棉花硬脂酰去饱和化酶GbSSI2基因及应用

摘要

本发明涉及棉花硬脂酰去饱和化酶GbSSI2基因及应用，本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种从海岛棉中鉴定的基因GbSSI2的分离克隆、功能验证和应用。GbSSI2基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；其编码基因的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。功能验证表明，GbSSI2基因具有调控棉花内源抗病相关激素水杨酸和茉莉酸的合成的功能，通过遗传转化可应用于棉花抗黄萎病品系的培育。

权利要求

1.一种分离的棉花硬脂酰去饱和化酶GbSSI2基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的GbSSI2基因，其蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

3.一种表达载体pK2GW7.0-GbSSI2，其特征在于利用权利要求1所述的基因与所述的载体pK2GW7.0连接而得到。

4.一种表达载体pHellsgate4–GbSSI2，其特征在于利用权利要求1所述的基因与所述的载体pHellsgate4连接而得到。

5.一种表达载体pTRV2-GbSSI2，其特征在于利用权利要求1所述的基因与所述的载体pTRV2连接而得到。

6.权利要求1所述的基因GbSSI2在调控棉花抗病相关激素水杨酸和茉莉酸合成及响应中的应用。

说明书

棉花硬脂酰去饱和化酶GbSSI2基因及应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种棉花硬脂酰去饱和化酶基因GbSSI2的克隆及在控制棉花抗黄萎病中的应用。本发明采用比较蛋白组学的方法，通过对棉花抗黄萎病反应基因蛋白谱的分析，分离克隆的GbSSI2基因为调控棉花抗病相关激素水杨酸和茉莉酸合成及响应的基因，该基因能影响棉花对黄萎病的抗性。

背景技术

[0002] 棉花黄萎病是通过根部侵染的上传真菌维管束病害，病原菌侵染后会引起棉花叶片失绿变黄，萎蔫脱落，严重时常造成植株死亡，严重威胁棉花产量及纤维品质。棉花黄萎病被称为棉花的“癌症”，于1914年在美国被首次发现后，很快蔓延到世界上其他产棉国。1935年随着从美国引种棉花黄萎病传入中国，20世纪50～60年代在部分省份造成危害，
20世纪90年代后，该病已经蔓延到全国各棉区，是目前危害我国棉花生产的主要病害之一，对棉花常年造成减10-20％，严重时部分地区发病高达70％(简桂良等，2003.Current statusand countermeasure ofVerticillium wilt of cotton in China.中国棉花，2003，(3)：13-14)。近年来棉花黄萎病在我国发生日趋严重，特别是在黄河流域和新疆等主要棉产区大面积发生。长期的植物生产实践表明选育和种植抗病棉花品种是防治黄萎病的高效措施。但由于陆地棉抗黄萎病资源缺乏及田间抗病性鉴定结果受多种环境因素影响，传统育种方法选育抗黄萎病品种进展缓慢，因此生产上还没有高抗棉花黄萎病的品种大面积推广应用。

[0003] SSI2基因广泛存在于植物体内，编码一种硬脂酰ACP去饱和酶(S-ACP-DES)，是可溶性饱和脂肪酸(FA)去饱和酶家族的成员之一，是调控细胞内去饱和脂肪酸的重要酶类。S-ACP-DES能将饱和脂肪酸硬脂酸(18:0)去饱和化为油酸(18:1)。拟南芥ssi2突变体由于缺失了S-ACP-DES，饱和脂肪酸硬脂酸(18:0)大量积累，ssi2突变体植物表现出植物的防卫反应增强(Kachroo，P.，2001，A fatty acid desaturase modulates the activation of defense signalingpathways in plants.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：9448-9453)。

[0004] 水杨酸(SA)影响植物许多生理过程，包括气孔关闭、种子萌发、果实成熟以及糖酵解等，同时水杨酸在植物防御病原物的入侵中扮演着一个重要的角色。病原物侵染植物，会伴随着水杨酸含量的上升，而对植物施用外源的水杨酸会导致植物对很广谱的病原菌增强抗性(Ryals J A，et.al.1996，Systemic acquired resistance.Plant Cell，8：1809-1819)。遗传研究表明，几个抗病基因介导的防御反应的快速激活，需要水杨酸的参与，诱导局部的防御，以及建立系统获得性抗性。

