耐碱嗜盐类型的灰绿曲霉菌株及其在环境治理中的应用

摘要

本发明属于微生物工程与技术领域，具体涉及一种耐碱嗜盐的曲霉菌株，该菌株已于2012年4月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为灰绿曲霉JL，保藏号码为CGMCC6025。该菌株具有在高盐碱环境降解秸秆等生物物质的特性，可用于盐碱地改良与环境污染处理。

权利要求

1.一种耐碱嗜盐类型的灰绿曲霉菌株，其特征在于该菌株保藏名称为灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)JL，保藏号码为CGMCC NO.6025。

2.一种如权利要求1所述耐碱嗜盐类型的灰绿曲霉菌株在盐碱地改造中的应用。

3.一种如权利要求1所述耐碱嗜盐类型的灰绿曲霉菌株在环境污染处理中降解秸秆的应用。

说明书

耐碱嗜盐类型的灰绿曲霉菌株及其在环境治理中的应用

技术领域：

[0001] 本发明属于微生物工程与技术领域。具体涉及一种具有耐碱嗜盐特性的灰绿曲霉菌株，及其在盐碱地改良与环境治理中的应用。背景技术：

[0002] 微生物是自然界生存环境极广的生物，无论原核或真核生物，无论环境条件怎样恶劣，地球上几乎无处不能找到它们的存在。嗜盐或（和）耐碱真菌是从高盐、高碱或高盐碱共存环境中分离的微生物资源，由于其具有重要研究、应用与开发价值历来备受关注。目前，随着嗜盐耐碱菌的微生物资源发掘，人们正开始将这些嗜盐耐碱菌应用于高盐碱环境中的各种危害消除和污染治理，如盐碱地的修复改造、淤泥污水的净化处理，以及农业废弃物循环利用等。

[0003] 长期以来，科学界普遍认为只有原核生物才可存活在极端环境，但自2000年，Gunde-Cimerman等（2000）从自然盐碱土中分离出真菌后，人们才开始把目标集中到在高盐环境中发掘新的耐盐真菌资源(Casamayor et al.2002;Petrovi et al.2002;Zalar et al.2005)。Debaryomyces hansenii,Hortaea werneckii和Wallemia ichthyophaga是从自然高盐环境中分离的耐盐真菌，研究发现它们生长的盐浓度上限高达5.2mol/L(Norkrans.1966;Prista et al.2005； etal.2008)。随着大量耐盐真菌的发掘，人们发现有些曲霉属（Aspergillus）真菌在其有性态（Eurotium）极具耐盐性，如Nevo等(2003)从死海及沿岸分离得到3种耐盐曲霉Aspergillus versicolor、Aspergillus niger和Eurotium herbariorum。后来，Butinar等(2005)也筛选到了系列的耐盐曲霉：Eurotium amstelodami、Eurotium repens、Eurotium herbariorum、Eurotium rubrum、Eurotium chevalieri和一个新种Eurotium halotolerans，其 中E.amstelodami和E.halotolerans可在含27.5%NaCl的培养基条件下生长。但遗憾的是，目前发现的耐碱真菌，特别是嗜盐耐碱的真菌换相对较少。在许多盐碱环境中，由于盐碱共存，这些单纯以嗜盐或耐盐为优势的真菌其应用范围无疑受到限制。

[0004] 土壤微生物及其分泌的酶类作为土壤的活性单位，能够直接参与并促进土壤惰性有机成分的生理生化反应，它们既是土壤生态系统中物质循环和能量转化的前提，也是土壤生态系统发育成熟度以及系统资源能否高效持续利用的重要标志。盐碱地特别是重度盐碱土壤中的微生物群落极其简单，而且处于非活化状态，尽管在秸秆还田过程中，加入一定的菌制剂可以加速秸秆的降解，增加了土壤中有机质含量，明显改善土壤理化性状，对维持农田良好的生态环境体系和作物营养体系，减少环境污染，增产优质等方面效果明显，但本研究团队发现这些菌剂在正常土壤中可以发挥很好的作用，而在盐碱土壤中，由于高浓度的盐和高pH值的环境，这些菌株很难发挥应有的作用。因此，筛选抗（耐）盐碱发酵微生物是决定盐碱地秸秆高效利用的关键所在。发明内容：

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种耐碱嗜盐类型的灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）菌株JL，保藏号码为CGMCC6025。

[0006] 本发明提供的耐碱嗜盐类型灰绿曲霉菌株于2012年4月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏名称为灰绿曲霉JL，分类命名为灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）；保藏编号为CGMCC NO.6025。

[0007] 本发明的耐碱嗜盐类型的灰绿曲霉菌株具有嗜盐特性：菌株适宜生长在Na盐环境，最适生长钠盐浓度为10-20%（克/升），高盐环境条件下菌株可以长期存活。

[0008] 本发明的耐碱嗜盐类型的灰绿曲霉菌株还同时具有耐碱特性：在碱性（pH=7-12）培养基条件下，菌株能够通过分泌柠檬酸、苹果酸等有机酸，调节pH值至适宜的生长中性条件。

