用于提高体外培养人肝细胞的生理性CYP3A4表达的嵌合基因及其构建方法

摘要

本发明公开一种用于提高体外培养人肝细胞的生理性CYP3A4表达的嵌合基因及其构建方法；所述嵌合基因，包括人核因子孕烷X受体基因全长序列和野生型P53基因的激活域序列。还有一种重组真核表达载体，其包括前所述的嵌合基因；一种如前所述的重组真核表达载体的构建方法，其中，其包括以下步骤：从正常人原代肝细胞来源的cDNA分别克隆所述人核因子孕烷X受体基因全长序列和野生型P53基因的激活域序列；将前述步骤获得的两段序列定向克隆到所述PCI-neo哺乳动物表达载体的β-globin/IgG嵌合内含子序列和SV40Late poly(A)信号序列之间，获得重组真核表达载体。本发明能够明显提高体外培养人肝细胞的生理性CYP3A4表达。

权利要求

1.一种用于提高体外培养人肝细胞的生理性CYP3A4表达的嵌合基因，其特征在于：其序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示。

2.一种重组真核表达载体，其特征在于，其包含如权利要求1所述的嵌合基因。

3.如权利要求2所述的重组真核表达载体，其特征在于：所述的真核表达载体为哺乳动物细胞表达载体。

4.如权利要求3所述的重组真核表达载体，其特征在于：所述哺乳动物细胞表达载体为PCI-neo哺乳动物表达载体。

5.如权利要求4所述的重组真核表达载体，其特征在于：所述PCI-neo哺乳动物表达载体包括人类巨细胞病毒早期增强子/启动子序列及其下游的依次的β-globin/IgG嵌合内含子序列和SV40Late poly(A)信号序列。

6.如权利要求5所述的重组真核表达载体，其特征在于：所述PCI-neo哺乳动物表达载体的β-globin/IgG嵌合内含子序列和SV40Late poly(A)信号序列之间包含如下酶切位点：Nhe Ⅰ、Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ、Mlu Ⅰ、Xba Ⅰ、Sal Ⅰ、Acc Ⅰ、Sma Ⅰ和Not Ⅰ。

7.一种如权利要求2-6任意一项所述的重组真核表达载体的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：（1）根据GenBank数据库收录的正常人原代肝细胞来源的cDNA克隆人核因子孕烷X受体基因全长序列；

（2）根据GenBank数据库收录的cDNA序列克隆野生型P53基因的激活域序列；

（3）将所述步骤（1）和（2）获得的两段序列构建成序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的嵌合基因，并且定向克隆到PCI-neo哺乳动物表达载体的β-globin/IgG嵌合内含子序列和SV40Late poly(A)信号序列之间，获得重组真核表达载体。

8.如权利要求7所述的重组真核表达载体的构建方法，其特征在于：所述人核因子孕烷X受体基因全长序列和野生型P53基因的激活域序列定向插入到所述PCI-neo哺乳动物表达载体的Nhe Ⅰ、Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ、Mlu Ⅰ、Xba Ⅰ、Sal Ⅰ、Acc Ⅰ、Sma Ⅰ和Not Ⅰ任意一个酶切位点上。

9.如权利要求7所述的重组真核表达载体的构建方法，其特征在于：所述获得的重组真核表达载体通过限制性酶切图谱法和/或测定其核苷酸序列来进行筛选和鉴定。

说明书

用于提高体外培养人肝细胞的生理性CYP3A4表达的嵌合

基因及其构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种真核表达载体构建技术，尤其涉及一种用于提高体外培养人肝细胞的生理性CYP3A4表达的嵌合基因及其构建方法。

背景技术

[0002] 大部分药物进入体内后的代谢过程主要由肝细胞完成。肝细胞含有各种参与体内外物质生物转化的酶类。细胞色素P450酶（CYPs，P450s）是一类含血色素巯基结构的单加氧酶蛋白超家族，是完成相关底物的去毒/生物活化作用的重要药物代谢酶。其中，CYP3A亚家族在人肝脏组织中含量最高，约占30%，是主要的临床药物代谢酶类。CYP3A4参与了50%的临床用药的代谢过程，药物代谢谱非常广泛。鉴于CYP3A4在药物代谢过程中的重要作用，药物研发过程需要一个能够再现体内CYP3A4代谢作用的体外模型，用来集中评价CYP3A4对备选药物代谢作用和水平，以及备选药物对CYP3A4活性作用的影响。

