伤后功能的改善起到促进作用。

[0004] 神经营养因子（Neurotrophic factors，NTFs）是一类对神经元的分化、发育、生长、存活和功能有支持和促进作用的蛋白质。研究表明，NTFs能促进成年中枢神经系统神经元轴突生长、突触的重排以及树突的出芽，其通过与神经细胞上的特异性受体结合，激发各种信号通路而发挥其生物学效应，促进中枢神经分化、生长和存活。以前，对NTFs的研究，主要是脊髓损伤后移植微管内注入NTFs或鞘内局部注射NTFs。随着近年来基因治疗的兴起，学者们亦通过转基因技术，将NTFs基因转染合适的受体细胞，再移植到损伤区，让其在体内表达NTFs并发挥相应的生物作用，刺激脊髓轴突再生。然而，由于单个基因载体的治疗效果不佳，进行基因治疗时需要引入多种单基因的NTFs重组载体，这必可避免地引入了大量非治疗相关的外源基因序列（如载体中的抗性筛选序列等），使临床应用增加了不安全因素。

发明内容

[0005] 基于此，有必要针对现有技术存在的缺陷，提供一种用于治疗脊髓损伤的重组基因。

[0006] 本发明的另一个目的是，提供由所述的重组基因与基因载体构建的重组载体及其制备方法。

[0007] 本发明的再一个目的是，提供由所述的重组载体转化导入宿主细胞得到的重组细胞。

[0008] 一种用于治疗脊髓损伤的重组基因LIF/IRES/NT-3，由LIF基因（白血病抑制因子基因）、IRES序列与NT-3基因（神经营养素-3基因）沿转录方向依次连接而成，或者由NT-3基因、IRES序列与LIF基因沿转录方向依次连接而成；所述LIF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述NT-3基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

[0009] 一种用于治疗脊髓损伤的重组载体pIRES2-LIF/NT-3，由LIF基因、NT-3基因与pIRES2质粒构建而成；其中，沿着转录方向，LIF基因连接于IRES序列的上游，NT-3基因连接于IRES序列的下游；或者沿着转录方向，NT-3基因连接于IRES序列的上游，LIF基因连接于IRES序列的下游。

[0010] 所述重组载体pIRES2-LIF/NT-3的制备方法，包括以下步骤：

[0011] （1）克隆LIF基因：以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，得到LIF基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

[0012] （2）在LIF基因中引入特异性酶切位点：以LIF基因为模板，用含有EcoRI和BamHI酶切位点序列的LIF特异性引物进行PCR扩增，得到含有EcoRI和BamHI酶切位点的LIF基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；

[0013] （3）构建重组载体pIRES2-LIF-EGFP：用限制性内切酶EcoRI和BamHI，分别酶切pIRES2-EGFP质粒以及步骤（2）得到的LIF基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接，得到重组载体pIRES2-LIF-EGFP；

[0014] （4）克隆NT-3基因：以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，用含有BstXI和NotI酶切粘性末端的NT-3特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到NT-3基因片段混合物，其中的一种NT-3基因片段具有BstXI和NotI酶切粘性末端；

[0015] （5）构建重组载体pIRES2-LIF/NT-3：用限制性内切酶BstXI和NotI酶切步骤（3）得到的重组载体pIRES2-LIF-EGFP，将步骤（4）得到的NT-3基因片段混合物与酶切后线性化的重组载体pIRES2-LIF-EGFP混合，采用T4DNA连接酶进行连接，得到重组载体pIRES2-LIF/NT-3。

[0016] 在其中一个实施例中，步骤（1）所述的克隆LIF基因包括以下步骤：

[0017] A）以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，用LIF-1特异性引物进行PCR扩增，得到含有LIF外显子1的L1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，所述的LIF-1特异性引物为：

[0018] LIF-1-5'端引物：5'-TCTCCCATGCGGCCATTGTTG-3'，

[0019] LIF-1-3'端引物：5'-CCTCCCTGCCATCTCCTGTCAGTATC-3'；

[0020] B）以步骤A）得到的L1基因片段为模板，用LIF-2特异性引物进行PCR扩增，得到LIF外显子1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述的LIF-2特异性引物为：

[0021] LIF-2-5'端引物：5'-TTGGCGGCAGGAGTTGTGCC-3'，

[0022] LIF-2-3'端引物：5'-CTGGGCTGTGTAATAGAGAATAAAGAGGG-3'；

[0023] C）以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，用LIF-3特异性引物进行PCR扩增，得到LIF外显子2基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，所述的LIF-3特异性引物为：

