一种通过发酵乳杆菌生产虾青素的方法

摘要

本发明涉及化合物制备技术领域，具体公开了一种通过发酵乳杆菌生产虾青素的方法。所述方法为通过在发酵培养基中添加α-蒎烯及维生素B12就可以有效地诱导原来不产虾青素的乳杆菌大量生产虾青素，其生产虾青素产量和生物量分别高达约600mg/L和26g/L。本发明所述方法是一个生物合成法生产天然虾青素的新途径，其卓越的生产性能使其有望成为一种替代红法夫酵母及雨生红球藻生产虾青素的虾青素制造方法。

权利要求

1.一种生产虾青素的方法，其特征在于，将乳杆菌种子液接种在含有α-蒎烯及维生素B12的产虾青素的培养基中，发酵得菌体，菌体破碎后经萃取即得虾青素；

所述产虾青素的培养基是以察氏培养基为基础经改良而成的，培养基含有40～120g/L碳源和1.5～5g/L的氮源；所述碳源为蔗糖、葡萄糖、糖蜜、果糖或麦芽糖中的一种或一种以上，所述氮源为硫酸铵、尿素、蛋白胨、酵母膏或豆饼粉中的一种或一种以上。

2.根据权利要1所述生产虾青素的方法，其特征在于，所述α-蒎烯在产虾青素的培养基中的加入量为100～500 μL/L，维生素B12在产虾青素的培养基中的加入量为0.1～

5μg/L。

3.根据权利要求2所述生产虾青素的方法，其特征在于，所述α-蒎烯在产虾青素的培养基中的加入量为350 μL/L，维生素B12在产虾青素的培养基中的加入量为0.9μg/L。

4.根据权利要求1所述生产虾青素的方法，其特征在于，所述产虾青素的培养基含有

60g/L碳源和4.5g/L的氮源。

5.根据权利要求1或4所述生产虾青素的方法，其特征在于，所述碳源为蔗糖，所述氮源为硫酸铵。

6.根据权利要求1所述生产虾青素的方法，其特征在于，所述发酵的条件为：将乳杆菌种子液按5～10%（v/v）接种量接种在培养基中，pH值为6～8，26～30℃，120～200 r/min摇床培养48～72小时。

7.根据权利要求1所述生产虾青素的方法，其特征在于，所述发酵的条件为：将乳杆菌按6%（v/v）接种量接种在培养基中，pH值为7.5，28℃，180 r/min摇床培养48～72小时。

8.根据权利要求1所述生产虾青素的方法，其特征在于，所述乳杆菌为植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌或布氏乳杆菌。

说明书

一种通过发酵乳杆菌生产虾青素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及化合物制备技术领域，具体地涉及一种通过发酵乳杆菌生产虾青素的方法。

背景技术

[0002] 虾青素（3,3’-二羟基-4,4’-二酮基－ββ’-胡萝卜素）是一种非维生素A源的酮式类胡萝卜素。拥有艳丽的红色及极强的色素沉积能力，最初在欧美一些发达国家是作为色素被用做水产业的饵料添加剂。虾青素具有很强的抗氧化性，动物实验表明它有抑制肿瘤发生，增强免疫功能等多方面的生理作用，作为功能性色素在水产业，医药，食品，化妆品等行此有着广阔的应用前景。

[0003] 目前市场上虾青素大部分通过化学合成，也有少量天然虾青素。化学合成虾青素主要用途是作为鱼类饲料添加剂，其工业化生产由瑞士罗氏公司，即现在的帝斯曼公司控制，商品名为加丽素粉红（Carophyllpink），虾青素含量为5-10%，目前为止美国食品卫生管理局(FDA)不准任何化学合成新产品进入保健食品市场。

