用于检测李痘病毒的引物、试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了用于检测李痘病毒的引物、试剂盒及检测方法，引物包括：正向外引物F3：5'-GATGATGGATGGGGAAACA-3'；反向外引物B3：5'-AGGCTGTAGTCTGTCAGG-3'；正向内引物FIP：5'-GCCATAATTTGTCTAAAAGTGGGTT-CAAGTGGAGTATCCAATAAAGC-3'；反向内引物BIP：5'-ACATTTCAGTAACGTGGCTGAA-GCTGAATCCCATACCTTGG-3'。试剂盒及检测方法包含上述引物。利用该引物及检测方法检测李痘病毒快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高。

权利要求

1.一种李痘病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

A、采用纳米磁珠提取待测样品的RNA；

通过以下工艺制作免疫纳米磁珠：

①纳米磁珠的制备

分别取5.2g FeCl3·6H2O、2.7g FeSO4·7H2O、0.85mL 12.1moL/L的浓盐酸溶解于200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液；在80℃下搅拌，反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液；取25mLFe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min；滴加0.4mL APTES，室温下搅拌7h；

反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe3O4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液；

②免疫磁珠的制备

取0.5mL氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液，用1mL PBS清洗3次，磁分离器弃上清液；加入5％(V/V)戊二醛溶液2mL，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液；用PBS洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5mL病毒抗体包被氨基化Fe3O4纳米粒子，室温下振荡固定2h；

磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，再用PBS定容，4℃冰箱保存备用，得到免疫磁珠；

具体提取方法：

a、制样：取0.1g的带毒组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；

b、清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；

c、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；

d、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；

e、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；

f取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为待测样品RNA；

B、在冰上，按以下比例取反应液缓冲液、引物、荧光染料、酶溶液、阳性对照、去离子水放入灭菌管中配制预混液；其中预混液一次反应量合计20μL，其中包括12.5μL反应缓冲液，1μL酶溶液，4μL引物，1μL荧光染料，1.5μL去离子水；其中引物中包括有正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP和反向内引物BIP；

其中正向外引物F3序列为：5'-GATGATGGATGGGGAAACA-3'；

反向外引物B3序列为：5'-AGGCTGTAGTCTGTCAGG-3'；

其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2，正向内引物FIP序列为：5'-GCCATAATTTGTCTAAAAGTGGGTT-CAAGTGGAGTATCCAATAAAGC-3'；

其中F1c序列为：5'-GCCATAATTTGTCTAAAAGTGGGTT-3'；

F2序列为：5'-CAAGTGGAGTATCCAATAAAGC-3'；

所述反向内引物BIP包括含B1c和B2，反向内引物BIP序列为：

5'-ACATTTCAGTAACGTGGCTGAA-GCTGAATCCCATACCTTGG-3'；

其中B1c序列为：5'-ACATTTCAGTAACGTGGCTGAA-3'；

B2序列为:5'-GCTGAATCCCATACCTTGG-3'；

C、将适量待测样品的RNA加入步骤B中的灭菌管中；具体步骤：往分装好的试管中分别加入制备好的待检测样品的RNA 5μL，使总量达到25μL，阴性对照反应使用去离子水

5μL作为样品，阳性对照反应使用带有该李痘病毒核酸的阳性对照，然后盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在试管底部；

D、将步骤C中的试管放置在恒温器中，在63℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；

E、使用紫外线照射装置从试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查，如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性；所述紫外线照射装置的波长为240-260nm，350-370nm。

说明书

用于检测李痘病毒的引物、试剂盒及检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于检测李痘病毒的引物、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 李痘病毒(Plum pox virus,PPV)是核果类果树危险性最大的病毒之一，果树一旦受其侵染，则会造成未成熟果实大量脱落，使产量严重降低，并且使果实品质大幅度下降，而且该病毒传播速度快，在短时间内即可能给整个国家的果树业发展带来灾难性损失。该病毒1915年在保加利亚首次被发现，而后迅速传遍欧洲大多数国家以及地中海、中非、印度和智利，目前美国和加拿大也有其发生的报道。由于该病毒危害性及其严重，因此它已被欧洲植保组织列入了A2类检疫性病原物，其它国家也对其表现出极高度的重视，纷纷加大对其研究的力度并制定了一系列严格的检测和根除措施，防范于未然。目前中国暂未有发现有关该病毒的正式报道，由于目前我国同其他国家种质资源交流越来越频繁，为了防止该病毒随着苗木等繁殖材料的引进而进入我国，以保护我国农业的健康和可持续发展，必须加强对该病毒的检验检疫！