[0024] LIF-3-5'端引物：5'-CTTTATTCTCTATTACACAGCCCAGG-3'，

[0025] LIF-3-3'端引物：5'-CTAGAAGGCCTGGGCCAACACG-3'；

[0026] D）将步骤B）得到的LIF外显子1基因片段和步骤C）得到的LIF外显子2基因片段混合，在DNA聚合酶的作用下进行重叠延伸PCR反应，得到所述的LIF基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

[0027] 在其中一个实施例中，步骤（2）所述的LIF特异性引物为：

[0028] LIF上游引物：5'-CGGAATTCATGAAGGTCTTGGCGGCAGG-3'，

[0029] LIF下游引物：5'-CGGGATCCCTAGAAGGCCTGGGCCAACACG-3'。

[0030] 在其中一个实施例中，步骤（4）所述的NT-3特异性引物包括NT-3第一引物对和NT-3第二引物对，所述的NT-3第一引物对由NT-3上游短引物和NT-3下游短引物组成，所述的NT-3第二引物对由NT-3上游长引物和NT-3下游长引物组成：

[0031] NT-3第一引物对为：

[0032] NT-3上游短引物：5'-ATGTCCATCTTGTTTTATGTGATATTTCTCGC-3'，[0033] NT-3下游短引物：5'-GCTCATGTTCTTCCGATTTTTCTCGAC-3'；

[0034] NT-3第二引物对为：

[0035] NT-3上游长引物：5'-AACCATGTCCATCTTGTTTTATGTGATATTTC-3'，[0036] NT-3下游长引物：5'-GGCCGCTCATGTTCTTCCGATTT-3'。

[0037] 一种用于治疗脊髓损伤的重组载体pVAX1-LIF/IRES/NT-3，由LIF基因、IRES序列、NT-3基因与pVAX1质粒构建而成；其中，LIF基因、IRES序列与NT-3基因沿转录方向依次连接；或者NT-3基因、IRES序列与LIF基因沿转录方向依次连接。

[0038] 所述重组载体pVAX1-LIF/IRES/NT-3的制备方法，包括以下步骤：

[0039] （I）按照上述重组载体pIRES2-LIF/NT-3的制备方法，制得重组载体pIRES2-LIF/NT-3；

[0040] （II）获取LIF/IRES/NT-3基因片段：用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切所述的重组载体pIRES2-LIF/NT-3，回收LIF/IRES/NT-3基因片段；

[0041] （III）构建重组载体pVAX1-LIF/IRES/NT-3：用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切pVAX1质粒，混合步骤（II）得到的LIF/IRES/NT-3基因片段和酶切后线性化的pVAX1质粒，并采用T4DNA连接酶进行连接，得到重组载体pVAX1-LIF/IRES/NT-3。

[0042] 一种用于治疗脊髓损伤的重组细胞，将所述的重组载体pIRES2-LIF/NT-3或重组载体pVAX1-LIF/IRES/NT-3转化导入宿主细胞所形成。

[0043] 在其中一个实施例中，所述的宿主细胞为间充质干细胞（MSC细胞）。

[0044] 在其中一个实施例中，所述的间充质干细胞（MSC细胞）为骨髓来源、脐带来源、胎盘来源或者脂肪来源等。

[0045] 神经营养素-3（Neurotrophin-3，NT-3）是一种多功能的神经营养因子，对神经系统发育及维持其正常生理功能具有重要作用，NT-3不仅对体内感觉神经元、运动神经元、交感神经元和多巴胺能神经元的发育分化具有维持和促进作用，而且还能够维持体外培养的交感和感觉神经元的存活，促进脊髓损伤部位的神经轴突再生，促进神经递质的释放，并能调节突触的功能，从而促进中枢神经系统损伤后的神经形态和功能的恢复。NT-3是目前唯一明确的在脊髓损伤后促皮质脊髓束（CST）生长的神经营养因子。