[0004] 天然虾青素存在于动植物及微生物中，尽管提取来源广泛，但含量极低。如在虾、蟹的废壳中的含量只有约80ug/g，法夫酵母(Phaffia thodozyma)中含量一般在1500～5000ug/g之间，在淡水单细胞绿藻一雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中，虾青素的含量可达10000～40000ug/g，曾经被认为是自然界中天然虾青素含量最高的生物。天然虾青素的工业化生产，目前也主要是采用法夫酵母发酵和雨生红球藻的大规模养殖来进行的，例如美国红星公司(3000～4000g/t干酵母)及Igene Biotechnology Inc、日本富士化学、美国Cyanotech公司、以色列Algatech公司等，由于生产成本及技术难度高，天然虾青素的产量有限，国际市场上的价格很高，这也一定程度上制约了天然虾青素的应用。

[0005] 能够产生虾青素的微生物菌株并不多。除雨生红球藻和红发夫酵母生产虾青素外，一些文献也已报道其他微生物菌株。但有些菌生长较慢且虾青素含量低，无工业应用前景。微生物细胞内虾青素的生物合成基本上由它们的遗传特性所控制，通过诱变育种技术，改变微生物的遗传特征，可得到高产虾青素的微生物菌株，Girard等对红发夫酵母(Phaffia thodozyma)进行诱变处理，发现从无色到红色的诱变突变菌株。分析突变菌株的虾青素合成中间产物，可以发现，番茄红素环化形成β-胡萝卜素这一步骤不会受到诱变处理的影响，但诱变处理能影响到其他的步骤，即诱变处理主要影响β一胡萝卜素合成之前的步骤。同时，微生物胞内虾青素的积累也受各种环境因子的影响，会随发酵培养基的改变而改变。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是针对现有技术中发酵菌株生产虾青素受菌株资源限制的缺陷，提供一种通过发酵乳杆菌生产虾青素的方法。

[0007] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

[0008] 一种生产虾青素的方法，将乳杆菌种子液接种在含有α-蒎烯及维生素B12产虾青素的培养基中，发酵得菌体，菌体破碎后经萃取即得虾青素。只要在产虾青素的培养基中加入α-蒎烯及维生素B12就可以诱导原来不产虾青素的乳杆菌大量生产虾青素。α-蒎烯及维生素B12具体在产虾青素的培养基中的加入量可以根据乳杆菌的种类和代谢需要就行优化得到。

[0009] 优选地，所述α-蒎烯在产虾青素的培养基中的加入量为100～500 µL/L，维生素B12在产虾青素的培养基中的加入量为0.1～5µg/L。

[0010] 更优选地，所述α-蒎烯在产虾青素的培养基中的加入量为350 µL/L，维生素B12在产虾青素的培养基中的加入量为0.9µg/L。

[0011] 现有技术中，乳杆菌在普通的发酵培养基中是不能代谢生产虾青素，本发明通过在发酵培养基中加入α-蒎烯及维生素B12，就可以有效地诱导乳杆菌大量生产虾青素。

[0012] 乳杆菌产虾青素除了受α-蒎烯及维生素B12的绝对诱导之外，各种环境因子也会稍微影晌乳杆菌产虾青素的产量，但是不会决定乳杆菌产不产虾青素。例如乳杆菌产虾青素的产量会受培养基碳源、氮源种类、发酵温度、pH和溶氧等因素的影响。

[0013] 在发酵培养中，所述培养基包括碳源、氮源及无机盐等，碳源是构成微生物的主要成分，是细胞内贮藏物质和生成各种代谢物来源，同时也是微生物生长中的主要能量来源。优选地，所述产虾青素的培养基是以察氏培养基为基础经改良而成的，其中所述碳源为蔗糖、葡萄糖、糖蜜、果糖或麦芽糖中的一种或一种以上，优选为蔗糖，碳源的质量浓度40～
120g/L，更优选为60g/L，所述氮源为硫酸铵、尿素、蛋白胨、酵母膏或豆饼粉；优选为硫酸铵，氮源的质量浓度1.5～5g/L，更优选为4.5g/L。

[0014] 本发明通过优化实验发现乳杆菌在含有α-蒎烯及维生素B12的产虾青素的培养基中接种量为5～10%（v/v），随着接种量的增加，生物量及虾青素含量均呈上升趋势，但当接种量大于10%（v/v）时，两者增加不太明显，优选接种量在6%（v/v）左右。