[0005] 茉莉酸(JA)是一种脂肪酸源的信号分子，参与了植物花粉和种子的发育，以及对伤口、臭氧、昆虫和病原微生物的防御反应(Creelman R A，Mullet J E.1997，Biosynthesis and action of茉莉酸smonates in plants.Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，48：355-381)。茉莉酸和乙烯(ET)参与水杨酸不依赖的防卫反应。在这一过程中硫素(thionin，Thi1.2，一种含半胱氨酸的植物抗病蛋白)和防卫素(defensin，PDF1.2)会被诱导表达。PDF1.2受茉莉酸、乙烯和非寄主病原真菌(Alternaria brassicola)的诱导表达，但不受水杨酸的诱导。同时发现在npr1和cpr1(constitutive PR1)突变体中及NahG转基因植株中PDF1.2的表达都不受影响，而在ein2和coi1(coronatine insensitive 1)突变体中表达受到抑制，这些突变体对茉莉酸和乙烯是不敏感的。而Thi1.2和PDF1.2的表达模式相同。说明Thi1.2和PDF1.2参与的依赖茉莉酸和乙烯的系统抗病途径是不同于依赖水杨酸的SAR(系统获得性抗性)途径的，而且在PDF1.2的表达中对茉莉酸和乙烯的需要是同时的(Reymond P，Farmer E E，1998.Jasmonate and salicylate asglobal signals for defense gene expression.Curr Opin Plant Biol，1：404-411)。

[0006] 虽然在拟南芥及水稻中克隆到了许多参与茉莉酸合成的基因，但目前对于其详细茉莉酸合成的基因及其详细调控网络仍不是很清楚，与GbSSI2具有75％同源度的拟南芥的AtSSI2已被报道参与了拟南芥中脂肪酸代谢的调控，并参与拟南芥抗病性的调控，可能影响到依赖于茉莉酸的抗病型号路径。本发明证明了GbSSI2能参与调控棉花体内水杨酸和茉莉酸的合成以及下游信号的传递，从而参与棉花抗黄萎病菌。目前在棉花中还没有其它棉花体内茉莉酸的合成调控研究的报道。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，前期研究工作中通过对棉花受黄萎病菌(Verticillium dahliae)诱导的蛋白谱分析，得到一个克隆自海岛棉(Gossypium barbadense)可能参与棉花抗病反应的基因，通过氨基酸序列比对发现其与拟南芥AtSSI2蛋白具有75％的同源性，申请人将这个基因命名为GbSSI2基因(或称基因GbSSI2)。通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)技术，在海岛棉中沉默掉该基因，表明所述的GbSSI2基因可能与调控棉花抗病相关激素水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)合成及响应的基因相关。

[0008] 本发明的另一个目的在于提供了一种用GbSSI2基因进行快速高效转化棉花的方法。本发明还提供了一种表达载体，该载体含有GbSSI2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该载体通过表达由上述核酸序列形成的双链核酸分子并用于抑制棉花内源基因GbSSI2的表达。本发明还提供了一种含有以上表达载体的宿主细胞，所述的宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌等。

[0009] 本发明再一个目的是在于提供了一种棉花硬脂酰去饱和化酶基因GbSSI2在控制棉花抗黄萎病中的应用，即，通过调控GbSSI2基因在棉花植株中的表达来达到调控棉花水杨酸和茉莉酸的合成和响应，从而应用于棉花抗黄萎病品系的培育。

[0010] 本发明GbSSI2基因的表达载体转化的宿主是棉花，可用于培育抗黄萎病的棉花品系和品种。

[0011] 实现本发明的技术方案如下所述：

[0012] 本发明申请人前期工作是研究海岛棉‘海7124’(又名Hai7124，Xu et al.2011，DifferentialGene Expression in Cotton Defence Response to Verticillium dahliae by SSH.Journal ofPhytopathology，159，606-615；Xu et al.2011，Lignin metabolism has a central role in the resistanceof cotton to the wilt fungus Verticillium dahliae as revealed by RNA-Seq-dependent transcriptionalanalysis and histochemistry.J Exp Bot，62，5607-5621.)接种黄萎病菌后根部蛋白差异表达，发现一个在接种黄萎病菌后表达有明显变化的蛋白点(图2A)，将此蛋白点用串联质谱分析鉴定到一个基因，利用半定量PCR(RT-PCR)鉴定表明该基因在抗病的海岛棉‘海7124’接种黄萎病菌‘V991’(中国农业科学院植物保护研究所简桂良副研究员惠赠)后与海岛棉‘海7124’接水的对照相比表现出上调模式(见图2B)。该基因在棉花各个组织中均有较高表达，在根、茎和0天胚珠中表达量最高(见图2C)，并且该基因在植物抗病信号分子水杨酸和茉莉酸的诱导之后的0.5小时和1小时上调表达，4小时之后基因表达回复到正常水平(见图2D)。

[0013] 在海岛棉‘海7124’的总DNA、RNA中扩的GbSSI2的DNA、cDNA和ORF序列。棉花硬脂酰去饱和化酶基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。序列长度为1331bp。

[0014] 通过BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定SEQ ID NO：2所编码的氨基酸序列与拟南芥的硬脂酰去饱和化酶基因具有75％的同源性(图3)，这个序列为一个硬脂酰去饱和化酶基因，因此将该基因命名为GbSSI2。