[0046] 白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF）具有神经保护和增强神经营养因子的作用，其能够促进神经递质等神经营养因子的分泌，促进周围神经再生，维持神经元生存、分化、生长和成熟，促进细胞功能性轴突再生，促进少突胶质细胞的存活和髓鞘的形成，对中枢神经损伤后神经元的存活、再生有十分重要的作用。此外，LIF能够促进NT-3神经营养因子的表达，将经LIF基因修饰的、能分泌高水平LIF的成纤维细胞移植治疗成年鼠脊髓损伤，发现宿主组织中NT-3的表达明显增强，表明LIF不但可以调节神经系统的功能，还可以通过增加另一种营养因子的释放而调节神经系统对损伤的应答。

[0047] IRES序列是来源于某些病毒和细胞mRNA5’端的一段非翻译区，可以不依赖帽的方式启动远端的mRNA翻译，可在上游启动子的控制下和与之相连的基因共同转录，在同一转录本上翻译出不同的蛋白。IRES连接多基因进行共表达时，多个基因的mRNA在同一条转录子上，但转录后的翻译过程相互独立，上游基因以传统方式进行翻译，下游基因依靠IRES序列以不依赖帽的方式进行翻译，保证了各个基因的独立结构及功能。利用IRES代替内部启动子，不但可使多基因共表达载体大大缩小，而且还克服了传统多基因表达载体中启动子之间的相互抑制现象，避免融合蛋白的产生。

[0048] 本发明所述的重组基因和重组载体，采用IRES序列来连接LIF基因和NT-3基因，能够在同一载体中同时表达神经营养素-3以及白血病抑制因子，可减少基因载体的用量，减少非治疗相关的外源基因序列的引入；将重组载体转染宿主细胞用于基因治疗，能够在脊髓损伤处表达大量的NT-3和LIF，NT-3和LIF能够针对脊髓损伤的不同发病环节进行治疗，发挥协同作用，从而更好地促进脊髓上下行神经纤维的再生，修复自主运动功能。

[0049] 本发明所述的重组细胞，以MSC细胞作为宿主细胞，由于MSC细胞本身具有分化为神经元的作用，转染LIF基因和NT-3基因后移植入动物体内，可以使LIF基因和NT-3基因长期表达，对脊髓损伤起到更好的治疗效果。

附图说明

[0050] 图1为实施例一所得的L1基因片段和LIF外显子2基因片段的电泳图，其中，1为L1基因片段，2为LIF外显子2基因片段，M为标记；

[0051] 图2为实施例一所得的LIF外显子1基因片段的电泳图，其中，1为LIF外显子1基因片段，M为标记；

[0052] 图3为实施例一所得的LIF基因的电泳图，其中，1为LIF基因，M为标记；

[0053] 图4为实施例二所得的引入特异性酶切位点序列后的LIF基因片段的电泳图，其中，1为引入特异性酶切位点序列后的LIF基因片段，M为标记；

[0054] 图5为pIRES2-EGFP质粒图谱；

[0055] 图6为实施例三所得的pIRES2-LIF-EGFP重组载体图谱；

[0056] 图7为实施例三所得的pIRES2-LIF-EGFP菌液的PCR鉴定电泳图，其中，1为PCR反应产物，M为标记；

[0057] 图8为实施例三所得的pIRES2-LIF-EGFP菌液的酶切鉴定电泳图，其中，1为酶切反应产物，M为标记；

[0058] 图9为实施例四所得的带有限制性内切酶粘性末端的NT-3基因片段的电泳图，其中，1为PCR扩增产物A，2为PCR扩增产物B，M为标记；

[0059] 图10为实施例五所得的pIRES2-LIF/NT-3重组载体图谱；

[0060] 图11为实施例五所得的pIRES2-LIF/NT-3菌液的酶切鉴定电泳图，其中，1为EcoRI/NotI双酶切反应产物，2为BamHI/NotI双酶切反应产物，3为EcoRI/BamHI双酶切反应产物，M为标记；

[0061] 图12为实施例六所得的pVAX1-LIF/IRES/NT-3菌液的酶切鉴定电泳图，其中，1为BamHI/XhoI双酶切反应产物，2为BamHI单酶切反应产物，M为标记；

[0062] 图13为pVAX1质粒图谱；

[0063] 图14为实施例六所得的pVAX1-LIF/IRES/NT-3重组载体图谱；

[0064] 图15为实施例一所述L2基因片段与L3基因片段连接得到LIF基因的反应流程图；

[0065] 图16为实施例四所述杂交PCR反应流程图。

具体实施方式

[0066] 下述实施例中，所用到的实验技术，例如PCR技术、引物设计技术、载体构建技术、检测技术、电泳技术等均为基因工程中的常规技术，本领域技术人员可根据现有技术实现（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，科学出版社第三版；或者按照产品说明书进行）。在操作过程中所用到的设备、试剂、载体、菌株等，均为通过市场购买得到的常规产品。