[0003] 原代人肝细胞是最适合用于药物代谢的CYP3A4体外细胞模型，它完整表达了Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶以及其他参与分子，能比较准确地模拟药物在人体内的代谢作用，是体外药物代谢的金标准。原代人肝细胞中CYP3A4表达调控机制的基本内容如下：核因子孕烷X受体(PXR)是调控CYP3A4转录的一个最重要的转录因子，PXR与维甲酸X受体(RXR)α形成异源二聚体，与近孕烷X受体反应元件（prPXRE）及外源性反应增强模块（XREM）等元件发生结合，调控CYP3A4的生理性表达（构成性和诱导性）。

[0004] 但是由于原代人肝细胞来源短缺，人群差异性大，体外培养细胞表型维持困难等缺点，故广泛应用原代人肝细胞比较困难。相比之下，肝癌细胞系则不存在原代肝细胞来源有限、体外培养困难等缺点，它们具有体外增殖能力，遗传和功能表型相对稳定，并且培养条件比较简单而易于实验室间统一标准。原代肝细胞永生化的方法主要是转染编码肿瘤病毒基因，原癌基因或端粒酶的质粒。随着研究的进展，出现了杂交细胞、条件永生化肝细胞及从转基因动物分离的细胞系。但是，原代肝细胞永生化后，细胞表型发生改变，特别是CYP3A4表达低下，所以并不适合用于CYP3A4相关性药物代谢研究。

[0005] 肝源性细胞系普遍存在的主要问题是，处于去分化或低分化状态，各类代谢酶表达水平低下或不全。因此，相关改造的核心目标集中在如何恢复和提高肝特征功能表型。另一种改造细胞功能的方法是，通过转染编码CYP3A4的质粒，在细胞系中过表达CYP3A4，提高细胞系在CYP3A4相关性药物代谢的应用潜质。各种各样的非肝源性宿主细胞如细菌，酵母菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞等，已经被成功改造。1991年，文献报道在B淋巴细胞样干细胞中成功表达。1998年，Chen Q et al已成功在中国仓鼠肺细胞中表达CYP3A4，并用于黄曲霉素B1，环磷酰胺及杂色曲霉素的代谢研究。Hep G2作为应用最广泛的肝癌细胞系，大量文献报道在Hep G2中成功过表达CYP3A4，并用于CYP3A4相关的药物代谢及毒性研究。但这种过表达CYP3A4的改造方式并不能再现药物代谢酶的生理性反应特点，因此不能用于预测药物相互作用等临床药物治疗学的重要问题。

[0006] 为实现模拟生理性调控的目的，人们对CYP3A4表达调控机制进行了深入分析研究。对照原代人肝细胞的相关基因表达、调控和酶活性基本参数，有学者发现CYP3A4在细胞系中表达降低与CYP3A4相关的转录因子及辅助因子表达减少有密切相关性。如Hep G2与原代肝细胞相比，C/EBPαmRNA只达到原代肝细胞的15%，HNF3α是25%，HNF1α是40%。有学者通过转染编码特异性转录因子（C/EBPα，HNF3γ，PXR）的质粒，成功在Hep G2提高了CYP3A4的表达。Jenni Küblbeck et al.（2010）改造出了一种嵌合转录因子，即将NF-κB的P65激活域连接至PXR构成嵌合基因，改造C3A细胞，提高其CYP3A4的表达。虽然过表达相关转录因子可以增强CYP3A4的表达，但是仍然远远达不到原代肝细胞的表达水平。因为CYP3A4在细胞内的表达调控是一个多因子参与的复杂的调控网络，单个或若干个转录因子的表达提高，并不能使CYP3A4的表达恢复到正常水平，所以仍需对CYP3A4表达调控做进一步的尝试研究。

[0007] P53基因，其编码的P53蛋白为核肿瘤抑制磷酸化蛋白，在正常细胞内当细胞遭遇胁迫，尤其是细胞DNA受到损伤时P53蛋白急剧增加，主要用于阻滞细胞周期或者诱导细胞凋亡；一旦P53基因发生突变，P53蛋白失活，细胞分裂失去节制，可能导致癌变。人类癌症中约有一半是由于该基因发生突变失活。P53蛋白包括4个功能调节区域：N-端的激活域（TAD）、DNA结合域（DBD）、C-端的复位调节域和四聚化结构域（4D），其中P53蛋白的N-端的激活域（P53-AD）的动态变化赋予了该区域的多功能性。