[0009] 本发明的耐碱嗜盐类型的灰绿曲霉菌株在盐碱条件下通过分泌水解酶，高效降解有机物质。

[0010] 本发明同时提供了一种耐碱嗜盐类型的灰绿曲霉菌株可用于环境污染处理。

[0011] 本发明还同时提供了一种耐碱嗜盐类型的灰绿曲霉菌株可用于盐碱地改造。附图说明：

[0012] 图1、曲霉菌落形态特征

[0013] 图2、分生孢子梗及分生孢子

[0014] 图3、胞外纤维素酶和葡聚糖酶活性检测

[0015] 图4、碱性环境菌体分泌的有机酸GC-MS检测

[0016] 以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

具体实施方式

[0017] 实施例1、嗜盐耐碱菌株的分离与鉴定

[0018] 菌株的分离：分离菌株的土壤样品来自吉林省镇赉县。选取该地荒芜多年且高度盐碱化的地块，取土壤表层2cm以下土壤，装入已灭菌处理的玻璃瓶带回实验室备用。采用稀释涂布法，将稀释后澄清的土壤上清液涂布于添加NaCl至250.0g/L的PDA培养基上（pH=10）培养4天，经过3轮筛选分离到一株嗜盐耐碱的真菌菌株（本发明的耐碱嗜盐类型的灰绿曲霉菌株编号为CGMCC6025）。

[0019] 菌株形态鉴定：将筛选得到的嗜盐耐碱菌株接种到查氏琼脂培养基上，25℃培养一周，观察菌落形态并镜检其产孢结构和菌丝形态。25℃在查氏琼脂平板上培养1周后，菌体发育成墨绿色或灰绿色菌落，圆形菌落半径约3.5-4cm，气生菌丝发达，中心平展，边缘扩展菌丝白色，生长速度较快，老熟菌体颜色变深，期间，部分特异化为分生孢子梗，集结成肉眼可见的黄色颗粒，不均匀分布在菌落表层（图1）；用挑针取菌落表层菌丝，制成玻片，进行显微观察：菌丝直立，表面光滑，分生孢子球形单胞，着生在产孢梗顶部，极易脱落，脱落后，产孢梗顶部呈半球形光秃（图2）。经形态学鉴定为灰绿曲霉。

[0020] 实施例2、菌株灰绿曲霉JL嗜盐、耐盐性及最适盐浓度鉴定

[0021] 配制梯度NaCl含量的PDA培养基(pH7.0)，其盐浓度（质量分数）由1%增加到31%（饱和浓度），每级增加2%，以不添加NaCl的PDA为对照。将等量的菌株接种于培养基中心位置，25℃,培养1周。结果发现，菌株在不含NaCl的培养基上没有生长（生长极为缓慢），1-5%浓度下生长相对较缓慢；5%-19%浓度下菌株生长加快，但在9-19%范围内增速变缓，菌落大小接近；21-27%浓度下菌株生长急剧变慢，29-31%浓度下菌体几乎没有生长，因此，该菌株属于嗜盐、且抗高盐特性的真菌。

[0022] 为了确定菌株生长的最适盐浓度，用上述系列盐梯度PD（马铃薯液体培养基，不加琼脂）（pH=7.0）培养菌株，25℃摇培一周后，离心收集菌丝，用去离子水反复冲洗4次，105℃下烘干，测定菌丝干重，比较发现菌株在9-15%浓度下的干重最大，其最适生长的盐浓度为9-15%。

[0023] 实施例3、菌株灰绿曲霉JL生长pH测定

[0024] 配制pH1.0-13.0的酸碱梯度PDA培养基，添加NaCl至终浓度（质量分数）9%，接菌，25℃培养1周后记录菌株的生长情况。研究发现，菌株在pH3-11都可生长，但以pH5-9范围生长较快，pH10-12可以生长，但生长速度明显变慢，因此，该菌株属于耐盐真菌。

[0025] 为了确定该菌株生长的最适pH范围，利用上述pH梯度进一步用PD液体培养基培养，25℃摇培1周后，离心收集菌丝，用去离子水反复冲洗4次，105℃下烘干，比较菌丝干重。菌株在pH6-8范围内，菌体干重最大，因此，该菌株的最适pH范围为6-8。

[0026] 实施例4、菌株胞外水解酶的分析域鉴定

[0027] 配制以5%粉碎的秸秆（水稻、玉米或高粱）为主要碳源、以80%苏打盐碱土壤（取自吉林省镇赉县）为基质、以10%粉煤灰（粗细比=1:5）为分散透气介质的固态培养基，以5%PD培养基为菌体扩繁营养的混合物，灭菌处理后调节pH值至7.0，接种曲霉菌株，在简易发酵系统中25℃发酵3-4周。观察秸秆发酵效果，与未加该菌株的秸秆相比，菌株灰绿曲霉JL明显加快了秸秆的降解。然后用无菌水浸润发酵物2小时，离心保留上清，即为菌株胞外酶溶液，并用90%（饱和浓度）硫酸铵沉淀上清液中蛋白，装入透析袋透析过夜，用聚乙二醇浓缩，最后用DNS法测定纤维素酶、葡聚糖酶等酶活性。结果表明，灰绿曲霉JL发酵液显著降解纤维素和葡聚糖（图3），因此，该菌株可以用于环境中秸秆的降解，从而对环境污染进行处理。

[0028] 实施例5、菌株耐碱过程分泌的主要有机酸

[0029] 配制pH12.0的酸碱梯度PDA培养基，添加NaCl至终浓度（质量分数）9%，接菌，25℃培养30天后进行抽滤将菌体和发酵液分开。将菌体烘干，粉碎后用甲醇提取，提取液用旋转蒸发仪40℃蒸干，蒸干后与各自的发酵液合并，再用石油醚，乙酸乙酯分别萃取，将发酵液中的物质按照极性不同分为石油醚萃取部分、乙酸乙酯萃取部分和萃取后的发酵液部分。用GC-MS进行鉴别对其差异物质进行结构鉴定，鉴定结果表明，灰绿曲霉JL能够分泌苹果酸（见图4），因此，该菌株可以用于中和盐碱地中的碱，从而对盐碱地进行改造。