一种提高植物抗氧化能力的方法

摘要

本发明公开了一种植物抗氧化及抗逆相关蛋白2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸环化酶（EaispF1）及其编码的基因和应用。本发明提供的蛋白是1）或2）的蛋白：1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2）在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与植物抗氧化和抗逆相关的由1）衍生的蛋白。EaispF1是通过调控植物体内抗氧化和抗逆相关的异戊二烯类化合物的合成，从而在植物抗氧化和抗逆胁迫过程中发挥重要的作用。本发明不仅为研究EaispF1在植物氧化胁迫和逆境胁迫过程中的作用奠定基础，而且还利用基于工程的方法提高作物的抗氧化、抗高温和抗高光的能力，从而提供一个培育抗性品种的新方法。

权利要求

1.紫茎泽兰的异戊二烯类化合物的生物合成路径上关键的酶2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶IspF在培育抗氧化胁迫和抗高光、高温紫茎泽兰或拟南芥中的应用，所述IspF酶由紫茎泽兰EaIspF1基因编码，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

说明书

一种提高植物抗氧化能力的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种提高植物抗氧化能力和抗逆能力的方法，具体涉及异戊二烯合成途径上的一个关键的酶。

背景技术

[0002] 植物在生长过程中会受到各种各样的环境因素的胁迫，包括温度、光照、水分已经病原菌等。这些外部的环境因素胁迫常常会影响植物的生长和发育，也是现代农作减产的主要原因。当植物受到胁迫时，在其体内产生活性自由基时植物受到胁迫后的初始反应之1
一。其中，一些活性氧化合物，如H2O2，O2等被发现是一种信号分子，能够调节下游胁迫相关基因的表达，使植物获得抗性，而另外还有一些活性氧自由基目前还没有发现其充当信号
2-
分子方面的作用，如O 等。虽然一些活性氧自由基能够诱导下游胁迫相关基因的表达，但是如果对于强度读，周期长的胁迫使植物体内的活性氧自由基长时间处于高水平，就会使植物细胞内的膜结构，蛋白以及核酸的易被还原的物质的结构受到破坏，导致细胞死亡。因此，植物通过清除系统来维持体内活性氧自由基的平衡，主要是通过一系列过氧化物歧化酶和活性氧清除剂来降低植物体内的活性氧的含量。

[0003] 异戊二烯类化合物是植物体内具有多变结构和功能的化合物之一，由于其富含不饱和结构，所以很多异戊二烯类化合物又是重要的活性氧自由基清除剂，如常见的类胡萝卜素，维生素E，异戊二烯都是植物植物体内重要的活性氧清除剂。提高植物体内的活性氧清除剂的含量是增强植物抗氧化胁迫能力的重要方法之一，也是增加植物抗逆能力的方法之一。因此，本发明通过改变异戊二烯类化合物合成途径上的调控基因的表达从而增加异戊二烯类活性氧清除剂的含量，使植物获得更强的抗氧化能力，提高植物的抗逆能力。

发明内容

[0004] 异戊二烯类化合物是通过C5结构基本单元异戊焦磷酸（IPP）和二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）合成的。植物体内，IPP是通过甲羟戊酸（MVA）途径和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径合成。MVA途径在植物的细胞质中发生，而MEP途径是在叶绿体中发生，如图1。DMAPP是由MVA和MEP途经合成的IPP在叶绿体中由IPP异构酶催化生成DAMPP。由MEP途径生产的IPP后经过一系列酶的作用下生成类胡萝卜素等异戊二烯类化合物。通过对MEP通路上重要的合成酶的调控，使植物增加IPP的合成，从而增加下游异戊二烯类化合物的产量，在这些化合物中，一些是和植物的抗氧化能力密切相关，因此，通过此方法，可以改善植物的抗氧化能力和抗逆能力。2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸环化酶（ispF）是MEP途径上的关键酶，通过改变ispF1基因的表达量，可以改变下游某些异戊二烯类化合物的含量。

