甲硫氨酸羟基类似物(MHA)的发酵产生

摘要

本发明涉及用于发酵产生羟基甲硫氨酸的方法，其包括以下步骤：-在包含碳源、硫源和氮源的合适的培养基中培养重组微生物，其经过修饰以产生甲硫氨酸，-从培养基中回收羟基甲硫氨酸。在一个具体实施方案中，将重组微生物在氮受限的条件下培养。本发明还涉及生物产生的羟基甲硫氨酸及其用途。

权利要求

1.一种用于发酵产生羟基甲硫氨酸的方法，其包括以下步骤：-在包含碳源、硫源和氮源的合适的培养基中培养重组微生物，所述微生物经过修饰以产生甲硫氨酸，所述微生物是肠杆菌科细菌，-从培养基回收羟基甲硫氨酸，

其中将重组微生物在氮受限的条件下培养，其中培养基的C/N摩尔比率大于5；而且其中所述重组微生物包含以下遗传修饰的至少一种：-以下基因的提高表达：metA*、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serB、thrA*、cysE、serA、serC，-以下基因的弱化表达：metJ、pykF、pykA、purU、yncA、ybdL。

2.根据权利要求1的方法，其中培养基的C/N摩尔比率大于10。

3.权利要求1的方法，其中培养基的C/N摩尔比率大于20。

4.权利要求3的方法，其中C/N摩尔比率为20至25。

5.根据权利要求1到4中任一项的方法，其包括以下连续的步骤：-使重组微生物在包含碳源、硫源和氮源的合适的培养基中生长，-在所述合适的培养基中在氮受限的条件下培养重组微生物，-从培养基回收羟基甲硫氨酸。

6.根据权利要求5的方法，其中将微生物以以下两个连续的步骤在生物反应器系统中培养：-使微生物在包含碳源、硫源和氮源的合适的培养基中生长10h到20h，-在合适的培养基中在氮受限条件中培养微生物10h到20h。

7.根据权利要求6的方法，其中将微生物以以下两个连续的步骤在生物反应器系统中培养：-使微生物在包含碳源、硫源和氮源的合适的培养基中生长15h到20h，-在合适的培养基中在氮受限条件中培养微生物10h到15h。

8.根据权利要求1的方法，其中所述重组微生物还包含以下修饰的至少一种：-以下基因的提高表达：pntAB和/或pyc；

-以下基因的弱化表达：udhA。

9.根据权利要求1的方法，其中所述可发酵碳源是葡萄糖或蔗糖。

10.根据权利要求1的方法，其中培养基中的硫源是硫酸盐/酯、硫代硫酸盐/酯、硫化氢、连二硫酸盐/酯、连二亚硫酸盐/酯、亚硫酸盐/酯，或所述不同来源的组合。

11.根据权利要求1的方法，其中羟基甲硫氨酸是通过提取而从培养基回收的。

12.根据权利要求1的方法，其中所述微生物是大肠杆菌菌株。

13.根据权利要求1的方法，其中所述氮源选自下组：(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、(NH4)2S2O3和NH4OH。

14.根据权利要求8的方法，其中所述重组微生物包含以下遗传修饰：-以下基因的提高表达：metA*、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serB、thrA*、cysE、serA、serC和pyc，-以下基因的弱化表达：metJ、pykF、pykA、purU、yncA。

15.根据权利要求8的方法，其中所述重组微生物包含以下遗传修饰：-以下基因的提高表达：metA*、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serB、thrA*、cysE、serA、serC和pntAB，-以下基因的弱化表达：metJ、pykF、pykA、purU、yncA和udhA。

16.根据权利要求8的方法，其中所述重组微生物包含以下遗传修饰：-以下基因的提高表达：metA*、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serB、thrA*、cysE、serA、serC和pyc，-以下基因的弱化表达：metJ、pykF、pykA、purU、yncA和ybdL。

17.根据权利要求6的方法，其中将微生物以以下两个连续的步骤在生物反应器系统中培养：-使微生物在包含碳源、硫源和氮源的合适的培养基中生长15h，-在合适的培养基中在氮受限条件中培养微生物20h。

18.根据权利要求7的方法，其中氮限制在15小时的培养时间发生。

说明书

甲硫氨酸羟基类似物(MHA)的发酵产生

技术领域

[0001] 本发明涉及用于通过发酵产生2- 羟基 -4- 甲硫基丁酸(2-hydroxy-4-(methylthio)butyric acid,HMBA)的方法，其为必需氨基酸甲硫氨酸的类似物。发酵是生物过程，其中微生物使用培养基中所提供的碳、硫和氮生物合成通常由化学合成的感兴趣产物。

背景技术

[0002] 2-羟基-4-甲硫基丁酸(HMBA)，通常称作“羟基甲硫氨酸(hydroxymethionine)”，是必需氨基酸甲硫氨酸的类似物，且是重要的饲料添加剂。其普遍用于禽类饲料中，因为认为商业的基于玉米-黄豆饲料中的甲硫氨酸是第一限制性氨基酸。

[0003] 甲硫氨酸羟基类似物在甲硫氨酸分子的α-碳上含有一个羟基而不是氨基基团。HMBA具有下述分子式：

[0004] CH3SCH2CH2CH(OH)COOH

[0005] 与氨基酸形成对比的是，其不直接由生物体用在蛋白合成中，因为其必须经合成代谢转化为氨基酸以如此使用。HMBA不以纯的形式，而是以多种形式而使用，即：

[0006] -HMBA的钙盐和铵盐的混合物(US2,745,745和US2,938,053)，

[0007] -酸性水溶液(US4,353,924)，

[0008] -HMBA的钙盐，其通过在US3,175,000中描述的工艺获得。

[0009] 长久以来已知通过化学途径制备HMBA。几个来自NOVUS International(PCT/US98/01595)、MONSANTO Company(EP0142488),BRITISH Telecomm(EP0143000) 或 Rhone Poulenc Animal Nutrition S.A.(US6,180,359)的专利描述了通过两阶段工艺将2-羟基-4-甲硫基丁腈(2-hydroxy-4-methylthio-hydroxybutyronitrile，HMBN)水解成为HBMA。所有这些技术大致依赖于同样的原材料和关键中间体。