[0015] 本发明克隆的棉花硬脂酰去饱和化酶基因GbSSI2在控制棉花抗黄萎病中的应用，其具体过程如下：

[0016] 将pTRV2-GbSSI2载体利用农杆菌介导的方法导入棉花宿主后，发现获得的转化的棉花幼苗从茎部子叶节附近开始产生类病斑，并逐步扩大且向上和向下蔓延，最终导致幼苗死亡(图5A)。对沉默棉花植株分单株提取茎部的RNA，利用反转录酶SuperscriptIII(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，以GbSSI2-QRT-F(5′CCAGTGTTCCATTCAGTTGGGTTTC 3′)和GbSSI2-QRT-R(5′TGCTCCTCCCTAAGCCCAGTTGT
3′)引物进行荧光定量PCR(QRT-PCR)，对沉默棉花植株进行GbSSI2的表达量分析。表达分析显示出现类病斑的棉花幼苗中GbSSI2基因的表达相对对照植株均明显下降(图5A)。
通过以上分析，说明转基因棉花幼苗茎部的病斑与GbSSI2表达量降低相关联。

[0017] 通过对产生类病斑的部分进行双氧水的染色和测定，表明GbSSI2基因沉默之后类病斑的产生于活性氧含量的上升和积累有关(图5B)。通过对沉默植株和对照植株的自由态水杨酸(SA)和结合态水杨酸(SAG)的含量进行测定(图5C)，发现自由态水杨酸的含量虽然没有显著差异，但是沉默植株的结合态水杨酸含量显著高于对照植株并且差异达到了显著水平。此外，利用QRT-PCR对沉默植株和对照植株中的水杨酸信号路径的标志基因GbNPR1，GbPR1，GbPR5的表达量进行分析(图5D)，进一步验证了GbSSI2基因沉默之后能激活棉花水杨酸的合成和响应相关的信号路径，提高水杨酸和活性氧的含量，使棉花产生类病斑。

[0018] 利用黄萎病菌‘V991’孢子液分别接种对照和沉默棉花植株的真叶，结果发现GbSSI2沉默植株对黄萎病菌的的抗性比对照植株明显降低(图6)，通过曲利苯蓝(Trypan Blue，购自西格玛公司，中国)染色表明，在接种之后沉默植株的细胞死亡远高于对照植株(图6A)。通过基因表达分析明，GbSSI2基因沉默的棉花植株中参与植物抗病信号激素茉莉酸合成和响应的基因均显著下调表达(图6B)，表明在棉花体内通过抑制GbSSI2的表达能抑制棉花体内茉莉酸的合成，从而降低了其对黄萎病菌的抗性，因此GbSSI2基因可能是一个正调控棉花体内茉莉酸合成的基因，通过调控GbSSI2基因表达水平可以影响棉花抗黄萎病，对棉花抗黄萎病，培育棉花抗黄萎病品系具有重要意义。

[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0020] 从抗病的海岛棉‘海7124’与黄萎病菌互作的蛋白谱中鉴定了参与棉花抗黄萎病反应的基因GbSSI2，并对其完成了分离克隆、功能验证和应用。GbSSI2基因编码的蛋白质与双子叶模式植物拟南芥的AtSSI2基因编码的蛋白质具有75％的同源性。GbSSI2基因具有调控水杨酸和茉莉酸合成及响应的功能，通过遗传转化可应用于棉花抗黄萎病品系的培育，同时可作为棉花抗黄萎病反应的标志基因。

[0021] 1.本发明克隆GbSSI2基因对棉花茉莉酸合成和响应有显著影响，这对阐明GbSSI2的生物学功能和进一步研究植物茉莉酸和合成调控网络有重要意义。

[0022] 2.抑制表达GbSSI2的棉花体内能持续合成水杨酸并产生过量的活性氧，诱发植株细胞程序性死亡，在棉花茎部和叶片产生类病斑，同时降低茉莉酸合成和响应信号路径的相关基因表达量，这说明GbSSI2基因对棉花水杨酸和茉莉酸的合成及响应影响很明显，通过基因工程技术精确调控GbSSI2基因的表达量能够控制棉花体内水杨酸、茉莉酸的合成。

[0023] 3.茉莉酸的合成调控直接影响植物抗病性，通过基因工程技术精确调控GbSSI2基因的表达量能够到控制棉花茉莉酸合成的目的，GbSSI2基因的克隆将有助于棉花抗黄萎病材料的创制。

[0024] 4.选育抗病的棉花材料一直为棉花育种家所重视，调控棉花水杨酸和茉莉酸合成响应基因的发现和利用将有助于解决生产上棉花抗黄萎病性差的难题。由于目前生产上黄萎病发生造成的棉花产量损失巨大，使得选育抗黄萎病的品种显得尤其重要，GbSSI2基因的克隆和功能验证将有助于培育高抗的棉花品种。