[0067] 实施例一：LIF基因的获取

[0068] 取人外周血用淋巴细胞分离液分离单个核细胞后，提取基因组DNA，根据基因库（GenBank）的LIF外显子序列设计特异性引物，从人外周血基因DNA中扩增出含有LIF外显子1（L2）的L1基因片段以及LIF外显子2（L3）基因片段；然后设计特异性引物，从L1基因片段中亚克隆出LIF外显子1（L2）基因片段。由于LIF外显子1较小，直接以基因组DNA为模板获取LIF外显子1比较困难，因此通过PCR获取含有LIF外显子1以及部分内含子序列的L1基因片段，然后再以L1基因片段为模板，通过PCR获取LIF外显子1。

[0069] 采用特异性引物扩增得到的LIF外显子1（L2）基因片段的末端与LIF外显子2（L3）基因片段的起始端具有互补序列，以LIF外显子1基因片段与LIF外显子2基因片段按比例混合后进行PCR反应，两者变性、解链、退火后，两片段经由末端互补序列连接（重叠延伸PCR反应），获得LIF基因。

[0070] 虽然已知LIF基因在多种细胞中表达，但表达量较低，而且通过mRNA提取逆转录获取cDNA文库的方法，存在RNA易降、目的基因突变率高等问题，且操作要求高，因此，本发明直接从人外周血单个核细胞中提取基因组DNA来获取目的基因，以克服上述问题，并能提高克隆的效率。

[0071] 1、提取基因组DNA

[0072] 取人外周血淋巴细胞分离液（购自北京索莱宝科技有限公司，产品编号为P8610-200），用快速DNA提取扩增试剂盒（购自北京康为世纪生物技术有限公司，产品编号为CW0556）提取出外周血单个核细胞基因组DNA。

[0073] 2、获取含有LIF外显子1的L1基因片段

[0074] 根据L1基因片段的核苷酸序列，设计特异性引物LIF-1如下：

[0075] LIF-1-5'端引物（如序列表中SEQ ID NO:8所示）：

[0076] 5'-TCTCCCATGCGGCCATTGTTG-3'

[0077] LIF-1-3'端引物（如序列表中SEQ ID NO:9所示）：

[0078] 5'-CCTCCCTGCCATCTCCTGTCAGTATC-3'

[0079] 以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，在上述特异性引物LIF-1的作用下，通过PCR扩增获得L1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图1所示。

[0080] PCR反应体系如下（20μl）：

[0081]

[0082] 其中，2×Prime STAR Max DNA Polymerase为DNA聚合酶-缓冲液复合物，购自宝生物（大连）有限公司，产品编号为R045A。

[0083] PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min。

[0084] 3、获取LIF外显子1（L2）基因片段

[0085] 根据LIF外显子1的核苷酸序列，设计特异性引物LIF-2如下：

[0086] LIF-2-5'端引物（如序列表中SEQ ID NO:10所示）：

[0087] 5'-TTGGCGGCAGGAGTTGTGCC-3'

[0088] LIF-2-3'端引物（如序列表中SEQ ID NO:11所示）：

[0089] 5'-CTGGGCTGTGTAATAGAGAATAAAGAGGG-3'

[0090] 以L1基因片段为模板，在上述特异性引物LIF-2的作用下，通过PCR扩增获得LIF外显子1（L2）基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示。用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图2所示。

[0091] PCR反应体系如下（20μl）：

[0092]

[0093]

[0094] PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min。

[0095] 4、获取LIF外显子2（L3）基因片段

[0096] 根据LIF外显子2的核苷酸序列，设计特异性引物LIF-3如下：

[0097] LIF-3-5'端引物（如序列表中SEQ ID NO:12所示）：

[0098] 5'-CTTTATTCTCTATTACACAGCCCAGG-3'

[0099] LIF-3-3'端引物（如序列表中SEQ ID NO:13所示）：

[0100] 5'-CTAGAAGGCCTGGGCCAACACG-3'

[0101] 以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，在上述特异性引物LIF-3的作用下，通过PCR扩增获得LIF外显子2（L3）基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图1所示。

[0102] PCR反应体系如下（20μl）：

[0103]