[0010] 第一阶段如下所述：使2-羟基-4-甲硫基丁腈(HMBN)与强无机酸如盐酸或硫酸接触。在后续的阶段中，在以水稀释后，水解在更高的温度完成。然后将HMBA用有机溶剂萃取，所述有机溶剂与水不是很易混合，如酮，然后将溶剂通过电穿孔(electroporation)去除。

[0011] 酰胺2-羟基-4-甲硫基丁腈(HMBN)是由甲基-巯基-丙醛(methyl-mercapto-propionaldehyde，MMP)和氢氰酸(drocyanic acid，HCN)或氰化钠(sodium cyanide，NaCN)之间反应而合成的。

[0012] 在过去几年间，出现出了新的方法，其牵涉酶或生物材料。例如Aventis Animal Nutrition S.A.已经描述和取得了以下专利：用于通过酶水解2-羟基-4-甲硫基丁腈中间体而制备HMBA的方法。该发明基于使HMBA在与具有腈水解酶(nitrilase)活性的固定的生物材料接触后该分子的生物转化(US6,180,359)。相似的工艺由Novus所描述，其是2-羟基-4-甲硫基-丁腈(2-hydroxy-4-(methylthio)-butanenitrile)到2-羟基-4-甲硫基-丁酰胺(2-hydroxy-4-(methylthio)-butaneamide)或2-羟基-4-甲硫基-丁酸或丁酸盐(2-hydroxy-4-(methylthio)-butanoic acid or salts)的酶转化(WO1998032872)。

[0013] 在其通过微生物改进甲硫氨酸的产生的努力中，发明人令人惊讶地发现羟基甲硫氨酸也可以在在发酵工艺中自简单的碳源在微生物中产生。这是第一个完全生物产生甲硫氨酸羟基类似物的报道。

发明内容

[0014] 本发明涉及用于羟基甲硫氨酸的发酵产生的方法，其包含以下步骤：

[0015] ●在包含碳源、硫源和氮源的合适的培养基中培养重组微生物，其经过修饰以产生甲硫氨酸，

[0016] ●从培养基中回收羟基甲硫氨酸。

[0017] 发酵产生基于微生物的生长，其中微生物将简单的碳源，通常是糖，用于其生长和用于有兴趣化合物的生物合成。

[0018] 发明详述

[0019] 本发明涉及用于产生羟基甲硫氨酸的方法，其中针对产生甲硫氨酸而优化的重组微生物从碳源、硫源和氮源产生羟基甲硫氨酸。

[0020] ■产物

[0021] 术语“羟基甲硫氨酸”或“甲硫氨酸羟基类似物”或“MHA”或“2-羟基-4-甲硫基丁酸(2-Hydroxy-4-(methylthio)butyric acid)”或“2-羟基-4-甲硫基丁酸(2-Hydroxy-4-(methylthio)butanoic acid)”或“HMTBA”或“HMBA”或“DL-2-羟基-4-甲巯基丁酸(DL-2-Hydroxy-4-(methylmercapto)butanoic acid)”是可以互换使用而指代发酵产物的。

[0022] ■微生物

[0023] 本发明涉及针对产生甲硫氨酸、产生羟基甲硫氨酸而优化的微生物的用途。

[0024] 术语“用于甲硫氨酸的产生的微生物”或“产生甲硫氨酸的微生物”或“经过修饰以产生甲硫氨酸的微生物”或“经过优化而用于产生甲硫氨酸的微生物”指代微生物，其与非生产性(non-producing)微生物相比产生更高水平的甲硫氨酸，所述非生产性微生物仅产生用于其内源需要的甲硫氨酸，而经过修饰的微生物产生与微生物的代谢所需的相比更多的甲硫氨酸。针对甲硫氨酸产生而优化的微生物是本领域内所熟知的，其已经在，特别是专利申请WO2005/111202、WO2007/077041和WO2009/043803中公开。

[0025] 术语“重组微生物”或“修饰的微生物”指代微生物，其经遗传修饰，即基因的添加或阻遏，或对一些基因的表达调控的修饰。

[0026] 根据本发明，由重组微生物所产生的甲硫氨酸的量，且特别是甲硫氨酸的产率(每克/摩尔碳源产生的以克/摩尔计的甲硫氨酸的比率)，在经过修饰的微生物中与对应的未经修饰的微生物相比更高。常见的修饰包括通过转化和重组而缺失基因，基因替换，以及过表达基因或引入用于表达外源基因的载体。

[0027] 这些针对产生甲硫氨酸而修饰的微生物同时能够产生羟基甲硫氨酸。发明者已观察到，如果微生物产生更多的甲硫氨酸，其也产生更多的羟基甲硫氨酸。

[0028] 用于本发明的微生物是细菌、酵母、或真菌。优选地，微生物选自：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，所述微生物是下述属的微生物：埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)或棒杆菌属(Corynebacterium)。甚至更优选地，所述微生物是下述种之一：大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

[0029] ■发酵

[0030] 术语“发酵工艺”、“培养”或“发酵”可以互换使用以表示细菌在合适的生长培养基上的生长，所述生长培养基含有简单的碳源、硫源和氮源。

[0031] 在本发明的发酵工艺中，同时使用碳源以：

[0032] -产生生物质：通过转化培养基的碳源使微生物生长等，和

[0033] -产生羟基甲硫氨酸和/或甲硫氨酸：通过生物质将同样的碳源转化为羟基甲硫氨酸和/或甲硫氨酸。

[0034] 两个阶段是并行的(concomitant)，微生物转化碳源从而生长导致了培养基中的羟基甲硫氨酸和/或甲硫氨酸产生，因为微生物包含允许这类转化的代谢途径。

[0035] 发酵是经典的工艺，其可在有氧(aerobic)、微氧(microaerobic)或无氧环境下进行。

[0036] 发酵一般在发酵罐中进行，其含有适于所用的微生物的合适培养基，所述培养基含有至少一种简单碳源，以及，如需要，用于产生代谢物的协同底物(co-substrates)。

[0037] 在本发明中，发酵是以分批补料模式(fed-batch mode)完成的。分批补料指代发酵类型，其中在发酵期间添加补充的生长培养基，但是不移除培养物(除了用于取样和HPLC/GCMS分析法的小体积)，直至批次结束。该工艺包含两个主要步骤：第一步骤是在合适的批次矿物质培养基(batch mineral medium)和补料批次矿物质培养基(fed-batch mineral medium)中的一系列的预培养。接着，使用装有合适的基本批次培养基(minimal batch medium)的发酵罐以根据合意的生产而以不同的分批补料培养基进行培养。