[0025] 5.通过GbSSI2基因深入探讨棉花调控水杨酸和茉莉酸合成响应的分子机理以及在棉花与黄萎病菌互作过程中的作用具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

[0026] 序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的GbSSI2基因的核苷酸序列，序列长度为1331bp。

[0027] 序列表SEQ ID NO：2是GbSSI2基因编码的蛋白质的氨基酸序列，其编码395个氨基酸。

[0028] 图1：一种海岛棉‘海7124’和陆地棉‘YZ-1’在根部接种黄萎病菌‘V991’后的表型差异。

[0029] 图2：是利用RT-PCR检测GbSSI2基因在棉花不同组织中的表达情况。其中：图2A：GbSSI2在对照组和‘V991’接种处理之后蛋白水平上表达差异的示意图。图2B、图2C、图2D：GbSSI2在棉花不同组织中均有表达，其中根、茎和胚珠中表达量最高，用‘V991’接种和水杨酸、茉莉酸处理之后GbSSI2均表现出上调的基因表达模式。

[0030] 图3为一种采用ClustalW软件对GbSSI2蛋白质序列和拟南芥AtSSI2蛋白序列进行分析比对的示意图。结果表明GbSSI2与拟南芥AtSSI2蛋白序列具有高达75％的同源性。

[0031] 图4：是本发明构建的三种质粒载体的图谱，其中：图4A、图4B和图4C分别为一种通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)的载体构建的病毒干涉载体pTRV2-GbSSI2，RNAi载体pHellsgate4-GbSSI2和超量表达载体pK2GW7.0-GbSSI2的物理图谱。

[0032] 图5：通过病毒诱导的基因沉默技术在海岛棉‘海7124’中沉默掉该基因之后棉花表型分析示意图。

[0033] 图5A：显示在‘海7124’中沉默掉GbSSI2能导致棉花幼苗叶脉黄化，茎部产生类病斑并逐渐向上和向下蔓延，严重时会导致植株死亡，利用RT-PCR技术检测对照植株和沉默植株中GbSSI2表达量，证实产生表型的沉默植株体内GbSSI2基因的表达量显著低于对照植株，表明沉默植株的表型是由GbSSI2基因的下调表达引起的。

[0034] 图5B、图5C：是对照植株的正常叶片和转基因植株的叶脉黄化叶片进行DAB染色及对叶片中双氧水和水杨酸含量进行测定的结果，即：沉默植株的叶片中双氧水和结合态水杨酸的含量显著高于对照叶片，表明GbSSI2基因沉默会引起棉花植株活性氧和水杨酸含量的上升。

[0035] 图5D：是利用QRT-PCR的方法鉴定结果：GbSSI2基因的沉默植株中水杨酸响应相关的标志基因GbNPR1、GbPR1和GbPR5的表达量明显高于对照植株。

[0036] 图6：是利用黄萎病菌‘V991’孢子液接种对照和沉默植株叶片，并用曲利苯蓝对其进行染色观察死细胞(图6A)，对沉默植株叶片对黄萎病菌抗性进行鉴定，并用QRT-PCR对对照植株和沉默植株茉莉酸合成和响应基因表达量进行鉴定的示意图。

具体实施方式

[0037] 实施例1：GbSSI2基因分离克隆

[0038] 1、表达分析

[0039] 本发明申请人前期工作是研究海岛棉‘海7124’接种黄萎病菌后根部蛋白差异表达，发现一个在接种黄萎病菌后表达有明显变化的蛋白点(图2A)，将此蛋白点用串联质谱分析鉴定到一个基因，利用半定量PCR(RT-PCR)鉴定表明该基因在抗病的海岛棉‘海7124’接种黄萎病菌‘V991’后与海岛棉‘海7124’接水的对照相比表现出上调模式(图2B)。从海岛棉品系‘海7124’中提取接种黄萎病菌后棉花根部的总蛋白，提取方法为TCA/丙酮结合苯酚法提取(Yao，Y.，Yang，Y.W.，Liu J.Y.2006，An efficient protein preparation for proteomicanalysis of developing cotton fibers by 2-DE.Electrophoresis，27，4559-4569.)，采用Bradford蛋白质定量试剂盒(购自伯乐公司。美国)进行定量后，取
1mg接种黄萎病菌后棉花根部的总蛋白上样进行双向电泳后，用PD Quest 2-D分析软件(购自伯乐公司。美国)对蛋白凝胶图像进行分析。差异蛋白用ABI4800MALDI-TOF/TOF质谱分析仪进行串联质谱鉴定(ABI公司，美国)，质谱数据用GPS Explorer V3.6(ABI公司，美国)软件分析。从海岛棉品系‘海7124’中提取接种黄萎病菌后棉花根部的总RNA(提取方法根据Zhu等，An improved simpleprotocol for isolation of high quality RNA from Gossypium spp.suitable for cDNA libraryconstruction，Acta Agronomica Sinica.2005，31：1657-1659)。RNA提取完成后用DNaseI(购自普洛麦格公司，美国)处理，RNA完整性通过1.2％(w/v)琼脂糖胶(EtBr)电泳检测(5V/em)。核酸浓度的测定在Beckman DU800spectrophotometer(贝克曼DU800分光光度计，购自贝克曼公司，美国)上进行。RNA260/280比值在1.9到2.1之间的RNA用于下一步的分析。cDNA的合成是以3μg总RNA为模版，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自普洛麦格公司，美国)，1μl10mM dNTP，DEPC-water混合，总体积为12μl；然后65℃变性5min冰上骤冷；再加入8μl含有4μl RT buffer，2μl 0.1M二硫苏糖醇，40units ofRibonucleaseInhibitor(RNA酶抑制剂，购自普洛麦格公司，美国)，和200units of SuperscriptIII RT(反转录酶，购自Invitrogen公司，美国)的混合液；50℃温浴1h合成第一链；反应结束后75℃处理15min使SuperscriptIIIRT失活。每份cDNA稀释到300μl后于-20℃保存待用。