[0003] 目前，我国出入境植物病毒检测所采用的主要技术方法是酶联免疫吸附（ELISA）检测和反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测。传统的ELISA技术在实际应用过程中存在检测灵敏度低，检测耗时长，容易出现假阳性结果；RT-PCR技术虽然灵敏度高，但是存在RNA抽提繁琐并且容易降解，PCR反应容易受寄主中多酚、多糖物质的干扰，难以实现植物病毒病害样品的快速、简便、高效检测。因此，建立新的快速、简捷、灵敏的检验检疫技术手段已经迫在眉睫。

[0004] 植物病毒病的诊断和病原鉴定，是认识病毒病害、防治病毒病的基础，也是植物病毒分类学研究的一个重要内容，植物病毒检测的基本内容包括病毒的生物学特性、形态学特征、理化特性、基因组结构、抗原特性等几个方面，涉及到生物学测定、血清学测定、生理生化测定、电镜技术、分子生物学技术等多种手段。目前，我国出入境植物检疫所采用的检测技术的主要手段主要是：口岸现场检疫、生长季隔离检疫、指示植物检验、血清学检验、分子生物学检验。这些手段存在的主要问题为：1：检测周期长，不符合国务院提出的“加快通关速度”的精神；2：容易出现假阳性反应；3：检测方法繁琐复杂，不利于基层单位实际应用；4：主要检测试剂或产品来源于国外公司，不仅购买价格高，而且定购时间长，这些都不能适应我国经济快速发展的需要。因此，建立新的快速有效的检验检疫技术手段已经迫在眉睫。

[0005] 目前对病毒的主要技术检测方法是酶联免疫吸附（ELISA）检测和反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测。ELISA可以定性、定量测定样品中的病毒，是实现目前鉴定病毒的最好手段之一。但是，血清学反应的必须具备高效的抗血清，另外血清学检测对一些病毒含量低和含有干扰测定物质的样品则不能做出准确的测定，容易出现假阳性的结果，并且存在检测时间长的问题，不能满足目前口岸快速检测的要求；RT-PCR技术是应用最广泛的分子生物学新技术之一，利用RT-PCR技术对病毒的检测相比ELISA检测具有灵敏度高的特点，可检测的最低病毒含量达到fg水平。目前在RT-PCR技术基础上不断衍生出许多新的技术，例如实时荧光RT-PCR技术，基因芯片技术等，使其应用范围不断扩大，特异性和敏感性也不断提高，但是这些分子生物学技术存在RNA抽提繁琐并且容易降解，PCR反应容易受寄主中多酚、多糖物质的干扰，限制了植物病毒病害样品的快速、简便、高效检测。

[0006] 纳米生物技术是运用纳米技术的理论与方法，在传统生物学和现代分子生物技术的基础上，开展生物学研究。纳米磁珠在生物样品的分离分析中有着重要应用价值：（1）高效富集：纳米磁珠比表面积大，显著增加反应界面能够高效富集生物样品；（2）可操纵性：纳米磁珠具有超顺磁效应，外加磁场能够快速对其进行移动和分离;（3）标记性质：生物分子标记方法简单、可靠；（4）人体安全：对人体无毒、可生物代谢、可生物降解、生物相容性好。总之，磁性生物分离兼具磁性载体的超顺磁性和亲和配基的生物特异性特点，集磁性分离的快速简便和亲和分离的高选择性双重优势于一体，在核酸的分离纯化，RNA、DNA分子的富集，蛋白的纯化，病毒、细胞的分离等方面有应用。

