一种试剂盒

摘要

本发明属于医疗器械技术领域，本发明公开了一种试剂盒，该试剂盒包括以下组份：一抗地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、3H标记羊角拗苷甲、聚乙二醇6000、pH=7.4的磷酸缓冲液（PBS缓冲液）、3H闪烁液、pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液）、含有或者不含有羊角拗苷甲。本发明试剂盒具有操作简单方便、灵敏度高、特异性强等优点，并且能够稳定可靠的早期诊断孕期子痫，为之后的治疗提供有利依托。

权利要求

1.一种试剂盒，其特征在于包括以下组份：一抗地高辛抗体12微克/毫升、二抗鼠抗-7 3羊IgG 5×10 摩尔/升、H标记羊角拗苷甲为10Ci/mmol、浓度为20％聚乙二醇6000水溶3

液、pH＝7.4的磷酸缓冲液、H闪烁液；含有或者不含有羊角拗苷甲。

2.根据权利要求1所述的一种试剂盒，该试剂盒用于检测人体血清、胎盘组织分泌液、以及冷冻胎盘组织中的内源性洋地黄样因子的含量。

3.根据权利1所述的一种试剂盒，该试剂盒用于检测检孕期先兆子痫或子痫。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中试剂盒用于检测孕期先兆子痫和子痫的方法为：(1)采集胎盘，切成2cm×2cm×2cm大小的组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；

(2)将冷冻胎盘组织块切成片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；

(3)收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，以2000rpm的速度离心5分钟，去除蛋白；

收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；

3

(4)取出试剂盒中地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、H标记羊角拗苷甲、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，分别等量加入，充分混合，室温孵育；

(5)再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；

3

(6)沉淀物用500μL pH7.4的PBS重悬，加入 H闪烁液200μL；

(7)测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度；

3

或者：取孕妇血样，获得血清，取出试剂盒中地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、H标记羊角拗苷甲、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，分别等量加入，充分混合，室温孵育；再加入3

等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入 H闪烁液200μL；测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中标准曲线的绘制方法为：(1)采集胎盘，切成2cm×2cm×2cm大小的组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；

(2)将冷冻胎盘组织块切成片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；

(3)收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，以2000rpm的速度离心5分钟，去除蛋白；

收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；

(4)取出试剂盒中地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、2nM羊角拗苷甲、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，分别等量加入，充分混合，室温孵育；

(5)再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；

3

(6)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入 H闪烁液200μL；

(7)测量样品放射量，得到样品中所含内源性洋地黄样因子浓度；

(8)重复上述操作，步骤(4)羊角拗苷甲依次替换为5nM，10nM，20nM，50nM，0.1M和3

0.2M，同时，将步骤(6)加入 H闪烁液依次替换成5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、

200μL，测得数值绘制成标准曲线。

说明书

一种试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于医疗器械技术领域，具体涉及一种检测孕期先兆子痫或子痫的试剂盒。

背景技术

[0002] 孕期早痫是一种病发原因复杂的综合征，如果不及时治疗，可发展为子痫，危及生命。主要症状有高血压、蛋白尿，水肿，惊厥，肾功能损伤等，已成为世界上孕妇致死率最高的一种疾病，目前具体病因不明。有研究证明，胎盘产生的一种导致易感妇女母体血管内皮功能障碍的物质可能是早痫病发的其中一个原因。血压升高是该疾病最明显的标志，同时造成对产妇内皮，肾脏和肝脏的损害，并释放血管收缩因子。

[0003] 早痫在全球孕妇中发病率为6-8%，通常发病于妊娠二期晚期或妊娠三期，大部分在孕期32周之后发病（32周前发病被认为是早期发病）。极少数孕妇会在孕期20周发病。初次怀孕的孕妇发病率最高，并且随着妊娠次数的增加，该疾病发病率大幅度降低。早痫多发于具有高血压史，糖尿病史，肥胖症史，自身免疫性疾病史如狼疮，和多胎妊娠（双胞胎或多胞胎）的孕妇中，其发病过程因人而异，大多数病例可以在分娩前被确诊。少数病例在分娩后六周才被确诊，称为“产后早痫”。确诊后除了剖腹产或引产手术，没有其他治疗方式。
早痫是最常见的的妊娠综合症，同时影响母亲和胎儿，导致早产儿甚至对母婴造成生命危险。