[0038] 本领域技术人员能够根据本发明限定用于所述微生物的培养条件和培养基的组成。特别地，在20℃至55℃、优选25℃至40℃，且更具体地对于谷氨酸棒状杆菌以大约30℃和对于大肠杆菌以大约37℃的温度发酵细菌。

[0039] 作为用于大肠杆菌的已知培养基的实例，所述培养基可以与M9培养基(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA32:120-128)、M63 培 养 基 (Miller,1992;A Short Course in Bacterial Genetics:A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)、或如Schaefer等(1999,Anal.Biochem.270:88-96)所定义的培养基的组成相同或相似。

[0040] 作为用于谷氨酸棒杆菌的已知培养基的例子，培养基可以与BMCG培养基(Liebl et al.,1989,Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205-210)或与如Riedel等(2001,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3:573-583)所描述的培养基组成相同或相似。

[0041] 根据本发明的术语“碳源”指任意的碳源，其可由本领域技术人员用于支持微生物的正常生长，其可以是己糖如葡萄糖、半乳糖或乳糖；戊糖；单糖；二糖如蔗糖(糖蜜)、纤维二糖或麦芽糖；寡糖如淀粉或其衍生物；半纤维素；甘油，及其组合。特别优选的碳源是葡萄糖。另一个优选的碳源是蔗糖。

[0042] 在本发明的一个具体实施方案中，碳源来源于可再生原料(renewable feed-stock)。可再生原料定义为某些工业工艺所需的原材料，其可以在短暂时间内以足够的量再生以允许其转化为合意的产物。植物性生物质，无论是否经处理，是令人感兴趣的可再生碳源。

[0043] 碳源是可发酵的，即其可以用于微生物的生长。

[0044] 根据本发明的术语“硫源”指代硫酸盐/酯(sulphate)、硫代硫酸盐/酯(thiosulfate)、硫化氢、连二硫酸盐/酯(dithionate)、连二亚硫酸盐/酯(dithionite)、亚硫酸盐/酯(sulphite)、甲硫醇(methylmercaptan)、二甲硫醚(dimethylsulfide)和其它甲基封端的硫化物(methyl capped sulphides)或所述不同来源的组合。更加优选地，培养基中的硫源是硫酸盐/酯或硫代硫酸盐/酯或其混合物。

[0045] 培养可以在这类环境中进行：使微生物对无机底物，特别是磷酸盐/酯和/或钾受限或饥饿。使生物体对无机底物受限定义为这样的情况：在此情况下微生物的生长是由提供的无机化学物质的量而支配的，所述提供的无机化学物质依然允许较弱的生长。使微生物对无机底物饥饿定义为这样的情况：在此情况下微生物的生长由于没有该无机底物而完全停止。

[0046] 术语“氮源”对应于铵盐(ammonium salt)或氨气(ammoniac gas)。氮来自无机(例如(NH4)2SO4)或有机(例如，尿素或谷氨酸)来源。在本发明中，培养物中的氮源是(NH4)2HPO4、(NH4)2S2O3、和NH4OH。

[0047] 在本发明的一个具体的方面，将重组微生物在氮受限的条件下培养。事实上，发明人已经观察到氮受限的条件增强羟基甲硫氨酸产生。

[0048] 术语“氮受限的条件”指代具有受限浓度的氮的培养基，其中氮可以由无机(例如，(NH4)2SO4)或有机(例如，尿素或谷氨酸)来源提供，且术语“氮饥饿的条件”指代完全没有氮源的培养基。

[0049] “氮受限”意指可得的氮源是以这样的量存在，其使得细菌的生长和/或生物质产率受限，即氮源是以低于支持最大生长速率和/或生物质产率的量而存在的。本领域技术人员能够确定适于诱导羟基甲硫氨酸的产生的氮的合适受限浓度。实际的“氮受限量”可以随着具体培养基和随着使用的微生物株而变化。例如，微生物是具有高氮需求的产生甲硫氨酸和羟基甲硫氨酸的重组细菌。施于培养基中的氮的量依赖于这些特征。其可以通过对在不同浓度的氮源下的培养基中的细菌的常规实验而确定。此外，本领域技术人员知晓在发酵期间在培养基中测量可获得的氮的浓度的方法，如离子层析(ionic chromatography)，并以此测量残留氮浓度以测定受限的条件。

[0050] 已知未经修饰大肠杆菌菌株在普通条件中的生长需要大约4.2的C/N比率(摩 尔/ 摩 尔 )(Energetics and kinetics in biotechnology.J.A.Roels.Elsevier Science&Technology(May1983))。

[0051] 在本发明的一个具体实施方案中，发酵是在一般条件中进行的，其中培养物中使用的不同培养基导致C/N摩尔比率大于大约5、优选大于大约10、更优选大于大约20、且最优选为大约20至25(其中C/N比率是作为相应的糖和氮源中的碳元素与氮元素的摩尔比率而测量的)。

[0052] 在本发明的一个优选实施方案中，产生工艺包括以同样培养批次培养基中同样的微生物进行的三个后续的步骤：

[0053] ●在包含可发酵的碳源、硫源和氮源的合适的培养基中生长重组微生物，[0054] ●在所述合适的培养基中在氮受限的条件下培养重组微生物

[0055] ●从培养基回收羟基甲硫氨酸。

[0056] 在所有工艺期间发酵是在同样的原始批次培养基中进行的，其中培养条件依赖于微生物的性能和在培养期间添加的分批补料培养基的组成而发展。

[0057] “生长”步骤是在没有限制的基本培养基条件中进行的，其中开始甲硫氨酸的产生。“培养”的步骤，其中羟基甲硫氨酸的产生增强，是在在氮受限的条件下进行的。

[0058] 氮受限在微生物将培养基中存在的几乎所有氮用于其分裂和产生而消耗的时候发生。微生物越是生长和产生甲硫氨酸，其越使用更多氮。因此氮受限的条件取决于微生物的特征，且更精确地，取决于其生长与产生速率。本领域技术人员能够计算和预见重组微生物的具体需要。