[0007] 关于纳米磁珠（magnetic nano particles，MNP）的合成，国外在80年代末开始超顺磁性氧化铁超微颗粒的研究，基于纳米磁珠的生物分离材料国外已经有市场化产品，最近纳米磁珠在动物病毒检测得到应用，抗体标记的纳米磁珠从液相中捕获目标病毒，可以高灵敏度地检测动物病毒。

[0008] 而环介导核酸等温扩增即Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）技术是最近几年才发展起来的病毒检测新方法，为快速基因检测提供了一种新的技术途径，已具有成功应用的现实性，在食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断，以及水产养殖等领域的应用及研究已有文献报道。它不需要昂贵的检测设备，只需要一台温箱即可，而且其检测灵敏度比普通PCR检测方法还要高，而且检测时间不超过一小时，结果直接目测即可，特别适合口岸一线检测。

[0009] 环媒等温核酸扩增反应利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶使得链置换DNA合成在不停地自我循环，LAMP扩增分两个阶段。

[0010] 第1阶段为起始结构形成：任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3'末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。

[0011] 第2阶段是反应扩增循环：以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

[0012] 环媒等温核酸扩增反应，是分子生物学领域中的一个新概念，它可以在等温9
(60℃～65℃)条件下，30min～60min内将只有几个拷贝的靶核酸扩增到10 水平。该方法的一大特色是，可以通过反应副产物——白色焦磷酸镁沉淀的产生与否判断靶基因的存在。由于环媒等温核酸扩增的扩增过程依赖识别靶序列六个独立区域，所以对于微生物的鉴定具有高效率、高特异性、高敏感性等特点。此外，环媒等温核酸扩增的核酸扩增过程是在等温条件下进行，普通水浴锅或有稳定热源的设备就能满足反应要求，使检测成本大大降低，而PCR则需要昂贵的PCR仪进行一定温度程序的核酸扩增，因而，环媒等温核酸扩增比PCR对仪器设备要求低、检测成本也较低，更具推广性，可望作为常规检测工具。

发明内容

[0013] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测李痘病毒的引物以及包含该引物的试剂盒及检测方法，利用该引物及检测方法检测李痘病毒快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高。

[0014] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

[0015] 一种用于检测李痘病毒的引物，其特征在于：

[0016] 正向外引物F3：5'-GATGATGGATGGGGAAACA-3'；

[0017] 反向外引物B3：5'-AGGCTGTAGTCTGTCAGG-3'；

[0018] 正向内引物FIP和反向内引物BIP；

[0019] 其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：

[0020] 5'-GCCATAATTTGTCTAAAAGTGGGTT-CAAGTGGAGTATCCAATAAAGC-3'；

[0021] 其中F1c：5'-GCCATAATTTGTCTAAAAGTGGGTT-3'；

[0022] F2：5'-CAAGTGGAGTATCCAATAAAGC-3'；

[0023] 所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：

[0024] 5'-ACATTTCAGTAACGTGGCTGAA-GCTGAATCCCATACCTTGG-3'；

[0025] 其中B1c：5'-ACATTTCAGTAACGTGGCTGAA-3'；

[0026] B2:5'-GCTGAATCCCATACCTTGG-3'。

[0027] 一种检测李痘病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：

[0028]

[0029]

[0030] 所述的引物包括：

[0031] 正向外引物F3：5'-GATGATGGATGGGGAAACA-3'；

[0032] 反向外引物B3：5'-AGGCTGTAGTCTGTCAGG-3'；

[0033] 正向内引物FIP和反向内引物BIP；

[0034] 其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：

[0035] 5'-GCCATAATTTGTCTAAAAGTGGGTT-CAAGTGGAGTATCCAATAAAGC-3'；

[0036] 其中F1c：5'-GCCATAATTTGTCTAAAAGTGGGTT-3'；

[0037] F2：5'-CAAGTGGAGTATCCAATAAAGC-3'；

[0038] 所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：

[0039] 5'-ACATTTCAGTAACGTGGCTGAA-GCTGAATCCCATACCTTGG-3'；

[0040] 其中B1c：5'-ACATTTCAGTAACGTGGCTGAA-3'；

[0041] B2:5'-GCTGAATCCCATACCTTGG-3'。

[0042] 如上所述的一种检测李痘病毒的试剂盒，其特征在于所述的反应液缓冲液2X由以下组分组成：

[0043]