[0004] 传统上早痫的确诊标志是孕期高血压（两个独立的至少相隔六小时的测量值，收缩压为140以上和/或舒张压为90以上）和24小时尿液样本中的蛋白含 量高于300毫克（蛋白尿）。比基线血压（BP）高30毫米汞柱的收缩压或高15毫米汞柱的舒张压，不能达到140/90的绝对标准，仍然被认为是重要发病信号，但并不能就此确诊。肿胀或水肿（尤其是在手和脸）最初曾被认为是诊断早痫的一个重要标志，但目前的医学实践证明，只有高血压和蛋白尿可以作为诊断标准。

[0005] 虽然早痫是一种致命性疾病，但其早期发病通常无症状。而且一般情况下，早痫的信号都不是特异性的，比如孕期惊厥，在怀孕过程中，其他原因比子痫更容易导致惊厥。因此早痫的早期诊断一直是医学界无法攻克的一个难题。

[0006] 在早痫病人的症状中，一种钠钾泵抑制因子-内源性洋地黄样因子（endogenous digitalis-like factor，EDLF）水平的升高，是早痫的重要标志。这种因子能够导致血压升高，存在于人体和动物组织及体液中，其化学结构和生物活性与植物洋地黄中提取的类固醇强心剂相似，故名“洋地黄样因子”。此因子能够以与地高辛等强心剂类似的机制结合到钠钾泵上，并抑制其活性。

[0007] 为了实现对妊娠早痫的早期诊断，达到早期治疗的目的，需要以地高辛抗体作为工具，开发一种可以特异性精确测量样品中内源性洋地黄样因子的方法，并制成操作简便快捷的试剂盒。在此因子被发现后的几十年中，研究的最大困难在于，其在体内的含量非常低，并且由于结构还未被确定，目前还没有方法可以把它（们）从体内分离出来。因此，本发明中的试剂盒提供了一种在临床上不需将其分离，但仍可以灵敏测定该因子浓度，并作为早痫早期诊断依据的方法。

发明内容

[0008] 基于上述原因，申请人为克服现有技术的不足，提供一种操作简单方便、灵敏度高、特异性强，并且稳定可靠的早期诊断孕期子痫的试剂盒，为之后的 治疗提供有利依托。

[0009] 本发明的另一个目的是，可以利用此试剂盒确定样本中内源性洋地黄样因子的水平，对该因子的致病机制、体内合成调节的研究有重大意义，并把早痫的病理研究往前推进了一大步。

[0010] 本发明所述的早痫为先兆子痫。

[0011] 本发明通过下述技术方案实现的。

[0012] 一种试剂盒，其包括以下组份：一抗地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、3H标记羊角拗苷3
甲、聚乙二醇6000、pH=7.4的磷酸缓冲液（PBS缓冲液）、H闪烁液、pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液），含有或不含有羊角拗苷甲。

[0013] （注：不含有羊角拗苷甲的试剂盒，可以按照标准曲线的绘制方法，制备标准曲线后，加入试剂盒说明书中，使用试剂盒人员可以按照标准曲线计算内源性洋地黄因子的浓度）。

[0014] 上述所述的一种试剂盒优选为：一抗地高辛抗体12微克/毫升、二抗鼠抗羊-7 3IgG5×10 摩尔/升、H标记羊角拗苷甲为10Ci/mmol、浓度为20%聚乙二醇6000水溶液、
3
pH=7.4的磷酸缓冲液（PBS缓冲液）、H闪烁液、pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液），含有或不含有羊角拗苷甲。

[0015] （注：不含有羊角拗苷甲的试剂盒，可以按照标准曲线的绘制方法，制备标准曲线后，加入试剂盒说明书中，使用试剂盒人员可以按照标准曲线计算内源性洋地黄因子的浓度）。

[0016] 所述一抗地高辛抗体浓度为12μg/mL，制备方法为取0.12mg地高辛抗体，溶于10mL去离子水中，轻轻混合均匀，避免使用搅拌器。

[0017] 所述为聚乙二醇6000水溶液，浓度20%，制备方法为取20mg PEG6000，置于100mL去离子水中，用搅拌器充分搅拌，使固体溶解，充分混匀。

[0018] 所述作为参照的非放射性羊角拗苷甲标准品浓度梯度分别为2nM，5nM，10nM，20nM，50nM，0.1M及0.2M。

[0019] 本发明所述的nM为纳摩尔/升；本发明所述的M为摩尔/升。

[0020] 本发明所述的试剂盒需要可以测量3H放射性的仪器设备进行测量。（设备名为scintillation counter。任何做放射性实验的实验室都有，操作过程为把样品放进去，运行操作软件，直接出结果。）