[0059] 在本发明的一个具体实施方案中，重组生物是以两个连续的步骤在生物反应器系统中培养的：

[0060] a.使微生物在包含可发酵的碳源、硫源和氮源的合适的培养基中生[0061] 长大约10h到20h，优选大约15h到20h，

[0062] b.使微生物在所述合适的培养基中在氮受限条件中生长大约10h到[0063] 20h，优选10h到15h。

[0064] 如前面所描述的，在根据本发明的工艺中使用的重组微生物经过遗传修饰以供将碳源转化为甲硫氨酸和羟基甲硫氨酸。

[0065] ■遗传修饰

[0066] 在本发明的说明书中，以其在大肠杆菌中相应的命名而识别基因和蛋白质。然而，且除非另外指定，这些命名的用途根据本发明具有更加普遍的含义，且涵盖所有在其它生物体中，特别是微生物中，对应的基因和蛋白质。

[0067] PFAM(比对和隐马尔科夫模型的蛋白家族(protein families of alignments and hidden Markov model；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)代表了蛋白质序列对比的大集合。每个PFAM使得可视化多重对比、观看蛋白域、评估不同生物体中的分布、取得其它数据库的访问权和可视化已知的蛋白质结构成为可能。

[0068] COG(s)(直 向 同 源 群 蛋 白 集 群，clusters of orthologous groups of proteins;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)是通过比较代表38个主要种系发生路线，来自66个完整测序基因组中的蛋白序列获得的。每个COG是由至少三条路线定义的，其允许鉴别前保守结构域。

[0069] 鉴别同源的序列及其同源百分比的方法对于本领域技术人员是熟知的，其具体包括BLAST程序。所述BLAST程序可以在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/中使用，该网站显示了默认的参数。从中获得的序列可例如使用CLUSTALW程序(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 或 MULTALIN 程 序 (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)而进一步利用(例如序列对比)，所述的网站显示了默认的参数。

[0070] 通过使用GenBank中给出的已知基因的参考，本领域技术人员能够确定其在其它生物体，细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等等中的等价基因。该常规工作可以使用通过与来源于其它微生物的基因进行序列对比而确定的共同序列而有利地完成，并设计简并探针以在另一种生物体内克隆相应的基因。这样的分子生物学中的常规方法对于本领域技术人员是熟知的，并由例如Sambrook等提出(1989Molecular Cloning:a Laboratory Manual.第2版Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York)。

[0071] 术语“活性弱化(attenuation of activity)”在本发明中可用于酶或基因，在两种情况下均表示部分或完全地阻遏了对应基因的表达，从而这样的酶或基因是“弱化的(attenuated)”。该表达的阻遏可以是对基因的表达的抑制，对基因表达必需的全部或部分的启动子区的缺失，基因编码区中的缺失，或对野生型启动子以弱的自然或合成启动子置换。优选地，所述基因的弱化是基本上完全缺失该基因，其可替换为便于根据本发明菌株的鉴定、分离和纯化的选择性标志物基因。优选地，通过同源重组(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645)的技术使基因失活。

[0072] 术语“增强的活性”是指与未经过修饰的微生物的酶活性相比更高的酶活性。本领域技术人员知晓如何测量所述酶的酶活性。

[0073] 本领域的技术人员知晓不同的手段以增强酶活性：修饰蛋白质的催化位点、提高蛋白质的稳定性、提高信使RNA的稳定性、提高编码蛋白质的基因的表达。

[0074] 本领域知晓稳定蛋白质的元件(例如GST标签，Amersham Biosciences)，以及稳定信使RNA的元件(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15，58-64)。

[0075] 术语“提高的基因表达”、“增强的基因表达”或“基因的过表达”在本文中具有相似的意义，并且是可以互换使用的。

[0076] 为提高基因的表达，本领域技术人员知晓不同的技术：提高基因在微生物中的拷贝数、使用诱导基因高水平表达的启动子、弱化基因的直接或间接转录阻抑物的活性和/或表达。

[0077] 基因是在染色体上或染色体外编码的。当基因位于染色体上时，可以同过本领域技术人员知晓的重组方法(包括基因置换)在染色体上引入所述基因的几个拷贝。当基因是位于染色体外时，所述基因可以由复制起点不同而因此在细胞中具有不同的拷贝数的不同种类的质粒所携带。取决于质粒的性质，这些质粒以1到5个拷贝，或者大约20个拷贝，或多至500个拷贝存在微生物中：具有严谨复制的低拷贝数质粒(pSC101，RK2)，低拷贝数质粒(pACYC，pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSK bluescript II)。

[0078] 在本发明的一个具体实施方案中，使用不同强度的启动子表达基因。在本发明的一个实施方案中，所述启动子是可诱导的。这些启动子是同源的或异源的。本领域技术人员知晓何种启动子是最方便的，例如广泛使用Ptrc、Ptac、Plac或lambda启动子cI。

[0079] ·甲硫氨酸生物合成途径的优化：

[0080] 在微生物中参与甲硫氨酸产生的基因是本领域内熟知的，且包括参与甲硫氨酸特异性生物合成途径的基因以及参与前体提供途径的基因和参与甲硫氨酸消耗途径的基因。

[0081] 甲硫氨酸的有效产生需要甲硫氨酸特异性途径和几个前体提供途径的优化。甲硫氨酸生产株已经在专利申请WO2005/111202、WO2007/077041和WO2009/043803中描述。将这些申请通过提述并入本申请。

[0082] 专利申请WO2005/111202描述了一种甲硫氨酸生产株，其过表达高丝氨酸琥珀酰转移酶等位基因，所述等位基因具有对其抑制物SAM和甲硫氨酸降低的反馈敏感性(称为metA*)。该申请也描述了将这些等位基因与甲硫氨酸阻抑物MetJ的缺失的组合，MetJ负责下调甲硫氨酸调节子。除此之外，本申请描述了将所述的两个修饰与天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶(由thrA基因所编码)的过表达组合。

[0083] 对于改进甲硫氨酸的产生，微生物可以呈现：

[0084] -选自下组的至少一个基因的提高的表达：

[0085] ●cysP，其编码周质硫酸结合蛋白，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，[0086] ●cysU，其编码硫酸ABC转运蛋白，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，[0087] ●cysW，其编码膜结合硫酸转运蛋白，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，