[0040] 2、GbSSI2基因核苷酸和蛋白质的氨基酸序列的获得

[0041] 设计引物GbSSI2-OE-s(5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAGCAGGCTGCCTTCAATAAAAGGCGAGCTGTG3′)和GbSSI2-OE-a(5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCTTCTCCCTAAGCCCTGTTGTT 3′)，在海岛棉‘海7124’的总DNA、RNA中扩的GbSSI2的DNA、cDNA和ORF序列。一种棉花硬脂酰去饱和化酶基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。序列长度为1331bp。棉花硬脂酰去饱和化酶基因GbSSI2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定花硬脂酰去饱和化酶基因GbSSI2编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2所示)与拟南芥的硬脂酰去饱和化酶基因具有75％的同源性(图3)。

[0042] 3、GbSSI2基因pTRV2-GbSSI2、pHellsgate4-GbSSI2和pK2GW7.0-GbSSI2载体构建

[0043] 根据GbSSI2的基因序列设计了如下引物，其DNA序列如下所示：

[0044] 正向引物GbS SI2-trv-s 5’GGATCCCGCCACGAGACAGCATACACTAA 3’

[0045] 反向引物GbSSI2-trv-a 5’GGTACCCAGAAACCCAACTGAATGGAACAC 3’，再以GbSSI2基因cDNA为模板进行PCR扩增，得到的产物及pTRV:RNA2质粒分别用限制性内切酶BamH1和Kpn1(购自NEB公司，中国)进行双酶切。将酶切后的PCR产物与酶切回收的pTRV:RNA2质粒片段用T4连接酶(购自Invitrogen公司，美国)进行连接，连接产物即为病毒沉默载体pTRV2-GbSSI2(图4A)，将载体进行热激转化，转入大肠杆菌TOP10(购自天根生化科技(北京)有限公司)中，挑取单克隆用引物GbSSI2-trv-s

[0046] (5’GGATCCCGCCACGAGACAGCATACACTAA3’)GbSSI2-trv-a

[0047] (5’GGTACCCAGAAACCCAACTGAATGGAACAC3’)进行检测，检测后的阳性克隆扩繁后提取质粒，再转化农杆菌GV3101(购自天根生化科技(北京)有限公司)。检测后于-80保存备用(图4A)。

[0048] 设计GbSSI2基因的RNAi抑制表达载体构建引物，在引物的两端分别加上用于重组的attB位点序列及保护碱基，即正义引物5’端加上

[0049] 5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC3′接头，反义引物5’端加上[0050] 5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTG3 ′接 头，分 别将 该 引物 命名 为GbSSI2-RI-s：

[0051] 5 ′ GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCGCCACGAGACAGCATACACTAA3 ′ 和GbSSI2-RI-a：

[0052] 5 ′ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCAGAAACCCAACTGAATGGAACAC3 ′，再 以GbSSI2基因cDNA为模板进行PCR扩增，得到的产物通过BP重组反应导入RNAi载体pHellsgate4(重组酶购自Invitrogen公司，美国；)。RNAi载体见Wesley等(Construct designfor efficient，effective and high-throughput gene silencing in plants.Plant J.2001.27：581-590)，构建的RNAi载体为pHellsgate4-GbSSI2(见图4B)。

[0053] 根据GbSSI基因的ORF设计引物，分别将该引物命名为：

[0054] GbSSI2-OE-s：5 ′ GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCTTCAATAAAAGGCGAGCTGTG3′