[0015] 反应温度对发酵过程中产生的生物量及虾青素影响，随着发酵温度的上升，细胞生物量及虾青素产量都不断的增加，温度30℃后两者均有下降，通常采用反应温度26～30℃，优选28℃。

[0016] 由于乳杆菌是好氧微生物，可以通过摇床转速和装液量来调节种子培养液及发酵培养液中的溶氧量，摇床转速一般为50～250r/min，随着转速提高，生物量和虾青素合成量都呈上升趋势，当摇床转速为150 r/min以上上升趋向平稳，优选取150～200 r/min，更优选为180 r/min。对于发酵罐进行间歇发酵中，发酵罐罐压和搅拌速率以及空气通气量等决定溶氧量，溶氧量越高，色素合成量越大，低溶氧条件下，色素合成减少，通常采用40～60%的相对溶氧量。

[0017] 培养基中的H－和OH－能对微生物代谢产生影响，它作用于胞外的可解离的弱酸，形成易透过细胞膜的游离态进入胞内再作用于参与代谢的各种酶类，从而影响菌体的生长合产物合成，通常采用起始pH值为6～8，优选起始pH为7.5。

[0018] 本发明所述的乳杆菌为普通市售乳杆菌，本发明具体实施方案中所用的乳杆菌为植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌等，但不会对本发明做任何形式的限定。只要是乳杆菌属的菌株都可以应用于本发明来生产虾青素。

[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下先进性：

[0020] 1、现有技术中，乳杆菌是无法通过发酵来生产虾青素，本发明通过在发酵培养基中加入α-蒎烯及维生素B12，就可以有效地诱导乳杆菌大量生产虾青素。虾青素产量和生物量分别高达约600mg/L和26 g/L，是一个生物合成法生产天然虾青素的新途径，其卓越的生产性能使其有望成为一种替代红法夫酵母及雨生红球藻生产虾青素的虾青素制造方法。

[0021] 2、本技术所采用的乳杆菌动物安全性好，既具备雨生红球藻虾青素高含量，又具备红发夫酵母易于培养的特点，且培养条件温和，易于控制，虾青素提取分离时，只需二甲基亚砜一步破碎即可。

[0022] 3、本发明提供的由乳杆菌产虾青素一红色色素在一般理化环境作用下（避免光照）有着良好的稳定性，及较高的抗氧化特性，可用作高档化妆品、高级食品和饲料添加剂。

[0023] 说明书附图

[0024] 图1. 虾青素标准品高效液相色谱图。

[0025] 图2. 乳杆菌色素高效液相色谱图。

具体实施方式

[0026] 下面结合说明书附图具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。

[0027] 实施例中所使用到的植物乳杆菌ATCC8014、戊糖乳杆菌ATCC8041及干酪乳杆菌ATCC334购自美国菌种保藏中心、植物乳杆菌GIM1.140、短乳杆菌GIM1.288购自广东省微生物菌种保藏中心；布氏乳杆菌AS1.13购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

[0028] 实施例1

[0029] S1.植物乳杆菌ATCC8014发酵培养：将植物乳杆菌ATCC8014的菌体挑起菌苔一环接种于装有12.5mL种子培养基的250mL三角瓶中，30℃、180r/min条件摇床培养24h得种子液，以此种子液5mL接种于装有45mL种子液的500mL三角瓶中，30℃、180r/min条件摇床培养18h得二级种子液，再以6 %（v/v）接种量接种到发酵罐中（10L罐装有7L产虾青素发酵培养基）于30℃条件下培养，采用恒pH，保持相对溶氧量40～60%，得细胞干重26 g/L虾青素产量598mg/L。

[0030] 所述产虾青素发酵培养基含有的60g/L蔗糖、10g/L糖蜜、5g/L硫酸铵和350µL/Lα-蒎烯，0.9μg/L维生素B12。，培养基 pH为7.0。