[0008] P53-AD存在若干转角和螺旋，这些转角和螺旋通常为P53蛋白与其他蛋白（如mdm2）或蛋白伴侣的结合位点，并且这些转角和螺旋的位置和数量还可以有所变化，这暗示了P53蛋白能与多种蛋白伴侣相结合从而执行多种细胞调节功能。研究人员在P53-AD中发现了其内部非结构化的蛋白质（IUP），IUP能够通过改变其自身结构与其他蛋白伴侣结合，该P53-AD的IUP与许多其他的蛋白的激活域有相似的结构，即可能形成基础结构基序的多功能疏水小区域，这暗示了P53-AD与其他的转录激活域或转录因子有相似的结构及相应的功能。P53基因是肿瘤抑制基因，其在细胞周期调控中发挥重要作用，并且磷酸化在P53蛋白的活性调节中发挥了最重要作用，可以通过控制P53-AD中部分重要氨基酸残基的磷酸化程度对P53-AD的活性进行控制。

发明内容

[0009] 本发明的目的是，以CYP3A4细胞内调控机制以及基于以上关于P53-AD的功能的理论研究为理论基础，根据PXR及P53蛋白结构特点，选用P53-AD构建符合发明人技术期望的嵌合基因，即提供一种用于提高体外培养肝细胞的生理性CYP3A4表达的嵌合基因及其构建方法。

[0010] 为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：

[0011] 一种用于提高体外培养人肝细胞的生理性CYP3A4表达的嵌合基因，其中，其序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示。

[0012] 一种重组真核表达载体，其特征在于，其包含前所述的嵌合基因。

[0013] 所述的真核表达载体为哺乳动物细胞表达载体；具体地，为PCI-neo哺乳动物表达载体。所述PCI-neo哺乳动物表达载体包括人类巨细胞病毒早期增强子/启动子序列及其下游的依次的β-globin/IgG嵌合内含子序列和SV40Late poly(A)信号序列。

[0014] 具体地，所述PCI-neo哺乳动物表达载体的β-globin/IgG嵌合内含子序列和SV40Late poly(A)信号序列之间包含如下酶切位点：Nhe Ⅰ、Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ、Mlu Ⅰ、Xba Ⅰ、Sal Ⅰ、Acc Ⅰ、Sma Ⅰ和Not Ⅰ。

[0015] 一种如前所述的重组真核表达载体的构建方法，其中，其包括以下步骤：

[0016] （1）根据GenBank数据库收录的正常人原代肝细胞来源的cDNA克隆人核因子孕烷X受体基因全长序列；

[0017] （2）根据GenBank数据库收录的cDNA序列克隆野生型P53基因的激活域序列；

[0018] （3）将所述步骤（1）和（2）获得的两段序列构建成序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的嵌合基因，并且定向克隆到PCI-neo哺乳动物表达载体的β-globin/IgG嵌合内含子序列和SV40Late poly(A)信号序列之间，获得重组真核表达载体。

[0019] 具体地，所述人核因子孕烷X受体基因全长序列和野生型P53基因的激活域序列定向插入到所述PCI-neo哺乳动物表达载体的Nhe Ⅰ、Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ、Mlu Ⅰ、Xba Ⅰ、Sal Ⅰ、Acc Ⅰ、Sma Ⅰ和Not Ⅰ任意一个酶切位点上。

[0020] 进一步地，所述获得的重组真核表达载体通过限制性酶切图谱法和/或测定其核苷酸序列来进行筛选和鉴定。

[0021] 与现有技术相比较，本发明具有如下优势：

[0022] （1）本发明的嵌合基因通过设计和改造基于该基因生理性调控的主要上游通路而实现的，具有CYP3A4生理性表达能力的针对性；

[0023] （2）本发明的嵌合基因通过选用P53基因及其特殊功能域片断（P53-AD），使该嵌合基因具有较强的调控CYP3A4表达的能力。

附图说明

[0024] 图1为本发明所使用的哺乳动物表达载体PCI-neo的结构示意图。

[0025] 图2为本发明的第一种重组真核表达载体PCI-hPXR-P53的部分结构示意图，其示出了在β-globin/IgG嵌合内含子序列下游依次连接人核因子孕烷X受体基因全长序列和野生型P53基因的激活域序列。