[0005] 本发明要解决的技术问题是为提高植物的抗氧化能力的转基因技术领域提供一种新的有效选择。

[0006] 本发明解决该技术问题的技术方案是提供了EaispF1基因在提高植物抗氧化能力中的用途

[0007] 其中，上述的EaispF1基因的核苷酸序列为（1）如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或（2）在（1）的限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得到的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:1的序列编码功能相同或相似的蛋白或多肽。

[0008] 本发明还提供了EaispF1基因编码的蛋白在一种培育抗氧化植物中的用途。其中所述的EaispF1基因的核苷酸序列为（1）如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或（2）在（1）的限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得到的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:1的序列编码功能相同或相似的蛋白或多肽。

[0009] 本发明还提高了一种提高植物抗氧化能力和抗逆能力的方法，其特征包括以下方面：

[0010] （1）将EaispF1基因可操作的链接与载体上的表达调控序列后，形成所述的EaispF1基因的重组载体；

[0011] （2）将步骤（1）中的重组载体转入植物，经过筛选得到阳性转化植株。

[0012] （3）将（2）中的阳性转化植株经过培育得到转基因抗氧化及抗逆植株后代，所述的后代包括植物种子和植物组织。

[0013] 6.其中（5）中所述的EaispF1序列具有如下特点：（1）如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或（2）在（1）的限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得到的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:1的序列编码功能相同或相似的蛋白或多肽。

[0014] 本发明的效果在于：提供了EaispF1基因在提高植物抗氧化能力方面的用途，在本发明的实施例中，通过实验的手段证明了EaispF1基因的过量表达使植物的抗氧化能力有明显的提高，从而导致植物的抗高温胁迫以及高光胁迫的能力有显著的提高，说明EaispF1基因能有效的提高植物的抗氧化和抗逆能力。本发明培养出抗氧化和抗逆能力的方法也非常简单有效，在提高植物抗氧化和抗逆能力方面具有非常好的应用前景。

附图说明

[0015] 图1为MEP途径。

[0016] 图2为紫茎泽兰总RNA图示。

[0017] 图3为EaispF1基因的3’Race-PCR产物图示。

[0018] 图4为EaispF1基因的5’Race-PCR产物图示。

[0019] 图5为EaispF1基因在紫茎泽兰叶、茎和根部的表达特征，结果为平均值±标准差（n=3）。

[0020] 图6为EaispF1基因受光诱导的表达情况，结果为平均值±标准差（n=3）。

[0021] 图7为EaispF1基因受MeJA诱导表达特征，结果为平均值±标准差（n=3）。

[0022] 图8为EaispF1基因受SA诱导表达特征，结果为平均值±标准差（n=3）。

[0023] 图9为EaispF1基因受NaCl诱导表达特征，结果为平均值±标准差（n=3）。

[0024] 图10为EaispF1基因受ABA诱导表达特征，结果为平均值±标准差（n=3）。

[0025] 图11为EaispF1基因受乙烯诱导表达特征，结果为平均值±标准差（n=3）。

[0026] 图12为EaispF1基因受干旱诱导表达特征，结果为平均值±标准差（n=3）。

[0027] 图13为EaispF1基因受伤害诱导表达特征，结果为平均值±标准差（n=3）。

[0028] 图14为EaispF1基因构建到pCAMBIA1300载体上的是示意图。

[0029] 图15为转EaispF1基因拟南芥T1代PCR检测。1，2，3，4，5依次为T1代转基因株系T1，T3，T6，T7，T8；6：野生型对照；M：DNA Marker(BM2000，2000bp；1000bp；750bp；500bp；250bp；100bp)。

[0030] 图16为EaispF-GFP在转EaispF1拟南芥T2代幼苗叶肉细胞中的绿色荧光信号的分部情况。

[0031] 图17为转EaispF1基因拟南芥在百草枯胁迫下，a.野生型（WT）和转基因EaispF1（T）鲜重的比较，Mock为水处理对照，PQ为2umol百草枯处理；b.与对照组相比，野生型（WT）和转基因EaispF1（T）叶绿素含量的比较；c.H2O2应答基因Ferritin1表达的变化；d.丙二醛（MDA）含量。