[0104] PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min。

[0105] 5、获取LIF基因

[0106] LIF外显子1（L2）基因片段的末端与LIF外显子2（L3）基因片段的起始端具有互补序列，取L2基因片段与L3基因片段按等比例混合，在DNA聚合酶的作用下进行重叠延伸PCR反应（如图15所示），L2基因片段与L3基因片段经末端互补序列连接，得到LIF核心序列基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图3所示。

[0107] 重叠延伸PCR反应体系如下（20μl）：

[0108]

[0109] PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，10个循环；72℃最终延伸5min。

[0110] 实施例二：在LIF基因中引入特异性酶切位点

[0111] 以实施例一所获得的LIF基因为模板，以含有特异性酶切位点的上、下游引物进行PCR反应，在LIF基因序列的两端引入特异性酶切位点序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示。用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图4所示。

[0112] 其中，上游引物含有EcoRI酶切位点序列，下游引物含有BamHI酶切位点序列。

[0113] LIF上游引物（如序列表中SEQ ID NO:14所示）：

[0114] 5'-CGGAATTCATGAAGGTCTTGGCGGCAGG-3'（下划线部分为EcoRI酶切位点序列）；

[0115] LIF下游引物（如序列表中SEQ ID NO:15所示）：

[0116] 5'-CGGGATCCCTAGAAGGCCTGGGCCAACACG-3'（下划线部分为BamHI酶切位点序列）。

[0117] PCR反应体系如下（20μl）：

[0118]

[0119] PCR反应条件为：95℃预变性12min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，10个循环；72℃最终延伸10min。

[0120] 实施例三：pIRES2-LIF-EGFP重组载体的构建

[0121] 使用限制性内切酶EcoRI和BamHI，分别酶切pIRES2-EGFP质粒（该质粒的多克隆位点处含有EcoRI、BamHI酶切位点）以及引入酶切位点后的LIF基因，得到酶切后线性化的pIRES2-EGFP载体以及酶切后的LIF序列。采用T4DNA连接酶体系，在22℃下孵育30分钟，转化，抗性筛选出阳性菌落，构建出pIRES2-LIF-EGFP重组载体（如图6所示）。

[0122] 由pIRES2-EGFP质粒的结构特点（如图5所示）可知，LIF基因插入pIRES2-EGFP质粒的多克隆位点后，位于质粒载体的自身序列IRES的上游（如图6所示），即在同一启动子启动下的LIF和EGFP双基因分别表达。

[0123] 1、双酶切pIRES2-EGFP质粒

[0124] 酶切反应体系如下（20μl）：

[0125]

[0126]

[0127] 酶切反应条件：在37℃下反应6个小时。

[0128] 2、双酶切LIF基因

[0129] 酶切反应体系如下（20μl）：

[0130]

[0131] 酶切反应条件：在37℃下反应6个小时。

[0132] 3、连接LIF基因和pIRES2-EGFP载体，构建pIRES2-LIF-EGFP重组载体[0133] 连接反应体系如下（20μl）：

[0134]

[0135] 连接反应条件：22℃孵育30分钟。

[0136] 4、pIRES2-LIF-EGFP重组载体的鉴定

[0137] 在200μl感受态细胞JM109中（1～2×109Bacteria/ml），加入20μl上述连接反应产物，置于冰上冷却10～20min后，置于42℃水浴锅中热激45s，然后加入LB液体培养基780ul。在37℃条件下，于150转/分钟的摇床上复苏培养60min，将复苏过的菌液涂布在含有卡那霉素抗性的LB平板上，在37℃下倒置培养16～18小时。挑取阳性菌落至LB卡那霉素抗性液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养12～16小时。

[0138] 取阳性菌落菌液，进行菌液PCR初步鉴定，PCR反应体系如下（20μl）：

[0139]

[0140]

[0141] 其中，2×Power Taq PCR Master Mix为DNA聚合酶-酶缓冲液dNTPs复合物。

[0142] PCR反应条件为：95℃预变性12min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸10min。

[0143] 取菌液PCR反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。在609bp处出现电泳条带，与目的基因--LIF基因的分子量大小一致（如图7所示），表明pIRES2-LIF-EGFP重组载体构建成功。

[0144] 采用质粒提取试剂盒（购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW0511），按照试剂盒说明书操作，提取阳性菌落的质粒，进行酶切鉴定。

[0145] 酶切反应体系如下（10μl）：

[0146]