[0021] 上述所述的试剂盒用于检测人体血清，胎盘组织分泌液，以及冷冻胎盘组织中的内源性洋地黄样因子的含量。

[0022] 上述所述的试剂盒用于检测用于检测检孕期先兆子痫或子痫。

[0023] 试剂盒用于检测孕期先兆子痫和子痫的方法为：

[0024] （1）采集胎盘，切成2cm×2cm×2cm大小的组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；

[0025] （2）将冷冻胎盘组织块切成片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；

[0026] （3）收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，以2000rpm的速度离心5分钟，去除蛋白；收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；

[0027] （4）取出试剂盒中地高辛抗体、二抗、放射性标记羊角拗苷甲，分别等量加入，充分混合，室温孵育；

[0028] （5）再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；

[0029] （6）沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入3H闪烁液；

[0030] （7）测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度。

[0031] 或者：取孕妇血样，获得血清，取出试剂盒中地高辛抗体、二抗鼠抗羊 IgG、3H标记羊角拗苷甲、pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液），分别等量加入，充分混合，室温孵育；再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；沉淀物用500微升pH7.4的PBS3
重悬，加入 H闪烁液200μL；测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度。

[0032] 测得孕妇高于10nM，为先兆子痫。

[0033] 标准曲线绘制方法：

[0034] （1）采集胎盘（确诊为子痫孕妇，签署知情同意书），切成2cm×2cm×2cm大小的组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；

[0035] （2）将冷冻胎盘组织块切成片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；

[0036] （3）收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，以2000rpm的速度离心5分钟，去除蛋白；收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；

[0037] （4）取出试剂盒中地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、2nM羊角拗苷甲、pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液），分别等量加入，充分混合，室温孵育；

[0038] （5）再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；

[0039] （6）沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入3H闪烁液2μL；

[0040] （7）测量样品放射量，得到样品中所含内源性洋地黄样因子浓度，[0041] （8）重复上述操作，步骤（4）羊角拗苷甲依次替换为5nM，10nM，20nM，50nM，0.1M3
和0.2M，同时，将步骤（6）加入 H闪烁液依次替换成5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、
200μL，测得数值绘制成标准曲线。

[0042] 上述所述的标准曲线可以放在试剂盒中，用于检测结果使用，也可以在检 测时绘制标准曲线，再根据标准曲线测定检测结果。

[0043] 本发明的有益效果是，提供了一种快速、简单、方便、特异性、稳定性及灵敏性都非常强的试剂盒，测量出样品中内源性洋地黄样因子的含量，解决了长期以来对早痫的早期诊断研究的重大困难，即由于早痫早期标志不明显无法确诊，以及内源性洋地黄样因子含量太低导致的无法精确测量，从而延误治疗。本发明更深远的意义还在于，该试剂盒可以用于测量胎盘组织分泌的内源性洋地黄样因子浓度，为进一步对该因子的致病机制、体内合成调节的研究打下良好基础，并使孕期早痫的病理研究工作向前迈进了一大步。

[0044] 本发明所述的一抗地高辛抗体购自GlaxoSmithKline（又名抗地高辛抗体）、二3
抗鼠抗羊IgG购自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc、H标记羊角拗苷甲购自Perkin Elmer、聚乙二醇6000购自Calbiochem、pH=7.4的磷酸缓冲液（PBS缓冲液）自配、
3
H闪烁液购自National Diagnostics、羊角拗苷甲（为羊角拗苷分离得到，羊角拗苷为羊角拗苷甲和羊角拗苷乙的混合物）购自Sigma、pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液）购自Sigma。

附图说明

[0045] 图1：地高辛抗体抑制内源性洋地黄样因子在早痫中对钠钾泵的抑制作用。纵坐标代表血红细胞中钠钾泵被抑制的百分比，单位%；图中A代表对照，B代表没有使用地高辛抗体的早痫患者样本，C代表使用地高辛抗体后的早痫患者样本。

[0046] 图2：表示本发明标准曲线（按照标准曲线绘制方法得到），横坐标代表3H闪烁液，单位μL；纵坐标代表内源性洋地黄样因子浓度，单位纳摩/升。

[0047] 图3：表示本发明试剂盒测出的十一份独立胎盘样本中分泌的内源性洋地黄样因子的浓度，样本来自正常孕妇。横坐标1-11分别代表十一份独立样本； 纵坐标代表内源性洋地黄样因子浓度，单位纳摩/升。

[0048] 图4：表示本发明试剂盒用于确定胎盘组织中内源性洋地黄样因子的浓度，样品来自早痫孕妇。横坐标1-5分别代表5份独立样本；纵坐标代表内源性洋地黄样因子浓度，单位纳摩/升。