[0032] 图18为转EaispF1基因和野生型拟南芥在胁迫下Fv/Fm a.高温胁迫；b.高光胁迫。

[0033] 图19转EaispF1基因和野生型拟南芥在胁迫下玉米黄质的含量的变化。a.高温胁迫；b.高光胁迫。

[0034] 图20为转EaispF1基因和野生型拟南芥在胁迫下H2O2应答基因Ferritin1表达的变化。a.高温胁迫；b.高光胁迫；

[0035] 图21转EaispF1基因和野生型拟南芥在胁迫下1O2应答基因AAA-ATPase表达的变化变化。a.高温胁迫；b.高光胁迫

[0036] 图22转EaispF1基因和野生型拟南芥在胁迫下丙二醛（MDA）表达的变化变化。a.高温胁迫；b.高光胁迫。
具体实施例

[0037] 实施例1紫茎泽兰EaispF1基因的克隆

[0038] 紫茎泽兰种子采自云南省。将花卉土：蛭石按2:1比例混合均匀，装入直径为25cm花盆中，将装有培养土的花盆放入盛有自来水的大盆中，待水慢慢渗入培养土中。将紫茎泽兰的种子撒到已经润湿的培养土上，再在种子上面铺一层厚度为2mm细土，最后用纸将花盆盖住防止水分过度蒸发，5-7d后待紫茎泽兰幼苗长出来后，移去花盆上的纸，在温室中培养8周。提取幼苗的总RNA，如图2所示。

[0039] 采用原位杂交技术筛选出紫茎泽兰EaispF1基因的cDNA序列，经酶切鉴定，获得个阳性克隆，经鉴定为IspF基因的部分序列。为获得EaispF1基因序列全长，采用RACE-PCR技术分别对EaispF1的5’端和3’端进行扩增。

[0040] 3’Race-PCR对EaispF1基因的3’端序列的扩增。根据原位杂交所得的部分EaispF1基因的序列，设计3’Race特异性引物。采用TaKaRa公司3’-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒，以紫茎泽兰总RNA为模板，使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）将Poly(A)+RNA反转录成cDNA，以反转录的cDNA为模板,3ISPFO：

[0041] 5’-GACATTGGGCAGATCTTTCCAG-3’和3ISPFN：

[0042] 5’-GAAAGGGGCAGCATCATCCGTG-3’为正向引物，试剂盒中的通用引物为反向引物，依照试剂盒的使用指南，获得了大小为550bp的EaispF1基因的3’端DNA片段，如图3。通过氯化钙介导法转化到大肠杆菌GM109菌株进行测序。

[0043] 5’RACE-PCR对EaispF1基因的5’端序列的扩增。根据得到的部分EaispF1基因的序列，设计一个特异性反向引物为RIGSP1：5’-CTCCACCTTGAGTTCTTTCCTC-3’用于cDNA的合成，另外两个特异性反向引物分别为SIGSP2：5'-CAGCTACTAAAGTTCCATCTGCCA-3’和PIGSP3：5'-CGCCCGAGAATGTGTCGGTTAC-3’，所用的正向引物为试剂盒中的通用引物。根据试剂盒说明书的步骤进行巢式PCR反应，获得了两条特异性条带，分别为490bp和856bp，如图4。将该片段回收后连接至pMD18-T载体上，再转入GM109大肠杆菌感受态细胞，进行测序。测序结果显示，这两个PCR产物都含有EaispF1基因的5’序列。最后将EaispF1基因的cDNA片段、3’Race-PCR片段和5’RACE-PCR片段拼接起来，得到EaispF1整个的cDNA序列。