[0088] ●cysA，其编码硫酸通透酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，[0089] ●cysM，其编码O-乙酰基丝氨酸巯解酶(O-acetyl serine sulfhydralase)，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，

[0090] ●cysI和cysJ，其分别编码亚硫酸还原酶的α和β亚基，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述。优选地，cysI和cysJ一起过表达，

[0091] ●cysH，其编码腺苷酰硫酸还原酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，[0092] ●cysE，其编码丝氨酸酰基转移酶，在WO2007/077041中描述，

[0093] ●serA，其编码磷酸甘油酸脱氢酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，[0094] ●serB，其编码磷酸丝氨酸磷酸酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，[0095] ●serC，其编码磷酸丝氨酸氨基转移酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，

[0096] ●metA等位基因，其编码具有对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸降低的反馈敏感性的高丝氨酸琥珀酰转移酶(metA*)，在WO2005/111202中描述，

[0097] ●thrA或thrA等位基因，其编码具有对苏氨酸降低的反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶(thrA*)，在WO2009/043803和WO2005/111202中描述，

[0098] -或者下列基因中至少一种的表达的抑制：

[0099] ●pykA，其编码丙酮酸激酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，[0100] ●pykF，其编码丙酮酸激酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，[0101] ●purU，其编码甲酰四氢叶酸去甲酰酶，在WO2007/077041和WO2009/043803中描述，

[0102] ●yncA，其编码N-乙酰转移酶，在WO2010/020681中描述，

[0103] ●metJ，其编码甲硫氨酸生物合成途径的阻抑物，在WO2005/111202中描述，[0104] ●ybdL，其编码氨基转移酶。

[0105] -或C1代谢的提高，其导致改善的甲硫氨酸产生。

[0106] 根据本发明，“提高C1新陈代谢”涉及参与在C1代谢中的至少一个酶的活性的提高，所述参与在C1代谢中的酶选自MetF、GcvTHP、Lpd、GlyA、MetE或MetH。对于提高酶活性，可以过表达或在其核酸序列上修饰这些不同的酶的对应的基因，所述在核酸序列上的修饰可以使表达的酶的活性改进，或可降低其对反馈调控的敏感性。

[0107] 在本发明的一个优选实施方案中，通过增强亚甲基四氢叶酸还原酶MetF的活性和/或甘氨酸切割复合体(glycine cleavage complex)GcvTHP的活性和/或丝氨酸羟甲基转移酶GlyA的活性以提高一碳代谢。

[0108] 在本发明的一个具体实施方案中，通过过表达metF基因和/或通过优化其翻译以增强MetF的活性。

[0109] 在本发明的一个具体实施方案中，通过在属于Ptrc家族启动子的强启动子的调控下表达基因以达成metF基因的过表达，或在例如申请PCT/FR2009/052520中描述的温度可诱导启动子PR的可诱导启动子的调控下达成metF基因的过表达。

[0110] 根据本发明的另一个实施方案，通过使用RNA稳定剂以达成MetF蛋白翻译的优化。其它过表达基因的手段是对于本领域技术人员是已知的，并可用于metF基因的过表达。

[0111] 在本发明的一个具体实施方案中，基因可以是在可诱导启动子调控下。专利申请PCT/FR2009/052520描述了表达thrA等位基因的甲硫氨酸生产株，所述thrA等位基因具有对苏氨酸和cysE降低的反馈抑制，并且其是在诱导启动子调控下。通过提述将该申请并入本申请文件。

[0112] 在本发明的一个优选实施方案中，thrA基因或等位基因是在温度可诱导启动子的调控下。在一个最优选的实施方案中，使用的温度可诱导启动子属于PR启动子家族。

[0113] 在本发明的另一个方面，增强了丙酮酸羧化酶的活性。通过过表达对应的基因或修饰该基因的核酸序列以表达具有改善的活性的酶而获得提高活性的丙酮酸羧化酶。在本发明的另一个实施方案中，在所述经过修饰的微生物中通过重组将一个或几个拷贝的pyc基因引入染色体，或由以至少一个拷贝存在的质粒来携带pyc基因。所述pyc基因源自Rhizobium etli、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)或棒杆菌属菌种。

[0114] 其它导致改善的甲硫氨酸产生的遗传修饰是pntAB的提高的表达和/或udhA的弱化，其在专利申请EP10306164.4和US61/406249中描述。

[0115] 在本发明的一个具体实施方案中，所述过表达的基因是在它们在染色体上的天然位置，或整合在非天然的位置。对于最优的甲硫氨酸产生，可以需要几个拷贝数的所述基因，并且这些多拷贝是整合入特定的基因座中，所述基因座的修饰对甲硫氨酸的产生没有负面的影响。

[0116] 可以整合基因而不扰乱细胞的新陈代谢的基因座的例子有：

[0117]

[0118]

[0119]

[0120]

[0121]

[0122]

[0123]

[0124]

[0125]

[0126]

[0127]

[0128]

[0129] 本发明还涉及生物产生的羟基甲硫氨酸，如通过以上描述的方法而获得的。

[0130] 本发明还涉及用于动物营养的组合物，其包含生物产生的羟基甲硫氨酸，以及美容用组合物，其包含生物产生的羟基甲硫氨酸。

[0131] ■羟基甲硫氨酸的回收

[0132] 行为“从培养基中回收羟基甲硫氨酸”指代回收和纯化羟基甲硫氨酸的行为。

[0133] 在本发明的一个具体实施方案中，羟基甲硫氨酸是通过提取而从发酵液(培养基)中回收的。

[0134] 该回收可以通过发酵液的液-液提取(liquid-liquid extraction)而获得。优选地，在该提取中所使用的溶液是基本上与水不互溶的。合适的溶剂选自：酮，如丙酮、甲基乙基酮、甲基戊基酮、甲基异戊基酮、甲基异丙基酮、甲基异丁基酮、乙基丁基酮、二异丁基酮；醚，如异丙醚、四氢呋喃和二甲氧基乙烷；仲醇，如2-丙醇；醛，如正丁醛；和酯，如乙酸乙酯、乙酸正丁酯、乙酸正丙酯和乙酸异丙酯。优选的溶剂选自酮、醚和仲醇。