[0044]

[0045] 如上所述的一种检测李痘病毒的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。

[0046] 如上所述的一种检测李痘病毒的试剂盒，其特征在于所述的荧光染料含有钙黄绿素。

[0047] 一种李痘病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

[0048] A、采用纳米磁珠提取待测样品的RNA；

[0049] B、在冰上，按比例取反应液缓冲液、引物、荧光染料、酶溶液、阳性对照、去离子水放入灭菌管中配制预混液；

[0050] C、将适量待测样品的RNA加入步骤B中的灭菌管中；

[0051] D、将步骤C中的试管放置在恒温器中，在63℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；

[0052] E、使用紫外线照射装置从试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查，如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性；

[0053] 其中所述的引物包括：

[0054] 正向外引物F3：5'-GATGATGGATGGGGAAACA-3'；

[0055] 反向外引物B3：5'-AGGCTGTAGTCTGTCAGG-3'；

[0056] 正向内引物FIP和反向内引物BIP；

[0057] 其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：

[0058] 5'-GCCATAATTTGTCTAAAAGTGGGTT-CAAGTGGAGTATCCAATAAAGC-3'；

[0059] 其中F1c：5'-GCCATAATTTGTCTAAAAGTGGGTT-3'；

[0060] F2：5'-CAAGTGGAGTATCCAATAAAGC-3'；

[0061] 所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：

[0062] 5'-ACATTTCAGTAACGTGGCTGAA-GCTGAATCCCATACCTTGG-3'；

[0063] 其中B1c：5'-ACATTTCAGTAACGTGGCTGAA-3'；

[0064] B2:5'-GCTGAATCCCATACCTTGG-3'。

[0065] 如上所述的一种李痘病毒的检测方法，其特征在于步骤A中采用纳米磁珠提取待测样品RNA的具体步骤：

[0066] a、制样：取0.1g的带毒组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；

[0067] b、清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；

[0068] c、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；

[0069] d、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；

[0070] e、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；

[0071] f取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为待测样品RNA。

[0072] 如上所述的一种李痘病毒的检测方法，其特征在于所述的免疫纳米磁珠通过以下工艺制作：

[0073] ①纳米磁珠的制备

[0074] 分别取5.2g FeCl3·6H2O、2.7g FeSO4·7H2O、0.85mL12.1moL/L的浓盐酸溶解于200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液；在80℃下搅拌，反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液；取25mL Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min；滴加0.4mL APTES，室温下搅拌7h；反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe3O4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液；

[0075] ②免疫磁珠的制备

[0076] 取0.5mL氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液，用1mL PBS清洗3次，磁分离器弃上清液；加入5%(V/V)戊二醛溶液2mL，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液；用PBS洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5mL病毒抗体包被氨基化Fe3O4纳米粒子，室温下振荡固定2h；磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，再用PBS定容，4℃冰箱保存备用，得到免疫磁珠。

[0077] 如上所述的一种李痘病毒的检测方法，其特征在于所述紫外线照

[0078] 射装置的波长为240-260nm，350-370nm。

[0079] 如上所述的一种李痘病毒的检测方法，其特征在于所述的反应液缓冲液2X由以下组分组成：

[0080]

[0081]

[0082] 所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液；所述的荧光染料含有钙黄绿素。

[0083] 本发明中用到的一些材料：

[0084] 1.1毒株

[0085] 剑兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus(CymMV)和李痘病毒Odontoglossum ringspot virus(ORSV)标准毒株购于美国AGDIA公司。

[0086] 1.2主要试剂和耗材

[0087] （1）PCR反应试剂：10×PCR buffer、dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶，宝生物工程（大连）有限公司；

[0088] （2）DNA Marker DL1000、6×loading buffer，宝生物工程（大连）有限公司；

[0089] （3）LAMP反应试剂；

[0090] （4）RNA扩增反应试剂盒Loopamp RNA Amplification kit, 荧光目视检测试剂盒, FluorescenceDetection Reagent, 反
应试管均购置于北京蓝谱生物科技有限公司，