[0044] 实施例2EaispF1基因序列分析

[0045] EaispF1基因的cDNA全长859bp，具有一个完整的开发阅读框架，编码由231个氨基酸残基组成的蛋白，如图5，推测蛋白的理论等电点为8.67，分子量为24.8kDa。通过ChloroP系统的预测，氮端的1-28氨基酸编码一个信号肽，定位在叶绿体。将EaispF1基因的预测氨基酸序列和其他ispF基因的氨基酸序列进行比对发现，EaispF1属于MECDP合成酶家族，和其他的IspF有很高的同源性，如蛇菊（Stevia rebaudiana）的同源性95%、拟南芥（Arabidopsis thaliana）的同源性87%、长春花（Catharanthus roseus）的同源性82%、银杏（Ginkgo biloba）的同源性78%、红豆杉（Taxus x media）的同源性73%、苜蓿（Medicago truncatua）的同源性72%。

[0046] 实施例3EaispF1基因表达特征

[0047] （1）EaispF1基因在不同组织中表达特征

[0048] 提取紫茎泽兰的叶，茎和根总RNA，以EaispF1基因的特异性引物IR-PF和IR-PR，内参基因UBQ7的特异性引物ZUB-F和ZUB-R进行实时荧光定量PCR，分析EaispF1基因的组织表达特异性，如图5。EaispF1基因在根、茎和叶中都有表达，且在叶部的相对表达量最高，为根的6倍，其次是茎，其表达量为根部的2倍。

[0049] （2）EaispF1基因在不同光照条件下表达特征

[0050] EaispF1基因表达受到不同光照的影响，如图6。将紫茎泽兰从普通的光照条件下转移到黑暗的条件，EaispF1基因的表达量呈现下降的趋势。当8h光照后，将样品转到正常光照的条件下，EaispF1基因的表达开始上调，6h后EaispF1基因的表达量达到最大值，为3.10±0.45倍。随后的12h和16h，EaispF1基因的转录水平有所下降。正常光照后，用强光处理将样品，结果发现EaispF1基因的mRNA水平快速上升，24h时EaispF1的表达量到达峰值，为10.99±0.99倍。

[0051] （3）EaispF1基因在不同胁迫条件下表达特征

[0052] 本论文对EaispF1基因受不同信号物质和胁迫的诱导表达进行分析。分别用100μmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）、1mmol/L水杨酸（SA）、100μmol/L脱落酸(ABA)、300mmol/L氯化钠（NaCl）、1mmol/L的乙烯（ethylene）、20%PEG6000(干旱胁迫)和刺伤胁迫处理生长8周的紫茎泽兰幼苗，并分别提取不同时间处理的紫茎泽兰植株幼苗总RNA。以紫茎泽兰的UBQ7基因为内参基因，未处理紫茎泽兰幼苗的作为对照。MeJA处理使EaispF1基因的表达量快速上调，处理后3h即到达最大值为2.80±0.2倍，之后其表达量开始持续下降，如图7。SA处理后，EaispF1基因的转录水平呈现逐步上升，在12h达到峰值为2.5倍，随后其转录水平逐渐下降，如图8。NaCl、ABA和ethylene处理没有对EaispF1基因表达量产生影响，如图9、10和11。干旱胁迫对EaispF1基因的转录水平影响不显著，如图12。刺伤胁迫使EaispF1基因的表达量快速提高，处理后6h便到达最高值为3.72±0.19倍，如图13。

[0053] 实施例4转EaispF1基因超表达拟南芥株系的获得

[0054] 将实施例1中克隆的EaispF1基因cDNA构建到启动子为CaMV35S植物表达载体pCAMBIA1300，如图14。通过农杆菌介导的花粉管转化法，将EaispF1基因转入拟南芥植株细胞，筛选获得4个转基因超表达拟南芥株系，其PCR鉴定结果如图15所示。

[0055] 实施例5EaispF1亚细胞定位

[0056] EaispF1的信号肽预示其蛋白表达后的位置为叶绿体。EaispF1在转基因拟南芥的的亚细胞定位通过EaispF1-GFP在植物中的表达来确定。用激光共聚焦扫描显微镜观察生长5天的T2代转基因幼苗，发现EaispF1-GFP的荧光信号在植物细胞的叶绿体中，和叶绿素的红色荧光信号相重叠。如图16，说明EaispF1定位于细胞内的叶绿体中。