[0135] 在本发明的另一个实施方案中，提取可以是液/液提取和固/固提取的组合。

[0136] 然后将从提取回收的羟基甲硫氨酸通过蒸馏，优选蒸汽蒸馏，或通过蒸发而纯化。

[0137] 可选地，从0到100%、优选至少90%、更加优选95%、甚至更优选至少99%的生物质可以在发酵产物的纯化期间保留。

[0138] 附图简述

[0139] 图1：对于用于发酵的三种分批补料溶液的菌株1的培养物的铵残留浓度。实施例

[0140] 实施例I：构建甲硫氨酸和羟基甲硫氨酸生产株，其在实施例II中测试[0141] 1.规程

[0142] 使用了数个规程以构建甲硫氨酸和羟基甲硫氨酸生产株，将其在下述实施例中描述。

[0143] 规程1：通过同源重组和选择重组体进行染色体修饰(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000))

[0144] 通过Datsenko.和Wanner(2000)描述的同源重组在特定的染色体基因座中进行等位基因置换或基因破坏。将侧翼为Flp识别位点的氯霉素(Cm)抗性cat基因，卡那霉素(Km)抗性kan基因或庆大霉素(Gt)抗性gm基因通过PCR分别使用pKD3、pKD4或p34S-Gm质粒(Dennis和Zyltra，AEM july1998，p2710-2715)作为模板扩增。使用产生的PCR产物转化受体大肠杆菌菌株。所述受体菌株带有表达λRed(γ，β，外)重组酶的质粒pKD46。然后选择抗生素抗性的转化产物并使用合适引物通过PCR分析验证突变基因座的染色体结构。

[0145] 规程2：噬菌体P1的转导

[0146] 通过P1转导将染色体修饰转移到给定的大肠杆菌受体菌株。该规程包括2步骤：(i)在含有所述抗性关联的染色体修饰的供体菌株上制备噬菌体裂解物，以及(ii)以该噬菌体裂解物感染受体菌株。

[0147] 制备噬菌体裂解物

[0148] -接种100μL过夜培养的带有感兴趣的染色体修饰的菌株MG1655到10mL的LB+50μg/mL Km+0.2%葡萄糖+5mM CaCl2(含有对应于构建体的抗性盒的抗生素)。

[0149] -在37℃振荡温育30min。

[0150] -加入100μL在供体菌株MG1655上制备的P1噬菌体裂解物(约1x109噬菌体/ml)。

[0151] -在37℃振荡3小时直到细胞完全裂解。

[0152] -加入200μL氯仿并涡旋。

[0153] -在4500g离心10min以消除细胞碎片。

[0154] -将上清转移到无菌的试管中。

[0155] -将裂解物储存在4℃。

[0156] 转导

[0157] -将5mL在LB中培养的大肠杆菌受体菌株的过夜培养物在1500g离心10min。

[0158] -将细胞沉淀悬于2.5mL MgSO410mM，CaCl25mM中。

[0159] -以100μL P1噬菌体裂解物感染100μL细胞，所述P1噬菌体裂解物是在染色体上带有修饰的菌株MG1655P1噬菌体裂解物(试管中)，以及作为对照试管的没有P1噬菌体的100μL细胞和没有细胞的100μL P1噬菌体裂解物。

[0160] -在30℃不振荡温育30min。

[0161] -在每个试管中加入100μL柠檬酸钠，并涡旋。

[0162] -加入1mL LB。

[0163] -在37℃振荡下温育1小时。

[0164] -在7000rpm离心3min。

[0165] -在LB+50μg/mL Km(或对应于抗性盒的抗生素)上铺板

[0166] -在37℃过夜温育。

[0167] 表1：在接下来的实施例中显示的生产株的基因型和对应编号。

[0168]

[0169] 2.构建菌株1

[0170] 为了过表达 Rhizobium etli的丙酮酸羧化酶基因，已经构建了pJB137-PgapA-pycRe 质 粒，其 来 源 于 pBluescript-SK(Alting-Mees 等 ,Nucleic Acids Res.17(22),9494(1989) 和 pJB137 质 粒 (Blatny 等 .,Appl.Environ.Microbiol.63:370-379,1997)。

[0171] 为 构 建PgapA-pycRe 插 入 物，已 经 构 建 了 两 个 质 粒：pSK-PgapA 和pSK-PgapA-pycRe。

[0172] 首先，通过PCR使用引物Ome0053-gapA F(SEQ ID NO:1)和Ome0054-gapA R(SEQ ID NO:2)从大肠杆菌MG1655基因组DNA扩增gapA启动子及其RBS序列。将所得的PCR产物通过HindIII消化并克隆至质粒pSK的HindIII位点之间。通过DNA测序验证获得的质粒并将其命名为pSK-PgapA。

[0173] 其次，使用引物Ome0057-PycR(SEQ ID NO:3)和Ome058-PycF(SEQ ID NO:4)将pycRe基因从Rhizobium etli CFN42基因组DNA扩增。以SmaI和NdeI限制性酶消化所得的PCR产物并将其克隆至pSK-PgapA质粒的SmaI和NdeI位点之间。通过DNA测序验证所获得的质粒，并将其命名为pSK-PgapA-pycRe。

[0174] 最后，将pSK-PgapA-pycRe以SmaI和PsiI限 制性酶消 化，并将所得 的PgapA-pycRe消化片段克隆至pJB137质粒的SmaI位点之间。通过DNA测序验证所获得的质粒，并将其命名为pJB137-PgapA-pycRe。

[0175] Ome0053-gapA F(SEQ ID NO:1)

[0176] ACGTAAGCTTCGTTTAAACAAGCCCAAAGGAAGAGTGAGGC

[0177] 其中

[0178] -下划线大写字母序列代表HindIII和PmeI限制性位点和额外的碱基。

[0179] -大写字母序列与gapA启动子序列(1860640-1860661，参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源。

[0180] Ome0054-gapA R(SEQ ID NO:2)

[0181] ACGTAAGCTTACCGGTCACGTGTCATATGTTCCACCAGCTATTTGTTAG

[0182] 其中

[0183] -下划线大写字母序列代表HindIII、AgeI、AflIII和NdeI限制性位点和额外的碱基。

[0184] -大写字母序列与gapA启动子序列(1860772-1860791，参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源。

[0185] Ome0057-PycR(SEQ ID NO:3)