[0055] GbSSI2-OE-a：5 ′ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCTTCTCCCTAAGCCCTGTTGTT3′。再以GbSSI2基因的DNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物通过BP反应构建到中间载体pDNOR221(购自Invitrogen公司，美国)上，BP反应体系(5μl)：PCR产物2μl，pDNOR221载体1μl，BP酶(购自Invitrogen公司，美国)1μl，TE(PH8.0)1μl。然后再将含有GbSSI2基因的pDNOR221载体和pK2GW7.0(从比利时国立根特大学购买)载体进行LR重组反应，把GbSSI2基因构建到pK2GW7.0的载体上，从而获得超量表达载体pK2GW7.0-GbSSI2(该表达载体含有如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列)。LR反应体系(5μl)：含有GbSSI2基因的pDNOR221载体1μl，pK2GW7.0载体2μl，LR酶(购自Invitrogen公司)1μl，TE(pH8.0)1μl。所述的超表达载体pK2GW7.0-GbSSI2含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，以及植物表达载体pK2GW7.0(图4C)。

[0056] 实施例2：GbSSI2基因在棉花不同组织的表达分析和对植物抗病信号分子的响应[0057] 以海岛棉‘海7124’为材料，提取根、茎、子叶、真叶、纤维、胚珠、花瓣和花药等8个不同组织的RNA(提取方法和RNA反转录方法参见实施例1)，用RT-PCR方法检测GbSSI2基因的表达水平。以上述反转录合成的cDNA为模板，以实施例1中获得的基因GbSSI2设计特异引物GbSSI2Rt-s(5′CGCCACGAGACAGCATACACTAA 3′)和GbSSI2Rt-a(5′CAGAAACCCAACTGAATGGAACAC 3′)对GbSSI2基因进行PCR扩增。同时用引物UB7-s(5′GAAGGCATTCCACCTGACCAAC3′)和UB7-a(5′CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG3′)对棉花GhUbi7(GenBank登陆号：DQ116441)基因做特异扩增，以作为内对照进行相对半定量分析。结果表明：本发明克隆的基因GbSSI2在棉花各个组织中均有较高表达，在根、茎和0天胚珠中表达量最高(图2C)。

[0058] 分别利用20μM茉莉酸甲酯和200μM水杨酸处理海岛棉‘海7124’幼苗的真叶(同时设置未做处理的平行对照)，分别在处理后0，0.5，1，4，小时取棉花叶片。按前述方法提取根组织的总RNA。RNA的检测方法如前所述，用质量合格的总RNA进行cDNA的合成(方法见实施例1)。以上述反转录合成的cDNA为模板，GbSSI2Rt-s(5′CGCCACGAGACAGCATACACTAA 3′)和GbSSI2Rt-a (5′CAGAAACCCAACTGAATGGAACAC 3′)对GbSSI2基因进行PCR扩增。同时用引物UB7-s(5′GAAGGCATTCCACCTGACCAAC3′)和UB7-a(5′CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG3′)对棉花GhUbi7(GenBank登陆号：DQ116441)基因做特异扩增，以作为内对照进行相对半定量分析。结果表明：并且该基因在植物抗病信号分子水杨酸和茉莉酸的诱导之后的0.5小时和1小时上调表达，4小时之后基因表达回复到正常水平(图2D)。

[0059] 实施例3：病毒干涉载体、RNAi抑制表达载体和超量表达载体的构建和VIGS介导的转化

[0060] VIGS介导的棉花植株转化的具体方法为：将带有质粒的pTRV:RNA1，pTRV:RNA2和pTRV2:GbSSI2的农杆菌菌株在50μg/mL Kanamycin(卡那霉素，购于西格玛公司，美国)LB培养皿上活化。接种前两天，挑取一个单克隆接种于5ml LB培养液。LB培养液中加入50μg/mL卡那霉素(Kanamycin)。在摇床上28℃，转速50rpm过夜。将活化后的菌液分别接种于100ml含有50μg/mL的Kanamycin LB培养液中，并加入10mM 4-吗啉乙磺酸，简称MES(2-(4morpholino)-ethane sulfonic acid)，20μM乙酰丁香酮。于28℃转速50rpm的摇床上过夜。当农杆菌液浓度OD600＝0.8左右，将菌液收集于50ml离心管中，于4000rpm，离心5分钟。用重悬液(10mM MgCl2，10mM MES和200μM乙酰丁香酮)重悬，调整浓度至OD600＝1.2-1.5。重悬后的菌液在常温放置2h。将要沉默的棉花幼苗每片子叶背面用针头扎几个小孔。将重悬液pTRV:RNA1分别和pTRV:RNA2、pTRV2:GbSSI2按1∶1体积混合均匀，用
2ml注射器将混合后的菌液延着小孔注射渗入棉花子叶。用黑色塑料膜将注射接种后的棉-2 -1
花幼苗避光24h。24h后，保持培养条件为23℃，120μE m S 光强，18h光/6h暗，大约两周后观察表型(Fradin，E.F.，Z.Zhang，et al.2009.Genetic dissection of Verticillium wiltresistance mediated by tomato Ve1.Plant Physiol，150(1)：320-332.)。