[0057] 实施例6转EaispF1基因拟南芥中的类胡萝卜素含量分析

[0058] 生长4周的野生型和转EaispF1基因拟南芥体内叶绿素和类胡萝卜素含量通过液相色谱-紫外检测器将这些色素进行分析，分析方法如下：

[0059] 取生长4周的野生型和转EaispF1基因拟南芥的叶片进行叶绿素和多种类胡萝卜素含量的测定分析。在绿灯下，取1g叶片在液氮中研磨，然后加入5mL丙酮：水：NH4OH为80：20：0.01的提取液后，-20℃避光提取，过夜，再在绿光下10000g离心5min，取上清，过0.45nm过滤膜，至新管，待测。样品用高效液相色谱分离，荧光检测器检查。色谱柱为Adsorbsphere C18反相色谱柱（Alltech，4.6×15mm,3μm）。梯度洗脱程序：0min，乙酸乙酯（A）：0.01%乙酸铵（B）=0:100；15min，A:B=20:80；25min，A:B=80:20。叶绿素和类胡萝卜素均在445nm吸收值下检查。通过外标法，对样品中的这些色素的保留时间和含量进行定量定性分析。如表1所示，所检测色素的保留时间和标准曲线方程以及相关系数。

[0060] 表1叶绿素和类胡萝卜素的保留时间、标准曲线和相关系数

[0061]

[0062] 研究发现，EaispF1基因在拟南芥超表达，提高了转EaispF1基因拟南芥植株叶片的叶绿素含量和类胡萝卜素的含量（表1）。转EaispF1基因拟南芥比野生型拟南芥植株叶片叶绿素含量增加12.3%～15.2%、叶绿素b含量增加9.2%-13.6%、类胡萝卜素的含量也显著提高：紫黄质含量增加53.3%～102.4%；叶黄素含量增加16.5%～38.5%；β-胡萝卜素含量增加25.5%～50.8%；总类胡萝卜素含量增加20.3%～41.7%。花药黄质、玉米黄质和新黄质的含量没有明显变化。

[0063] 表2野生型和转基因型拟南芥中叶绿素和萝卜素的含量

[0064]

[0065] 实施例7转EaispF1基因拟南芥中的抗氧化能力增强

[0066] 5天的转EaispF1基因和野生型拟南芥分别喷洒水和2umol/L的百草枯，黑暗孵育12h，置于持续光照（光强为120μmol m-2s-1）下培养72小时，与0，24，48，72小时取样，测其鲜重，叶绿素含量，H2O2应答基因表达量，丙二醛（MDA）含量。实验结果表明胁迫处理后，转EaispF1基因拟南芥在鲜重和叶绿素两项指标上高于野生型拟南芥，而转EaispF1基因拟南芥在H2O2应答基因表达量和丙二醛（MDA）含量这两项至于上要低于野生型拟南芥。以上结果说明转EaispF1基因拟南芥的健康程度优于野生型拟南芥，其抗氧化能力强于野生型拟南芥，如图17。

[0067] 实施例8转EaispF1基因拟南芥的抗高光和高温能力增强

[0068] 将4周大的转EaispF1基因和野生型拟南芥用高温胁迫和高光胁迫处理，胁迫处理方法如下：（1）高温胁迫。将上述幼苗置于持续光照（光强为120μmol m-2s-1），温度为35℃的培养箱中，处理12天，分别于0，1，3，6，9，12天进行取样，检测植物的光合系统II最大光化学电子产量（Fv/Fm）、紫黄素含量，H2O2和 1O2应答基因表达量，丙二醛MDA含量。（2）高光胁迫。将上述幼苗置于持续光照（光强为1000μmol m-2s-1），温度为22℃的培养箱中，处理4天，分别于0，6，24，48，72，96小时进行取样，检测植物的光合系统II最大光化学电子产量（Fv/Fm）、紫黄素含量，H2O2和 1O2应答基因表达量，MDA含量。