[0049] 图5：表示本发明试剂盒用于测量人体血清中内源性洋地黄样因子的浓度。横坐标1-7分别代表7份独立样本；纵坐标代表内源性洋地黄样因子浓度，单位纳摩/升。

[0050] 图6：表示本发明试剂盒测量人胎盘中内源性洋地黄样因子浓度随时间的累积。横坐标代表培养时间，单位小时；纵坐标代表内源性洋地黄样因子浓度，单位纳摩/升。

[0051] 制备实施例

[0052] 试剂盒：一抗地高辛抗体12微克/毫升、二抗鼠抗羊IgG5×10-7摩尔/升、3H标记羊角拗苷甲甲浓度为10.0Ci/mmol、聚乙二醇6000浓度为20%、pH=7.4的磷酸缓冲液（PBS3
缓冲液）、H闪烁液、pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液）。

[0053] 本发明所述的试剂盒需要可以测量3H放射性的仪器设备进行测量。（设备名为scintillation counter。任何做放射性实验的实验室都有，操作过程为把样品放进去，运行操作软件，直接出结果。）

[0054] 实施例1：试剂盒用于测量胎盘组织分泌的内源性洋地黄样因子含量[0055] （1）采集胎盘，切成2cm×2cm×2cm大小的组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；

[0056] （2）将冷冻胎盘组织块切成片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；

[0057] （3）收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，以2000rpm的速度离心5 分钟，去除蛋白；收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；

[0058] （4）取出试剂盒中地高辛抗体、二抗、放射性标记羊角拗苷甲，分别等量加入，充分混合，室温孵育；

[0059] （5）再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；

[0060] （6）沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入3H闪烁液200μL；

[0061] （7）测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度。

[0062] 标准曲线的绘制：

[0063] （1）采集胎盘，切成2cm×2cm×2cm大小的组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；

[0064] （2）将冷冻胎盘组织块切成片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；

[0065] （3）收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，以2000rpm的速度离心5分钟，去除蛋白；收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；

[0066] （4）取出试剂盒中地高辛抗体、二抗鼠抗羊IgG、2nM羊角拗苷甲、pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液），分别等量加入，充分混合，室温孵育；

[0067] （5）再加入等量的PEG6000溶液，离心，得到沉淀物；

[0068] （6）沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入3H闪烁液2μL；

[0069] （7）测量样品放射量，得到样品中所含内源性洋地黄样因子浓度，[0070] （8）重复上述操作，步骤（4）羊角拗苷甲依次替换为5nM，10nM，20nM，50nM，0.1M3
和0.2M，同时，将步骤（6）加入 H闪烁液依次替换成5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、
200μL，测得数值绘制成标准曲线。

[0071] 结果如图3所示结果，利用此试剂盒测量出独立胎盘组织中分泌的内源性洋地黄样因子浓度，单位为nM，此浓度可以被本发明提供的试剂盒精确测量。

[0072] 实施例2该试剂盒用于测量人体冷冻胎盘组织中内源性洋地黄样因子的含量[0073] （1）用刀片将冷冻胎盘组织块切成薄片；

[0074] （2）将组织薄片置于匀浆器中，液氮冷冻1分钟；

[0075] （3）以1500rpm的速度匀浆5分钟；

[0076] （4）取出组织匀浆，加等量甲醇，离心去除蛋白；

[0077] （5）将上清液浓缩，保存；

[0078] 测量样品方法同实施例1中步骤（4）-（7）。标准曲线绘制同实施例1。

[0079] 如图4所示，此试剂盒可测量冷冻胎盘组织中内源性洋地黄样因子的浓度，样品来源均被确诊为早痫病发者。

[0080] 实施例3：该试剂盒用于测量人体血清中内源性洋地黄样因子的含量[0081] 测量方法同实施例1中步骤（4）-（7）。结果如图5所示，该试剂盒可以精确测量出人体血清中低含量的内源性洋地黄样因子。

[0082] 实施例4：该试剂盒用于测量胎盘组织中分泌内源性洋地黄样因子的累积[0083] 方法同实施例1。如图6所示，随着组织培养时间的累积，该试剂盒测出人胎盘分泌的内源性洋地黄样因子含量逐步增加。

[0084] 此结果进一步证明本发明提供的试剂盒的精确可靠性，更为重要的是，为今后进一步研究该因子在人体内的生物合成以及生物调节打下基础。

[0085] 所述实施例包括但不限于上述。