[0186] ACGTCCCGGGCAAGGACGGGCGAACGAAACC

[0187] 其中

[0188] -下划线大写字母序列是SmaI限制性位点和额外的碱基。

[0189] -大写字母序列与Rhizobium etli丙酮酸羧化酶(pycRe)基因同源，(4240368-4240388，参考序列在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上)。

[0190] Ome0058-PycF(SEQ ID NO:4)

[0191] ACGTACGTAGCATATGCCCATATCCAAGATACTC

[0192] 其中

[0193] -下划线大写字母序列是SnaBI、NdeI限制性位点和额外的碱基。

[0194] -大写字母序列与Rhizobium etli丙酮酸羧化酶(pycRe)基因同源，只是GTG起始密码子由ATG所替换(4236889-4236908，参考序列在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上)。

[0195] 将pJB137-PgapA-pycRe通 过 电 穿 孔 引 入 菌 株 MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC中，其 已经在专利申请EP10306164.4和US61/406249中描述。验证pJB137-PgapA-pycRe的存在，并将选定的菌株metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::
TT02-serA-serC pJB137-PgapA-pycRe命名为菌株1(表1)。

[0196] 3.构建菌株2

[0197] 甲硫氨酸和羟基甲硫氨酸生产株2(表1)已经在专利申请EP10306164.4和US61/406249中描述，将其通过提述并入本文中。

[0198] 4.构建菌株3

[0199] 4.1.构建MG1655metA*11pKD46ΔybdL::Km

[0200] 为了缺失菌株MG1655metA*11pKD46中的ybdL基因，使用了规程1，只是其中使用引物Ome0589-DybdLF(SEQ ID NO:5)和Ome0590-DybdLR(SEQ ID NO:6)从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。

[0201] Ome0589-DybdLF(SEQ ID NO:5)

[0202] CACCGACAGCGGAATCGCCGCTACGCCGTGCTCCTGCGTCAGCCACTGGCAAAACTCAACATCATCCAGGGTAGAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

[0203] 其中

[0204] -大写字母序列与ybdL基因下游的序列同源(633791-633870，参考序列在网站http://ecogene.org/上)

[0205] -下划线大写字母序列对应于pKD4质粒的引物位点1(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)。

[0206] Ome0590-DybdLR(SEQ ID NO:6)

[0207] GGTACAATAAAAATGACAAATAACCCTCTGATTCCACAAAGCAAACTTCCACAACTTGGCACCACTATTTTCACCCAGCATATGAATATCCTCCTTAG

[0208] 其中

[0209] -大写字母序列与ybdL基因上游的序列同源(632797-632874，参考序列在网站http://ecogene.org/上)

[0210] -下划线大写字母序列对应于质粒pKD4的引物位点2(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)

[0211] 选择了卡那霉素抗性重组体。以引物Ome0591-ybdLR(SEQ ID NO:7)和Ome0592-ybdLF(SEQ ID NO:8)通过PCR以及通过DNA测序验证了抗性盒的插入。经验证和挑选菌株称为MG1655metA*11ΔybdL::Km pKD46。

[0212] Ome0591-ybdLR(SEQ ID NO:7)

[0213] CGAAGTGCTGCGCCTGAAGC与ybdM基因上游的序列同源(634054-634035，参考序列在网站http://ecogene.org/上)

[0214] Ome0592-ybdLF(SEQ ID NO:8)

[0215] GCCGGGCCGACGACCACGCGG与ybdH基因下游的序列同源(632663-632683，参考序列在网站http://ecogene.org/上)

[0216] 4.2.ΔybdL的转导

[0217] 然后将ΔybdL::Km缺失转导 进MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC，其已经在专利申请EP10306164.4和US61/406249中描述，转导通过使用来自以上章节4.1.描述的菌株MG1655metA*11pKD46ΔybdL::Km的P1噬菌体裂解物(规程2)进行。

[0218] 选 择 卡 那 霉 素 转 导 体，并 通 过 用Ome0591-ybdLR(SEQ ID NO:7) 和Ome0592-ybdLF(SEQ ID NO:8)的PCR验证ΔybdL::Km染色体修饰的存在。所得的菌株具有以下基因型：MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serBΔmetJΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC DybdL::Km。

[0219] 将pCL1920-PgapA-pycRe-TT07，其已在专利申请EP10306164.4和US61/406249中描述，通过电穿孔引入该菌株。验证pCL1920-PgapA-pycRe-TT07的存在，并将所得 的 菌 株 MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC DybdL::Km pCL1920-PgapA-pycRe-TT07称为菌株3(表1)。

[0220] 实施例II：通过在氮受限条件下以分批补料工艺进行发酵产生羟基甲硫氨酸[0221] 随后测试在烧瓶中产生大量感兴趣代谢物的菌株，所述测试是使用分批补料策略在2.5L发酵罐(Pierre Guerin)中在产生条件下进行的。使用的不同的培养基的成分示于表02到05中。

[0222] 简言之，使用在含2.5g.L-1的葡萄糖的10mL LB培养基中生长24小时的培养物以接种在基本培养基(B1a)中温育24小时的预培养物。这些温育是在旋转振荡器(rotary shaker)中(200RPM)在含有50mL的基本培养基(B1a)的带挡板的500mL烧瓶中进行的。第一次预培养在30℃的温度进行，第二次在34℃的温度进行。

[0223] 第三个预培养步骤是在装有200mL的基本培养基(B1b)以3mL浓缩的预培养物接-1种至生物质浓度1.2g.L 的生物反应器(Sixfors)中进行的。将预处理温度维持恒定在
34℃并将pH使用10%NH4OH溶液自动调节至6.8的值。以空气供给和/或搅拌将溶解氧浓度持续地调节至空气分压饱和(partial air pressure saturation)为30%的值。在葡萄-1 -1
糖从批次培养基耗尽后，分批补料以0.7mL.h 的初始流速起始，以0.13h 的生长速率指数-1
提高24小时以获得大约18g.L 的最终细胞浓度。

[0224] 表2：预培养批次矿物质培养基成分(B1a和B1b)。

[0225]化合物 B1a浓度(g.L-1) B1b浓度(g.L-1)
Zn(CH3COO)2.2H2O 0.0130 0.0130
CuCl2.2H2O 0.0015 0.0015
MnCl2.4H2O 0.0150 0.0150