[0091] （5）Bst DNA polymerase large fragment，New England Biolabs公司；

[0092] （6）甜菜碱（Betaine），广州威佳生物有限公司；

[0093] dNTPs、MgCl2，宝生物工程（大连）有限公司；

[0094] （7）50×TAE缓冲液：将242g Tris与37.2g Na2EDTA·2H2O溶于800mL去离子水中，充分搅拌溶解，再加入57.lmL醋酸，搅拌均匀，最后用去离子水将溶液定容至1L，使用时稀释50倍；

[0095] （8）琼脂糖，广州捷倍斯生物有限公司；

[0096] （9）70%乙醇；

[0097] （10）LAMP引物（正向外引物F3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、反向外引物B3）及PCR引物（上游引物、下游引物），宝生物工程（大连）有限公司合成；

[0098] （11）DNA提取试剂盒(离心柱型)，天根生化科技(北京)有限公司。

[0099] （12）病毒抗体一步法RT-PCR试剂盒PrimeScriptTM One－StepVer.2.0购自宝生物工程（大连）有限公司；

[0100] （13）纳米磁珠（magnetic nano particles，MNP）试剂盒购自北京金纳科技有限公司;

[0101] 1.3主要仪器设备

[0102] （1）－80℃冷冻冰箱；

[0103] （2）Labofuge400R高速冷冻台式离心机；

[0104] （3）普通PCR仪及AB7500荧光定量PCR仪；

[0105] （4）法国UVP凝胶成像系统；

[0106] （5）DYY-7型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；

[0107] （6）微量移液器，1000μL、200μL、100μL、10μL，2.5μL，；

[0108] （7）微波炉；

[0109] （8）分析天平，梅特勒－托利多仪器有限公司；

[0110] （9）高温高压灭菌锅；

[0111] （10）超纯水系统，Milli－Q Academic，Millipore公司；

[0112] （11）日本Shimadzu公司UV-120-02型可见－紫外分光光度计；

[0113] （12）超净工作台；

[0114] （13）漩涡混合器；

[0115] （14）酶联检测仪.

[0116] （15）LAMP实时浊度仪，LA－320C，日本荣研生物公司；

[0117] （16）BIOTEK酶联检测仪等设备。

具体实施方式

[0118] 下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：

[0119] 实施例1

[0120] 本发明试剂盒：

[0121] 1.产品规格：45次

[0122] 2.特点：

[0123] 环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型基因扩增方法，仅用一种酶在恒温下进行扩增，由于使用能够识别靶DNA6个特异序列的4条引物,所以特异性高，且扩增效率非常高，能够在短时间大量扩增，反应结果可以目测判定。

[0124] 本试剂盒采用环介导等温扩增法，以核糖核酸（RNA）为模板直接进行逆转录环介导等温扩增的简易试剂盒，本试剂盒使用混合逆转录酶和DNA聚合酶的酶溶液，只需将待测样品和本试剂盒中的试剂按照要求混合后置于一定的温度下（63℃）反应一定的时间即可（1小时），即可肉眼观查反应结果。

[0125] 3.试剂盒组成内容:

[0126] 1).LAMP反应液缓冲液（0.6mL）

[0127] 2).引物（250μL）

[0128] 3).荧光染料（50μL）

[0129] 4).酶溶液（50μL）

[0130] 5).阳性对照（50μL）

[0131] 6).去离子水（1000μL）

[0132] 4.操作方法：

[0133] 1).试剂的配制：

[0134] a.取-20℃下保存的各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存；

[0135] b.预混液的配制（在冰上进行）：取检测所需的反应量，按照下表比例（一个反应）分别分装在另外准备的预混溶液配制用的灭菌管中：

[0136]

[0137] 其中反应缓冲液成分（2X）：

[0138]