[0061] 实施例4：pTRV2:GbSSI2转基因植株相关分析

[0062] 1、pTRV2:GbSSI2转基因植株基因表达分析

[0063] 从对照植株和产生类病斑的沉默植株分别提取根系RNA(方法如前面的实施例)，利用反转录酶SuperscriptIII(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，以GbSSI2-QRT-s(5′CCAGTGTTCCATTCAGTTGGGTTTC 3′)和GbSSI2-QRT-a(5′TGCTCCTCCCTAAGCCCAGTTGT 3′)引物进行荧光定量PCR(QRT-PCR)，PCR反应条件为：95℃预变性1min；95℃5sec，60℃35sec，40个循环，定量PCR仪为ABI7500，定量PCR试剂购自Bio-Rad公司。对沉默棉花植株进行GbSSI2的表达量分析。表达分析显示出现类病斑的棉花幼苗中GbSSI2基因的表达相对对照植株均明显下降(图5A)。通过以上分析，说明转基因棉花幼苗茎部的病斑与GbSSI2表达量降低相关联。

[0064] 2、pTRV2:GbSSI2转基因植株活性氧含量分析。

[0065] 对照植株和产生类病斑的沉默植株分别取茎部过氧化氢含量用试剂盒(过氧化氢定量分析试剂盒，上海生工生物工程有限公司)进行测定，具体方法为：取对照植株和产生类病斑的沉默植株分别取茎部用液氮研磨成粉末，称取0.1g粉末，加入80％丙酮400μl，混合均匀，于4℃并避光振荡2h后，12000rpm离心15分钟。在不同浓度的标样入每份待测样品中加入提前混合好的显色液A’(每份显色液A’由溶液A加1/10体积溶液B，溶液A’和B由上述过氧化氢定量分析试剂盒提供)于595nm下测定吸光值。根据不同浓度标样的吸光值制作标准曲线，算出样品的双氧水浓度。以DAB(3，3′-Diaminobenzidin，
3，3′-二氨基联苯胺盐酸盐，(1，1′-联苯)-3，3′4，4′-四胺四盐酸盐，购自Sigma西格玛公司，中国)为底物的方法检测叶片中过氧化氢。具体步骤为：取对照植株和产生类病斑的沉默植株叶片，置于适量的DAB溶液(1mg/mL)，溶液中抽真空30min，其后叶片浸泡在溶液中置于28℃光温培养箱中光照8h。处理叶片置于沸腾的95％的乙醇中脱色，脱色后叶片直接在Leiea MZFLIII(购自海德堡公司，德国)显微镜下观察，照相。

[0066] 接菌后用曲利苯蓝溶液染色方法对叶片死细胞染色。具体步骤为：取棉花黄萎病菌‘V991’孢子液后的对照植株和沉默植株叶片，浸泡在70℃的曲利苯蓝溶液中(2.5mg/mL的曲利苯蓝，25％(重量/体积)乳酸，23％水饱和酚，25％甘油，其余是水，抽真空10分钟。然后，在水中煮2min后自然冷却染色过夜。用水合氯醛(2.5g/mL水)脱色液脱色3天，中间换三次脱色液(Yin Z，Chen J，Zeng L，Goh M，Leung H，Khush GS，Wang GL.Characterizing rice lesionmimic mutants and identifying a mutant with broad-spectrum resistance to rice blast and bacterialblight.Mol Plant Microbe Interact.2000，Aug；13(8)：869-876)。叶片直接在Leiea MZFLIII显微镜下观察，照相。