[0026] 图3为本发明的第二种重组真核表达载体PCI-P53-hPXR的部分结构示意图，其示出了在β-globin/IgG嵌合内含子序列下游依次连接野生型P53基因的激活域序列和人核因子孕烷X受体基因全长序列。

[0027] 图4为本发明的重组真核表达载体PCI-hPXR-P53和PCI-P53-hPXR转染至293T细胞中的对CYP3A4-XREM.luc的双荧光报告基因检测结果。

[0028] 图5为本发明的重组真核表达载体PCI-hPXR-P53和PCI-P53-hPXR转染至C3A细胞中的对CYP3A4-XREM.luc的双荧光报告基因检测结果。

[0029] 图6为本发明的重组真核表达载体PCI-hPXR-P53和PCI-P53-hPXR转染至C3A细胞中的CYP3A4mRNA荧光定量PCR检测结果。

具体实施方式

[0030] 以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。

[0031] 实施例1

[0032] 构建重组真核表达载体PCI-hPXR-P53和PCI-P53-hPXR，其步骤如下：

[0033] 1.根据GenBank数据库收录的PXR及野生型P53-AD的基因序列，设计特异引物，采用PCR方法从正常人原代肝细胞来源的cDNA克隆PXR及野生型P53-AD基因序列；

[0034] 2.通过限制性内切酶位点，将PXR及野生型P53-AD基因定向克隆到真核表达载体PCI-neo（如图1所示）中，采用酶切、测序等方法筛选和鉴定重组真核表达载体PCI-hPXR-P53，如图2所示；

[0035] 3.通过限制性内切酶位点，将PXR及野生型P53-AD基因定向克隆到真核表达载体PCI-neo（如图1所示）中，采用酶切、测序等方法筛选和鉴定重组真核表达载体PCI-P53-hPXR，如图3所示；

[0036] 实施例2

[0037] 双荧光素酶报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)，结合海洋腔肠荧光素酶共报告基因，在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,采用海洋腔肠荧光素酶来减少实验的变化因素。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。

[0038] 转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。其原理简述如下：

[0039] a．构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。

[0040] b．将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293T细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

[0041] c．加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

[0042] 荧光定量PCR用于进一步验证双荧光检测的结果。

[0043] 基于以上原理，构建重组真核表达载体PCI-hPXR-P53和PCI-P53-hPXR的报告基因质粒CYP3A4-XREM.luc和对照的亚克隆载体PCI-hPXR，其步骤如下：

[0044] 1.根据GenBank数据库收录的CYP3A4的基因序列，设计特异引物，采用PCR方法从正常人原代肝细胞来源的cDNA克隆CYP3A4-362至+53部分和-7838至-7208之间的调控序列基因序列；

[0045] 2.通过限制性内切酶位点，将CYP3A4-362至+53部分和-7838至-7208之间的调控序列定向克隆到真核表达载体PGL3-basic中，采用酶切、测序等方法筛选和鉴定重组真核表达载体CYP3A4-XREM.luc；

[0046] 3.将已经构建好的载体PCI-hPXR-P53用Nhe I/BamH I酶切下来，和pcDNA3.1(+)的Nhe I/BamH I酶切产物连接，得到一个中间载体pcDNA3.1-hPXR。在中间载体上获得EcoR I酶切位点。将pcDNA3.1-hPXR的Nhe I/EcoR I酶切产物和PCI-neo的Nhe I/EcoR I酶切产物连接，采用酶切鉴定亚克隆载体PCI-hPXR。

[0047] 重组真核表达载体PCI-hPXR-P53和PCI-P53-hPXR的功能验证，其步骤如下：

[0048] 1.将目的质粒（PCI-hPXR-P53、PCI-P53-hPXR、PCI-hPXR或PCI-neo）、报告基因质粒（CYP3A4-XREM.luc）和内参质粒（TK）分别按46ng:140ng:14ng瞬时转染293T细胞。转染后24小时，利福平组（RIF+）加入0.2μL10mM的利福平溶液，对照组（RIF-）加入0.2μL DMSO，药物刺激48小时后，进行双荧光素酶检测，结果见图4。