[0069] 在高温的胁迫下，转EaispF1基因和野生型拟南芥的Fv/Fm都下降到0.83，没有明显差别。随着胁迫的进行，转EaispF1基因拟南芥的Fv/Fm下降幅度相较与野生型的Fv/Fm更小。在胁迫处理9d后，转EaispF1基因和野生型拟南芥Fv/Fm之间的差别最大，达到0.08，说明转基因拟南芥的光合系统II的活性明显高于野生型拟南芥。在高光胁迫处理24h后，转EaispF1基因拟南芥的Fv/Fm的下降到0.73，而野生型拟南芥Fv/Fm下降至0.67，他们之间的差距是胁迫中所用检测点中的最大值，为0.06。随着时间的推移，转EaispF1基因和野生型拟南芥Fv/Fm之间的距离变小，但是转基因拟南芥的始终高于野生型拟南芥的Fv/Fm，如图18。

[0070] 叶黄素循环是植物适应不同光条件下的一个重要的调节机制。当植物所吸收的光能超过光化学反应所需的光能的时候，紫黄质（violaxanthin）吸收多余的光能转变为花药黄质，后者在转变为玉米黄质（zeaxanthin），将多余的光能以热能的形式耗散掉。当植物在高温和高光的胁迫下，叶黄素循环会使玉米黄质的量增加，来将多余的光能通过热能的形式耗散掉。另外，玉米黄质和β-胡萝卜素等一些类胡萝卜素是重要的抗氧化物质，能够清除植物体内的活性氧自由基。在表2所述，转EaispF1基因拟南芥的类胡萝卜素含量比野生型拟南芥有明显的升高，所以在转基因拟南芥在高温和高光的胁迫下表型出较高的光合系统II的活性可能是因为叶黄素循环和一些类胡萝卜素的清除作用所致。在胁迫处理48h后，转基因拟南芥中的玉米黄素的累计量要明显高于野生型的累积量，说明转基因拟南芥在胁迫过程中通过叶黄素的循环耗散掉更多的过剩的光能，同时较多的玉米黄质也会有更强的清除活性氧自由基的能力，如图19。

[0071] 前面已经提到了，玉米黄素和β-胡萝卜素可以清除植物体内过量的活性氧自由基，保护植物体内重要的光合作用的元件不受损伤。Ferritin1和AAA-ATPase基因分别1
是H2O2和 O2的应答基因，他们的表达量分别和这两中活性氧的量是正相关。转基因拟南
1
芥中的H2O2和 O2的累积量低于野生型拟南芥。高温胁迫下，转基因拟南芥中的Ferritin1基因的表达量明显低于其在野生型的表达量，如图20a。由于单线态氧在高温胁迫下不富集，所以AAA-ATPase基因的表达没有变化，如图21a。在高光的胁迫下，转基因拟南芥中Ferritin1和AAA-ATPase基因的表达量明显低于其在野生型的表达量，说明转基因拟南芥
1
体内富集的H2O2和 O2的富集量低于野生型拟南芥，如图20b和21b。

[0072] 活性氧自由基和生物膜的磷脂，酶和膜受体相关的不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质发生脂质过氧化反应，生成脂质过氧化物，如丙二醛（Malonaldehyde，MDA），导致细胞膜的通透性和流动性发生改变，结构和功能遭到破坏。通过分析植物体内的丙二醛的量，可以评估植物体内的氧化胁迫的程度。在高温处理48h，转基因拟南芥株系中的MDA明显低于野生型拟南芥，说明转基因拟南芥受到不良环境的胁迫所引起的氧化胁迫小于野生型拟南芥，如图22。

[0073] 综上所述，由于EaispF1基因的超表达，使得转基因植物体内的类胡萝卜素含量上升，导致转基因植物具有更强的抗氧化能力，从而增加了对高温和高光胁迫的抵抗能力。