[0031] S2.色素粗品的制备与纯化：

[0032] 取上述制备得到酵母菌体粉末，加入二甲基亚砜（每克菌粉加入8ml二甲基亚砜）置于60℃水浴条件下破壁60min，加入等体积丙酮提取至菌体呈白色，离心(4000r/min，20min)取上清液，石油醚萃取，37℃避光减压蒸馏浓缩得色素粗制品，-20℃避光保存。

[0033] 取色素固体粗制品溶于二氯甲烷，加入40g/L的KOH-乙醇溶液，于15℃皂化15min，加入蒸馏水使混合液分相，低温静置后收集二氯甲烷相，浓缩干燥。经皂化后的提取物用石油醚溶解，上自装聚酰胺（100-200目）层析柱进行梯度洗脱纯化。石油醚、石油醚：
乙酸乙酯（1:0；4:1；2:1；1:1）、二氯甲烷共分6个梯度洗脱，收集紫红色组分样品，37℃水浴下真空减压浓缩蒸干。

[0034] 色素成分的薄层层析及高压液相色谱分析（见图1和图2），色素样品主要成分为虾青素，虾青素占总色素含量为47.35%。

[0035] 实施例2

[0036] S1.植物乳杆菌ATCC8014发酵培养：将植物乳杆菌ATCC8014的菌体挑起菌苔一环接种于装有12.5mL种子培养基的250mL三角瓶中，30℃、180r/min条件摇床培养24h得种子液，以此种子液5mL接种于装有45mL种子液的500mL三角瓶中，30℃、180r/min条件摇床培养18h得二级种子液，再以8 %（v/v）接种量接种到发酵罐中（10L罐装有7L产虾青素发酵培养基）于28℃条件下培养，采用恒pH，保持相对溶氧量40～60%，得细胞干重28 g/L虾青素产量456mg/L。

[0037] 所述产虾青素发酵培养基含有的60g/L蔗糖、10g/L糖蜜、5g/L硫酸铵和150µL/Lα-蒎烯，0.2μg/L维生素B12，培养基 pH为7.0。

[0038] S2.色素粗品的制备与纯化：同实施例1。

[0039] 色素成分的薄层层析及高压液相色谱分析，色素样品主要成分为虾青素，虾青素占总色素含量为46.44%。

[0040] 实施例3

[0041] S1.植物乳杆菌ATCC8014发酵培养：将植物乳杆菌ATCC8014的菌体挑起菌苔一环接种于装有12.5mL种子培养基的250mL三角瓶中，30℃、180r/min条件摇床培养24h得种子液，以此种子液5mL接种于装有45mL种子液的500mL三角瓶中，30℃、180r/min条件摇床培养18h得二级种子液，再以10 %（v/v）接种量接种到发酵罐中（10L罐装有7L产虾青素发酵培养基）于26℃条件下培养，采用恒pH，保持相对溶氧量40～60%，得细胞干重19 g/L虾青素产量513mg/L。

[0042] 所述产虾青素发酵培养基含有的120蔗糖、4.5g/L尿素和500µL/Lα-蒎烯，0.8µg/L维生素B12，培养基 pH为6。

[0043] S2.色素粗品的制备与纯化：同实施例1。

[0044] 色素成分的薄层层析及高压液相色谱分析，色素样品主要成分为虾青素，虾青素占总色素含量为50.02%。

[0045] 实施例4

[0046] S1.植物乳杆菌ATCC8014发酵培养：将植物乳杆菌ATCC8014的菌体挑起菌苔一环接种于装有12.5mL种子培养基的250mL三角瓶中，30℃、180r/min条件摇床培养24h得种子液，以此种子液5mL接种于装有45mL种子液的500mL三角瓶中，30℃、180r/min条件摇床培养18h得二级种子液，再以5 %（v/v）接种量接种到发酵罐中（10L罐装有7L产虾青素发酵培养基）于28℃条件下培养，采用恒pH，保持相对溶氧量40～60%，得细胞干重21 g/L虾青素产量542mg/L。