[0049] 2.将目的质粒（PCI-hPXR-P53、PCI-P53-hPXR、PCI-hPXR或PCI-neo）、报告基因质粒（CYP3A4-XREM.luc）和内参质粒（TK）分别按46ng:140ng:14ng瞬时转染C3A细胞。转染后24小时，利福平组（RIF+）加入0.2μL10mM的利福平溶液，对照组（RIF-）加入0.2μL DMSO，药物刺激48小时后，进行双荧光素酶检测，结果见图5。

[0050] 3.在24孔板中，按1×105个/ml的密度接种C3A细胞，每孔1ml，37℃，5%CO2培养箱中静置培养，然后分别转染PCI-hPXR-P53、PCI-P53-hPXR、PCI-hPXR和PCI-neo。转染后24小时，利福平组（RIF+）加入1μL10mM的利福平溶液，对照组（RIF-）加入1μL DMSO。物刺激48小时后，收集细胞进行荧光定量PCR检测，结果见图6。

[0051] 请参考图4，通过双荧光检测293T细胞中质粒PCI-PXR-P53、PCI-P53-hPXR、PCI-hPXR及PCI-neo对报告基因质粒的作用。Rif（+）组平均标准化的luciferase活性分别为464±9.5，2899±385，320±23，254±25，差异具有统计学意义(P＜0.05)；Rif（-）组平均标准化的荧光素酶活性分别为344±11，2560±247，263±22，229±23，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

[0052] 请参考图5，通过双荧光检测C3A细胞中质粒PCI-hPXR-P53、PCI-P53-hPXR、PCI-hPXR及PCI-neo对报告基因质粒的作用。Rif（+）组平均标准化的荧光素酶活性分别为6633±443，20046±2806，1539±137，626±94，差异具有统计学意义(P＜0.05)；Rif（-）组平均标准化的荧光素酶活性分别为4098±920，16391±2412，435±168，732±93，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

[0053] 请参考图6，在C3A细胞瞬时转染质粒PCI-hPXR-P53、PCI-P53-hPXR、PCI-hPXR及PCI-neo通过荧光定量PCR检测CYP3A4mRNA变化。Rif（+）组CYP3A4mRNA2－△△ct值分别为9.52±2.61，6.01±0.27，3.82±0.15，1.57±0.11，差异具有统计学意义(P＜0.05)；Rif（-）组CYP3A4mRNA2－ △ △ct值分 别为 8.07±0.11，6.36±0.94，2.37±0.22，
1.02±0.02，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

[0054] 从以上结果可知，在293T细胞中转染PCI-hPXR-P53及PCI-P53-hPXR后，荧光素酶活性要明显高于PCI-hPXR，证明PCI-hPXR-P53及PCI-P53-hPXR对CYP3A4启动子的激活作用更强，这也间接提示P53-AD在这个过程中发挥了一定的正面作用。加入利福平诱导后，各组的荧光素酶活性均有一定提高，说明PCI-hPXR-P53及PCI-P53-hPXR对CYP3A4启动子的激活作用是可调节的，符合正常的生理情况。在C3A细胞中，由于C3A细胞是肝肿瘤细胞来源，自身可表达PXR等一系列参与CYP3A4调控表达的特异性因子，所以检测的荧光素酶活性均要高于293T细胞，但是整体趋势与293T细胞基本一致。通过双荧光检测，从基因水平证明嵌合载体PCI-hPXR-P53及PCI-P53-hPXR能结合并激活CYP3A4启动子。

[0055] 荧光定量PCR进一步验证了双荧光检测的结果，在C3A细胞瞬时转染载体PCI-hPXR-P53及PCI-P53-hPXR后，CYP3A4mRNA转录显著高于PCI-hPXR，并且能被利福平诱导。

[0056] 综上所述，本发明的包括人核因子孕烷X受体基因全长序列和野生型P53基因的激活域序列的嵌合基因及其构建方法能够明显提高体外培养人肝细胞的生理性CYP3A4表达。