[0226]CoCl2.6H2O 0.0025 0.0025
H3BO3 0.0030 0.0030
Na2MoO4.2H2O 0.0025 0.0025
柠檬酸Fe(III)H2O 0.1064 0.1064
EDTA 0.0084 0.0084
MgSO4.7H2O 1.00 1.00
CaCl2.2H2O 0.08 0.08
柠檬酸 1.70 1.70
KH2PO4 4.57 4.57
K2HPO4.3H2O 2.50 2.50
(NH4)2HPO4 1.10 1.10
(NH4)2SO4 4.90 4.90
(NH4)2S2O3 1.00 1.00
硫胺素 0.01 0.01
维生素B12 0.01 0.01
葡萄糖 30.00 5.00
MOPS 30.00 0.00
NH4OH28% 调节至pH6.8 调节至pH6.8

[0227] 表3：预培养分批补料矿物质培养基成分(F1)

[0228]化合物 浓度(g.L-1)
Zn(CH3COO)2.H2O 0.0104
CuCl2.2H2O 0.0012
MnCl2.4H2O 0.0120
CoCl2.6H2O 0.0020
H3BO3 0.0024
Na2MoO4.2H2O 0.0020
柠檬酸Fe(III)H2O 0.0424
EDTA 0.0067
MgSO4 5.00
(NH4)2SO4 8.30
Na2SO4 8.90
(NH4)2S2O3 24.80
硫胺素 0.01

[0229]葡萄糖 500.00
维生素B12 0.01
NH4OH28% 调节至pH6.8

[0230] 表4：培养批次矿物质培养基成分(B2)。

[0231]化合物 浓度(g.L-1)
Zn(CH3COO)2.2H2O 0.0130
CuCl2.2H2O 0.0015
MnCl2.4H2O 0.0150
CoCl2.6H2O 0.0025
H3BO3 0.0030
Na2MoO4.2H2O 0.0025
柠檬酸Fe(III)H2O 0.1064
EDTA 0.0084
MgSO4.7H2O 1.00
CaCl2.2H2O 0.08
柠檬酸 1.70
KH2PO4 2.97
K2HPO4.3H2O 1.65
(NH4)2HPO4 0.72
(NH4)2S2O3 3.74
硫胺素 0.01
维生素B12 0.01
葡萄糖 10
NH4OH28% 调节至pH6.8

[0232] 表5：培养分批补料培养基成分(F2、F3和F4)。

[0233]

[0234]

[0235] *培养基的C/N比率(Cmole/mole)对应于培养批次培养基(B2)和分批补料培养基(F2、F3或F4)的C/N比率。

[0236] 在不同的培养基中，当有需要时添加大观霉素和卡那霉素至终浓度50mg.L-1，氯霉-1 -1 -1素至30mg.L ，羧苄西林至100mg.L ，庆大霉素至10mg.L 。

[0237] 接着，向2.5L发酵罐(Pierre Guerin)装入600mL基本培养基(B2)并以55到-170mL之间的预培养体积接种至2.1g.L 的生物质浓度。

[0238] 将培养物温度维持恒定在37℃并将pH通过自动添加NH4OH溶液(NH4OH10%进行9小时，然后28%直至培养结束)维持在工作值(6.8)。在批次期(batch phase)中将初始搅拌速率设定在200RPM并在分批补料期(fedbatch phase)中将其提高至1000RPM。在批-1 -1
次期中将初始气流速率设定在40NL.h 并在分批补料期开始将其提高至100NL.h 。通过增加搅拌将溶解氧浓度维持在20和40%之间的值，优选30%饱和。

[0239] 当细胞质量(cell mass)达到接近5g.L-1的浓度时，以5mL.h-1的初始流速开始分-1批补料。以S形概貌(profile)以在26小时后达到24mL.h 的逐渐提高的流速注射补料溶液(根据实验为F2、F3或F4)。精确的补料条件是以下面的方程计算的：

[0240]

[0241] 其中Q(t)是以mL.h-1为单位的的补料流速，对于600mL体积的批次体积p1=1.80,p2=22.40,p3=0.270,p4=6.5。

[0242] 在26小时的分批补料后，停止补料溶液泵并在葡萄糖耗尽后停止培养。

[0243] 在OPA/Fmoc衍生化之后以HPLC定量胞外氨基酸；在硅烷化之后，以带有折射检测(refractometric detection)(有机酸和葡萄糖)和GC-MS的HPLC分析其它相关的代谢物。

[0244] 为了增强羟基甲硫氨酸的产生我们在氮受限的条件下进行了分批补料发酵。培养是如上所描述而以不同的分批补料培养基进行的，所述培养基称为F2、F3和F4，其含有提高的铵浓度(见表5中的成分)。

[0245] 对F2培养基，氮限制在大约15小时的培养时间发生，而对于F3培养基，限制发生在大约19小时的培养时间。对于F4分批补料溶液，细胞从未处于氮受限条件下。

[0246] 对于F2和F3培养基，最终残留铵浓度接近零，如通过在下面图1中所呈现的离子层析测量所确认的。

[0247] 表6中呈现的结果显示了由三种重组菌株所产生的羟基甲硫氨酸的水平，所述菌株经遗传修饰以产生甲硫氨酸和羟基甲硫氨酸(见表1中的基因型)。

[0248] 表6：将对于以不同分批补料溶液培养的菌株1、2和3的最终甲硫氨酸和羟基甲硫氨酸浓度以mM表示。括号中的数字表示培养的重复次数。

[0249]

[0250] 如可见，在培养期间氮限制发生得越早，羟基甲硫氨酸产量提高得越多。在分批补料培养基F2中培养的菌株1和3产生了多于10mM的羟基甲硫氨酸，而在F4中仅为1mM。

[0251] 参考文献

[0252] -Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA32:120-128.

[0253] -Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15,58-64.

[0254] -Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.(2000)“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645.

[0255] -Liebl等.,1989,Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205-210.

[0256] -Miller,1992;“A Short Course in Bacterial Genetics:A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York.

[0257] -Riedel等.2001,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3:573-583.

[0258] -J.A.Roels“Energetics and kinetics in biotechnology”,Elsevier Science&Technology(May1983).

[0259] -Sambrook等.1989.“Molecular Cloning:a Laboratory Manual”.2nd ed.Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,New York.

[0260] -Schaefer等.1999,Anal.Biochem.270:88-96.