[0067] 通过对产生类病斑的部分进行双氧水的染色和测定，表明GbSSI2基因沉默之后类病斑的产生于活性氧含量的上升和积累有关(图5B)。

[0068] 1、pTRV2:GbSSI2转基因植株水杨酸含量分析

[0069] 从对照植株和产生类病斑的沉默植株分别取茎部提取水杨酸并测定其含量，具体步骤参照Kachroo等报道的水杨酸提取方法(Kachroo，P.，A.Kachroo，et al.2003，Restoration ofDefective Cross Talk in ssi2Mutants：Role of Salicylic Acid，Jasmonic Acid，and Fatty Acids inSSI2-Mediated Signaling.Molecular Plant-Microbe Interactions 16(11)：1022-1029)。具体过程如下：对照植株和产生类病斑的沉默植株分别取茎部，用液氮研磨成粉末，称取0.1g粉末，加入80％甲醇溶液600μl，于4℃并避光振荡24h后，在9000g，4℃离心10分钟，取上清转入一支新的离心管中，再往沉淀中加入400μl 80％甲醇溶液于4℃并避光振荡4h后，9000g，4℃离心10分钟。将所得上清与前一次的上清混合。取0.5ml上清液，于40℃真空干燥后，用0.3ml，5％三氯乙酸于80℃溶解。加入两倍体积的环戊烷/乙酸乙酯/异丙醇(体积比50∶50∶1)提取，取上层有机相即为自由态水杨酸。在下层水相中，加入适量盐酸调节pH值至1，再于80℃水浴30分钟，把结合态的水杨酸转化为自由态水杨酸。再加入两倍体积的环戊烷/乙酸乙酯/异丙醇(体积比50∶50∶1)提取，取上层有机相。将两次的有机相溶液用氮气吹干，加入200μl甲醇溶解用HPLC液相色谱测定其水杨酸的浓度。

[0070] 2、pTRV2:GbSSI2转基因植株水杨酸、茉莉酸信号途径相关基因分析[0071] 取pTRV2:GbSSI2用病毒介导的方法(参考文献)沉默的海岛棉‘海7124’植株及对照植株，取根部组织提取RNA(提取方法和RNA反转录方法参见实施例1)，以上述反转录合成的cDNA为模板，用QRT-PCR方法检测GbSSI2在沉默后的表达量，检测GbSSI2沉默后，观察水杨酸、茉莉酸路径相关基因表达变化。用下列设计的特异引物进行扩增：

[0072] GbNPR1-Rs(5’CTAGCTTGCGGAGGGATTGATACC3’)

[0073] GbNPR1-Ra(5’GAGATGGCTGACCTGTCAAACTGC3’)

[0074] GbPR1-Rs(5’AAGAATGTGGGTTAGTGAGAGGGT3’)

[0075] GbPR1-Ra(5’ACCACTTGAGTATAATGCCCGC3’)

[0076] GbPR5-Rs(5’CTGCTCCTCGTGGTGTTTATGG3’)

[0077] GbPR5-Ra(5’AATATTGATCTTGTCTAAATGCCTCAC3’)

[0078] GbLOX1-Rs(5′GCTTATGTTGCTGTAAATGACTCTGG3’)

[0079] GbLOX1-Ra(5′CACACTAAGTTGTCGGTTCGTTG3′)

[0080] GbAOS-Rs (5′TGCCACCTGGTCCTTTCATTTC3′)

[0081] GbAOS-Ra (5′GCGTGTTTGGGCTCGGAAGGGTCG3′)

[0082] GbOPR3-Rs (5′AGAGGTCCACTCCTGGCGGCTT3′)

[0083] GbOPR3-Ra (5′CCACCTGTTCTTCATTGTAGATTCC3′)

[0084] GbMYC-2Rs (5′GCTCCGCCACTACCGTGCTC3′)

[0085] GbMYC-2Ra (5′CTCGAAGCACTTTTTTACGGTGTTC3′)

[0086] GbJaz1-Rs (5′AGCCTCAAAAAGGAAGACCTCAAAC3′)

[0087] GbJaz1-Ra (5′TGGCTGCTCAATCACCATAGTAATC3′)

[0088] GbJaz3-Rs (5′TGATTTTGCTCAAGGAGATAACGCT3′)

[0089] GbJaz3-Ra (5′TGATTGCCTACTCGTTGCCTGT3′)

[0090] GbJaz 6-Rs (5′GGCATCAATATGGCGGTTCAGGAC3′)

[0091] GbJaz 6-Ra (5′TTCATCGGGTTTAGGTGGCAGAGT3′)

[0092] GbPR4-Rs (5′GAGGGTAAGAAACTCAAGGACTGG 3′)

[0093] GbPR4-Ra(5′CTCCATCAGTGTCCAATCGGTT 3′)

[0094] 同时用引物UB7-s(5′GAAGGCATTCCACCTGACCAAC3′)和UB7-a(5′CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG3′)对棉花GhUbi7(GenBank登陆号：DQ116441)基因做特异扩增(扩增产物长198bp)，以作为内对照进行相对定量分析。定量PCR仪为ABI7500，定量PCR试剂购自Bio-Rad公司。PCR反应体系(20μl)包括：1μl稀释后的cDNA(等于10ng起始总RNA)，10μl 2×PCR Master Mix，200nM的引物。反应条件为：95℃30sec；95℃5sec，60℃35sec，
40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明：本发明克隆的基因GbSSI2，在干涉植株中，水杨酸抗病路径相关基因被激活(图5D)，茉莉酸合成相关基因受抑，茉莉酸下游响应相关基因及茉莉酸下游相关基因都受到不同程度的抑制(图6B)，表明其参与了植物抗病反应信号路径。