[0057] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。

[0058] SEQUENCE LISTING

[0059] <110>南方医科大学珠江医院

[0060] <120>用于提高体外培养人肝细胞的生理性CYP3A4表达的嵌合基因及其构建方法

[0061] <160>5

[0062] <210>1

[0063] <211>7016

[0064] <212>DNA

[0065] <213>人工序列

[0066] <220>

[0067] <221>PCI-hPXR-P53

[0068] <223>嵌合基因

[0069] <400>1

[0070] tcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctattggcc[0071] attgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgcc[0072] atgttggcattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagccc[0073] atatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc[0074] ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacg[0075] tcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaag[0076] tccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt[0077] acgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggtt[0078] ttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccat[0079] tgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactg[0080] cgatcgcccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcaga[0081] gctcgtttagtgaaccgtcagatcactagaagctttattgcggtagtttatcacagttaaattgct[0082] aacgcagtcagtgcttctgacacaacagtctcgaacttaagctgcagtgactctcttaaggtagcc[0083] 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agtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctga[0343] tgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcg[0344] catcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagca[0345] tcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatct[0346] cgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggatt[0347] catcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatat[0348] tgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccga[0349] ttcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaa[0350] atgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgatggccgcaataaaatatctttattttcatt[0351] acatctgtgtgttggttttttgtgtgaatcgatagcgataaggatccgcgtatggtgcactctcag[0352] tacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgcc[0353] ctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat[0354] gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatt[0355] tttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgt[0356] gcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaata[0357] accctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgc[0358] ccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagt[0359] aaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaa[0360] gatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatg[0361] tggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctca[0362] gaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagaga[0363] attatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcgg[0364] aggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttg[0365] ggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggc[0366] aacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaataga[0367] ctggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttat[0368] tgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatgg[0369] taagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatag[0370] acagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcata[0371] tatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttga[0372] taatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaa[0373] gatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaacc[0374] accgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactgg[0375] cttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaa[0376] gaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtgg[0377] cgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcggg[0378] ctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacct[0379] acagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaag[0380] cggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatag[0381] tcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggag[0382] cctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctca[0383] catggctcgacagatct

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[0390] <223>143-215为P53，216-222为linker，223-655为hPXR.

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[0438] Arg Met Met Ile Arg Glu Leu Met Asp Ala Gln Met Lys Thr Phe Asp[0439] 370 375 380

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[0446] Ser Leu Gln Leu Arg Gly Glu Asp Gly Ser Val Trp Asn Tyr Lys Pro[0447] 435 440 445

[0448] Pro Ala Asp Ser Gly Gly Lys Glu Ile Phe Ser Leu Leu Pro His Met[0449] 450 455 460

[0450] Ala Asp Met Ser Thr Tyr Met Phe Lys Gly Ile Ile Ser Phe Ala Lys[0451] 465 470 475 480[0452] Val Ile Ser Tyr Phe Arg Asp Leu Pro Ile Glu Asp Gln Ile Ser Leu[0453] 485 490 495[0454] Leu Lys Gly Ala Ala Phe Glu Leu Cys Gln Leu Arg Phe Asn Thr Val[0455] 500 505 510

[0456] Phe Asn Ala Glu Thr Gly Thr Trp Glu Cys Gly Arg Leu Ser Tyr Cys[0457] 515 520 525

[0458] Leu Glu Asp Thr Ala Gly Gly Phe Gln Gln Leu Leu Leu Glu Pro Met[0459] 530 535 540

[0460] Leu Lys Phe His Tyr Met Leu Lys Lys Leu Gln Leu His Glu Glu Glu[0461] 545 550 555 560[0462] Tyr Val Leu Met Gln Ala Ile Ser Leu Phe Ser Pro Asp Arg Pro Gly[0463] 565 570 575[0464] Val Leu Gln His Arg Val Val Asp Gln Leu Gln Glu Gln Phe Ala Ile[0465] 580 585 590

[0466] Thr Leu Lys Ser Tyr Ile Glu Cys Asn Arg Pro Gln Pro Ala His Arg[0467] 595 600 605

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[0470] Asn Ala Gln His Thr Gln Arg Leu Leu Arg Ile Gln Asp Ile His His[0471] 625 630 635 640[0472] Pro Phe Ala Thr Pro Leu Met Gln Glu Leu Phe Gly Ile Thr Gly Ser[0473] 645 650 655[0474] Xaa Glu Phe Thr Arg Gly Thr Ser Arg Val Asp Pro Gly Gly Arg Phe[0475] 660 665 670

[0476] Pro Leu Val Arg

[0477] 675

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