[0147] 酶切反应条件：在37℃下反应1个小时。

[0148] 取酶切反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。电泳后出现两条条带，其中一条出现在609bp处，与目的基因--LIF基因的分子量大小一致（如图8所示），表明pIRES2-LIF-EGFP重组载体构建成功。

[0149] 实施例四：NT-3基因的获取

[0150] 根据NT-3基因序列和pIRES2-EGFP质粒载体上预期插入的多克隆位点，设计两对长度不同、带有限制性内切酶粘性末端的引物；以人外周血单个核细胞基因组DNA为模板，分别用两对引物进行PCR扩增，得到两种PCR扩增产物；将两种PCR扩增产物混合后依次进行变性和退火，得到四种NT-3基因片段，其中两种NT-3基因片段的两端带有限制性内切酶粘性末端，由此无需使用限制性内切酶进行酶切，即可将NT-3基因片段定向连接到质粒载体的预期多克隆位点中。

[0151] 与传统的PCR产物克隆方法相比，本方法（双PCR法）具有简单易行、成本低、效率高、通用性好等优点，可以广泛应用于PCR产物的快速克隆。在本方法中，不需要使用限制性内切酶处理PCR产物，即可得到含有限制性内切酶粘性末端的DNA片段，可以充分利用基因载体的多克隆位点，无需考虑目的基因中是否含有与载体多克隆位点相同的酶切位点，可以轻松实现目的基因的定向克隆。

[0152] 1、引物设计

[0153] 根据NT-3基因的核苷酸序列（见序列表中SEQ ID NO:2）和pIRES2-EGFP质粒载体上预期插入的多克隆位点，设计两对长度不同、带有限制性内切酶粘性末端的引物，如下：

[0154] NT-3第一对引物（FS/RS引物对）由NT-3上游短引物FS和NT-3下游短引物RS组成：

[0155] NT-3上游短引物FS（如序列表中SEQ ID NO:16所示）：

[0156] 5'-ATGTCCATCTTGTTTTATGTGATATTTCTCGC-3'

[0157] 下划线部分为限制性内切酶BstXI识别序列中切割位点上游序列的反向互补序列，斜体字母ATG为NT-3基因的起始密码子；

[0158] NT-3下游短引物RS（如序列表中SEQ ID NO:17所示）：

[0159] 5'-GCTCATGTTCTTCCGATTTTTCTCGAC-3'

[0160] 下划线部分为限制性内切酶NotI识别序列中切割位点上游序列的反向互补序列。

[0161] NT-3第二对引物（FL/RL引物对）由NT-3上游长引物FL和NT-3下游长引物RL组成：

[0162] NT-3上游长引物FL（如序列表中SEQ ID NO:18所示）：

[0163] 5'-AACCATGTCCATCTTGTTTTATGTGATATTTC-3'

[0164] 下划线部分为限制性内切酶BstXI识别序列中切割位点下游序列，斜体字母ATG为NT-3基因的起始密码子；

[0165] NT-3下游长引物RL（如序列表中SEQ ID NO:19所示）：

[0166] 5'-GGCCGCTCATGTTCTTCCGATTT-3'

[0167] 下划线部分为限制性内切酶NotI识别序列中切割位点下游序列。

[0168] FS/RS引物对和FL/RL引物对的靶序列（即与NT-3基因相应的序列）相同。

[0169] 限制性内切酶BstXI的识别序列为：5'-CCANNNNN/NTGG-3'

[0170] 限制性内切酶NotI的识别序列为：5'-GC/GGCCGC-3'

[0171] 2、获取带有限制性内切酶粘性末端的NT-3基因片段

[0172] 以人外周血单个核细胞基因组DNA为模板，用FL/RL引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A；另用FS/RS引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物B。PCR扩增产物A和PCR扩增产物B均含有NT-3基因序列。

[0173] PCR反应体系如下（20μl）：

[0174]

[0175]

[0176] PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min。

[0177] 分别取PCR扩增产物A和PCR扩增产物B，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。电泳后出现两条分子量大小约为774bp的条带，与目的基因——NT-3基因的分子量大小一致（如图9所示）。

[0178] 分别取PCR扩增产物A和PCR扩增产物B进行测序，结果表明：PCR扩增产物A的5'端比PCR扩增产物B的5'端多4个核苷酸，PCR扩增产物A的3'端也比PCR扩增产物B的3'端多4个核苷酸，其余序列完全相同。