[0047] 所述产虾青素发酵培养基含有的50g/L蔗糖、2g/L硫酸铵和300µL/Lα-蒎烯，2.0μg/L维生素B12，培养基 pH为8.0。

[0048] S2.色素粗品的制备与纯化：同实施例1。

[0049] 色素成分的薄层层析及高压液相色谱分析，色素样品主要成分为虾青素，虾青素占总色素含量为45.68%。

[0050] 实施例5

[0051] S1.植物乳杆菌GIM1.140发酵培养：将植物乳杆菌ATCC8014的菌体挑起菌苔一环接种于装有12.5mL种子培养基的250mL三角瓶中，30℃、180r/min条件摇床培养24h得种子液，以此种子液5mL接种于装有45mL种子液的500mL三角瓶中，30℃、180r/min条件摇床培养18h得二级种子液，再以6 %（v/v）接种量接种到发酵罐中（10L罐装有7L产虾青素发酵培养基）于28℃条件下培养，采用恒pH，保持相对溶氧量40～60%，得细胞干重23 g/L虾青素产量527mg/L。

[0052] 所述产虾青素发酵培养基含有的60g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、3g/L蛋白胨和350µL/Lα-蒎烯，0.9μg/L维生素B12，培养基 pH为7.0。

[0053] S2.色素粗品的制备与纯化：同实施例1。

[0054] 色素成分的薄层层析及高压液相色谱分析，色素样品主要成分为虾青素，虾青素占总色素含量为42.19%。

[0055] 实施例6

[0056] S1.植物乳杆菌ATCC8014发酵培养：将植物乳杆菌ATCC8014的菌体挑起菌苔一环接种于装有12.5mL种子培养基的250mL三角瓶中，30℃、180r/min条件摇床培养24h得种子液，以此种子液5mL接种于装有45mL种子液的500mL三角瓶中，30℃、180r/min条件摇床培养18h得二级种子液，再以6 %（v/v）接种量接种到发酵罐中（10L罐装有7L产虾青素发酵培养基）于30℃条件下培养，采用恒pH，保持相对溶氧量40～60%，得细胞干重28 g/L，虾青素产量0 mg/L。

[0057] 所述产虾青素发酵培养基含有的60g/L蔗糖、10g/L糖蜜、5g/L硫酸铵，培养基 pH为7.0。

[0058] S2.色素粗品的制备与纯化：同实施例1。

[0059] 实施例7

[0060] S1.戊糖乳杆菌ATCC8041发酵培养：同实施例1；

[0061] S2.色素粗品的制备与纯化：同实施例1。

[0062] 通过本方法得细胞干重21g/L虾青素产量495mg/L。色素成分的薄层层析及高压液相色谱分析：色素样品主要成分为虾青素，虾青素占总色素含量为52.32%。

[0063] 实施例8

[0064] S1.干酪乳杆菌ATCC334发酵培养：同实施例1；

[0065] S2.色素粗品的制备与纯化：同实施例1。

[0066] 通过本方法得细胞干重8g/L虾青素产量25mg/L。色素成分的薄层层析及高压液相色谱分析：色素样品主要成分为虾青素，虾青素占总色素含量为37.15%。

[0067] 实施例9

[0068] S1.短乳杆菌GIM1.288发酵培养：同实施例1；

[0069] S2.色素粗品的制备与纯化：同实施例1。

[0070] 通过本方法得细胞干重13g/L虾青素产量176mg/L。色素成分的薄层层析及高压液相色谱分析：色素样品主要成分为虾青素，虾青素占总色素含量为40.25%。

[0071] 实施例10

[0072] S1. 布氏乳杆菌AS1.13发酵培养：同实施例1；

[0073] S2.色素粗品的制备与纯化：同实施例1。

[0074] 通过本方法得细胞干重10 g/L虾青素产量97mg/L。色素成分的薄层层析及高压液相色谱分析：色素样品主要成分为虾青素，虾青素占总色素含量为27.88%。