[0139] 酶溶液：

[0140] Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。

[0141] 荧光染料：

[0142] 含有钙黄绿素，初始与与锰离子结合而处于荧光猝灭状态，随着LAMP反应的进行，，由于反应副产物焦磷酸离子夺取与钙黄绿素结合的锰离子而使得钙黄绿素恢复游离出来从而发出荧光，而且钙黄绿素一旦与反应液中的镁离子结合，还会使得荧光得到增强。

[0143] 引物：

[0144] PPV通用引物序列（5’- 3’）

[0145]

[0146] c.分装后轻弹击试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在试管底部；

[0147] 2).加样：往分装好的试管中分别加入制备好的待检测样品的RNA5μL，使总量达到25μL，阴性对照反应使用去离子水5μL作为样品，阳性对照反应使用带有该PPV病毒核酸的阳性对照，然后盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在试管底部；

[0148] 3).扩增：将试管放置在恒温器中，在63℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；

[0149] 4).检测：使用紫外线照射装置(波长240－260nm,350-370nm)从试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查。如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。

[0150] 实施例2

[0151] 本发明检测李痘病毒的检测方法，包括以下步骤：

[0152] A、采用纳米磁珠提取待测样品的RNA；

[0153] 通过以下工艺制作免疫纳米磁珠：

[0154] ①纳米磁珠的制备

[0155] 分别取5.2g FeCl3·6H2O、2.7g FeSO4·7H2O、0.85mL12.1moL/L的浓盐酸溶解于200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液；在80℃下搅拌，反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液；取25mL Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min；滴加0.4mL APTES，室温下搅拌7h；反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe3O4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液；

[0156] ②免疫磁珠的制备

[0157] 取0.5mL氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液，用1mL PBS清洗3次，磁分离器弃上清液；加入5%(V/V)戊二醛溶液2mL，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液；用PBS洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5mL病毒抗体包被氨基化Fe3O4纳米粒子，室温下振荡固定2h；磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，再用PBS定容，4℃冰箱保存备用，得到免疫磁珠。

[0158] 具体提取方法：

[0159] a、制样：取0.1g的带毒组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；

[0160] b、清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；

[0161] c、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；

[0162] d、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；

[0163] e、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；

[0164] f取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为待测样品RNA。

[0165] B、在冰上，按以下比例取反应液缓冲液、引物、荧光染料、酶溶液、阳性对照、去离子水放入灭菌管中配制预混液；其中预混液一次反应量合计20μL，其中包括12.5μL反应缓冲液，1μL酶溶液，4μL引物，1μL荧光染料，1.5μL去离子水。其中4μL引物中包括有0.4μL正向外引物F3，0.4μL反向外引物B3，1.6μL正向内引物FIP和μL反向内引物BIP；

[0166] 其中正向外引物F3：5'-GATGATGGATGGGGAAACA-3'；

[0167] 反向外引物B3：5'-AGGCTGTAGTCTGTCAGG-3'；

[0168] 正向内引物FIP和反向内引物BIP；

[0169] 其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：

[0170] 5'-GCCATAATTTGTCTAAAAGTGGGTT-CAAGTGGAGTATCCAATAAAGC-3'；

[0171] 其中F1c：5'-GCCATAATTTGTCTAAAAGTGGGTT-3'；

[0172] F2：5'-CAAGTGGAGTATCCAATAAAGC-3'；

[0173] 所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：

[0174] 5'-ACATTTCAGTAACGTGGCTGAA-GCTGAATCCCATACCTTGG-3'；

[0175] 其中B1c：5'-ACATTTCAGTAACGTGGCTGAA-3'；

[0176] B2:5'-GCTGAATCCCATACCTTGG-3'。

[0177] C、将适量待测样品的RNA加入步骤B中的灭菌管中；具体步骤：往分装好的试管中分别加入制备好的待检测样品的RNA5μL，使总量达到25μL，阴性对照反应使用去离子水5μL作为样品，阳性对照反应使用带有该CymMV病毒核酸的阳性对照，然后盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在试管底部；

[0178] D、将步骤C中的试管放置在恒温器中，在63℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；

[0179] E、使用紫外线照射装置从试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查，如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性；所述紫外线照射装置的波长为240-260nm，350-370nm。