[0179] 将PCR扩增产物A和PCR扩增产物B等摩尔混合，进行杂交PCR反应，得到NT-3基因片段混合物。

[0180] 杂交PCR反应体系如下（20μl）：

[0181]

[0182] 杂交PCR反应条件如下：95℃5min，80℃1min，70℃1min，65℃1min，60℃1min，55℃1min，40℃1min，16℃保存。

[0183] PCR扩增产物A和PCR扩增产物B变性后，得到四种DNA单链，四种DNA单链随机组合，产生四种等比例的DNA片段--NT-3基因片段I、NT-3基因片段II、NT-3基因片段III以及NT-3基因片段IV（如图16所示，直线省略区域为序列表SEQ ID NO:2所示的NT-3基因序列）。其中，NT-3基因片段III和NT-3基因片段IV为杂交DNA片段。NT-3基因片段III的5'末端具有BstXI粘性末端，其3'末端具有NotI粘性末端。

[0184] 实施例五：pIRES2-LIF/NT-3重组载体的构建

[0185] 使用限制性内切酶BstXI和NotI，双酶切pIRES2-LIF-EGFP重组载体。由于内切酶BstXI位于pIRES2-LIF-EGFP重组载体中的IRES序列下游的终点与EGFP序列上游的起始处，而内切酶NotI位于pIRES2-LIF-EGFP重组载体中的EGFP序列的下游终点处，因此，通过这两个酶切位点插入NT-3基因片段后，NT-3基因位于IRES序列的下游，从而使得LIF基因与NT-3基因分别位于IRES序列的两侧（如图10所示），实现了两个目的基因的协同表达，并能避免融合蛋白的产生。

[0186] 1、双酶切pIRES2-LIF-EGFP重组载体

[0187] 酶切反应体系如下（20μl）：

[0188]

[0189] 酶切反应条件：在37℃下反应6个小时。

[0190] 2、连接NT-3基因和pIRES2-LIF-EGFP重组载体，构建pIRES2-LIF/NT-3重组载体[0191] 将实施例四制得的NT-3基因片段混合物与酶切后线性化的pIRES2-LIF-EGFP重组载体混合（NT-3基因片段与pIRES2-LIF-EGFP重组载体的摩尔比为4︰1），加入T4DNA连接酶，在22℃下孵育30分钟，构建出pIRES2-LIF/NT-3重组载体。

[0192] NT-3基因片段混合物中的四种DNA片段，只有NT-3基因片段III具有与pIRES2-LIF-EGFP重组载体互补的粘性末端，从而能够与pIRES2-LIF-EGFP重组载体定向连接，其它三种NT-3基因片段均不能与pIRES2-LIF-EGFP重组载体定向连接。

[0193] 连接反应体系如下（20μl）：

[0194]

[0195] 连接反应条件：22℃孵育30分钟。

[0196] 3、pIRES2-LIF/NT-3重组载体的鉴定

[0197] 将20μl上述连接反应产物加入到200μl感受态细胞JM109中（1～9
2×10Bacteria/ml），置于冰上冷却10～20min后，置于42℃水浴锅中热激45s，然后加入LB液体培养基780ul。在37℃条件下，于150转/分钟的摇床上复苏培养60min，将复苏过的菌液涂布在含有卡那霉素抗性的LB平板上，在37℃下倒置培养16～18小时。挑取阳性菌落至LB卡那霉素抗性液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养12～16小时。

[0198] 采用质粒提取试剂盒（购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW0511），按照试剂盒说明书操作，提取阳性菌落的质粒，进行酶切鉴定。

[0199] 酶切反应体系一（10μl）：

[0200]

[0201] 酶切反应体系二（10μl）：

[0202]

[0203] 酶切反应体系三（10μl）：

[0204]

[0205] 酶切反应条件：在37℃下反应1个小时。

[0206] 分别取上述酶切反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图11所示。Lane1为pIRES2-LIF/NT-3重组载体被EcoRI/NotI双酶切的产物，在1984bp处出现一条带，为LIF-IRES-NT-3基因片段；Lane2为pIRES2-LIF/NT-3重组载体被BamHI/NotI双酶切的产物，在1369bp处出现一条带，为IRES-NT-3基因片段；Lane3为pIRES2-LIF/NT-3重组载体被EcoRI/BamHI双酶切的产物，在615bp处出现一条带，为LIF基因片段。上述酶切结果均与预期酶切后的条带大小一致，酶切鉴定pIRES2-LIF/NT-3质粒构建成功。

[0207] 实施例六：pVAX1-LIF/IRES/NT-3重组载体的构建

[0208] 使用限制性内切酶EcoRI和NotI，分别酶切pIRES2-LIF/NT-3重组载体和pVAX1质粒载体（该质粒的多克隆位点处含有EcoRI、NotI酶切位点，如图13所示），分别回收pIRES2-LIF/NT-3重组载体上的LIF/IRES/NT-3基因片段以及酶切后线性化的pVAX1载体，采用T4DNA连接酶体系，在22℃下孵育30分钟，转化，抗性筛选出阳性菌落，构建出pVAX1-LIF/IRES/NT-3重组载体（如图14所示）。pVAX1质粒载体是目前临床前研究的最安全的载体之一，构建PVAX1-LIF/IRES/NT-3重组载体，更适用于脊髓损伤的临床基因治疗。

[0209] 1、双酶切pIRES2-LIF/NT-3重组载体，回收LIF/IRES/NT-3基因片段[0210] 酶切反应体系如下（30μl）：

[0211]

[0212] 酶切反应条件：在37℃下反应6个小时。

[0213] 用1%琼脂糖凝胶进行电泳，然后采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW2302），按照试剂盒说明书操作，回收从pIRES2-LIF/NT-3重组载体上酶切下的LIF/IRES/NT-3基因片段。

[0214] 2、双酶切pVAX1质粒

[0215] 酶切反应体系如下（30μl）：

[0216]

[0217] 酶切反应条件：在37℃下反应6个小时。

[0218] 用1%琼脂糖凝胶进行电泳，然后采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW2302），按照试剂盒说明书操作，回收酶切后线性化的pVAX1载体。

[0219] 3、连接LIF/IRES/NT-3基因片段和pVAX1质粒，构建pVAX1-LIF/IRES/NT-3重组载体

[0220] 取回收得到的LIF/IRES/NT-3基因片段及线性pVAX1载体，采用T4DNA连接酶体系，在22℃下孵育30分钟，构建pVAX1-LIF/IRES/NT-3重组载体（如图14所示）。

[0221] 连接反应体系如下（20μl）：

[0222]

[0223] 4、pVAX1-LIF/IRES/NT-3重组载体的鉴定

[0224] 将20μl上述连接反应产物加入 200μl感受态细胞JM109中(1 ～9
2×10Bacteria/ml）)，置于冰上冷却10～20min后，置于42℃水浴锅中热激45s，然后加入LB液体培养基780ul。在37℃条件下，于150转/分钟的摇床上复苏培养60min，将复苏过的菌液涂布在含有卡那霉素抗性的LB平板上，在37℃下倒置培养16～18小时。挑取阳性菌落至卡那霉素抗性液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养12～16小时。

[0225] 采用质粒提取试剂盒（购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW0511），按照试剂盒说明书操作，提取阳性菌落的质粒，进行酶切鉴定。

[0226] 酶切反应体系一（10μl）：

[0227]

[0228] 酶切反应体系二（10μl）：

[0229]

[0230] 酶切反应条件：在37℃下反应1个小时。

[0231] 取酶切反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图12所示。Lane1为pVAX1-LIF/IRES/NT-3重组载体被BamHI/XhoI双酶切的产物，出现三条基因片段，638bp处为带有部分酶切序列的LIF基因片段，1369bp处为带有部分酶切序列的IRES-NT-3基因片段，2943bp处为pVAX1载体序列；Lane2为pVAX1-LIF/IRES/NT-3重组载体被BamHI酶切的产物，出现两条基因片段，638bp处为带有部分酶切序列的LIF基因片段，4312bp处为带有IRES-NT-3基因片段的pVAX1载体序列。上述酶切结果均与预期酶切后的条带大小一致，酶切鉴定pIRES2-LIF/NT-3质粒构建成功。

[0232] 将pIRES2-LIF/NT-3重组载体与pVAX1-LIF/IRES/NT-3重组载体送至金唯智生物科技（北京）有限公司进行测序，经测序与预期结果一致，进一步证明载体构建成功。

[0233] 以上实施例详细描述了本发明的实施方式，但并非为对本发明专利范围的限制。对本领域的技术人员来说，在本发明构思下所做出的变形和改进，都属于本发明的保护范围。