Rictor/mTORC2在心脏发育和疾病治疗中的药物用途

摘要

本发明提供rictor/mTORC2在小鼠胚胎干细胞体外分化为心肌细胞中的应用，即可应用于筛选与评价以rictor/mTORC2为靶点的促心肌细胞分化剂的研究。本发明利用percoll试剂纯化出由小鼠胚胎干细胞体外定向分化而来的心肌细胞，转染编有rictor的组蛋白乙酰转移酶转录辅激活子p300的质粒，使心肌细胞中rictor乙酰化水平增加，进而促进rictor下游效应器Akt（ser473）磷酸化，增加mTORC2活性，从而构建心肌细胞肥大模型，并进一步利用该模型，评价了白藜芦醇抗心肌肥大的作用，有利于发现新一类心肌分化诱导剂。

权利要求

1.rictor/mTORC2在小鼠胚胎干细胞体外分化为心肌细胞中的应用，其特征在于，在以rictor/mTORC2为靶点的促心肌细胞分化剂的筛选与评价中的应用。

说明书

Rictor/mTORC2在心脏发育和疾病治疗中的药物用途

技术领域

[0001] 本发明属发育生物学，药理学和再生医学领域，涉及一种蛋白质新功能的研究与应用领域，具体涉及rictor/mTORC2（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2，mammalian target of rapamycin complex 2，mTORC2）在小鼠胚胎干细胞体外分化为心肌细胞中的新功能，可用于以rictor/mTORC2为靶点的促心肌细胞分化剂筛选。本发明还证实了rictor/mTORC2与心肌肥大的关联性，可用于抗心肌肥大疾病药物的开发研究。

背景技术

[0002] 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是细胞增殖、生长、分化的中心调控者，通过结合不同的蛋白形成两种复合物mTORC1（mammalian target of rapamycin complex 1）和mTORC2（mammalian target of rapamycin complex2）。mTORC2包括mTOR、mTOR的雷帕霉素不敏感组分（rapamycin-insensitive companion of mTOR，rictor）、mSin1（mammalian stressactivated protein kinase-interacting protein 1）、PRR5（prolin-rich repeat protein-5）和mLST8（mammalian lethal with sec13 protein 8）蛋白。其中rictor是保证mSin1稳定和维持mTORC2活性所必需的。过去几十年国内外研究主要集中于mTORC1，而对mTORC2在各种生理/病理状态（包括心脏发育/心脏疾病等）的功能知之甚少。

[0003] mTOR在胚胎发育和胚胎干细胞生长分化过程中是必需的，且mTORC1和 mTORC2在不同胚层细胞分化中起着不同的作用。Rictor敲除的小鼠胚胎发育至E9.5表现出生长阻滞，且在E11.5死亡，推测与胚胎细胞缺失rictor后导致细胞内能量产生不足，代谢失衡有密切关系，但其具体机制尚未阐明。同时，mTORC2 参与细胞骨架蛋白构建和细胞迁移过程。迄今尚未见rictor/mTORC2与胚胎心脏分化发育及心脏疾病发生相关性的报道。因此，深入揭示rictor/mTORC2在心脏生理/病理发生发展中所起的作用，开发以rictor/mTORC2为靶点的新药物，为心脏疾病的防治提供新途径与方法，并有利于再生医学中终末期心脏疾病的药物干预治疗，具有广阔研究前景。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是提供rictor/mTORC2在小鼠胚胎干细胞体外分化为心肌细胞中的应用，即可应用于筛选与评价以rictor/mTORC2为靶点的促心肌细胞分化剂的研究。本发明证实小鼠胚胎干细胞通过基因慢病毒shRNA干扰rictor后，能显著抑制其定向分化为心肌细胞。表现为分化时抑制了中胚层特异性蛋白brachyury、心肌转录因子Nkx2.5和心肌特异性蛋白 -Actinin的表达。心肌细胞数量也显著减少。同时，干扰rictor组分化而来的心肌细胞肌小节发生紊乱，明暗相间不明显。本发明进一步发现抑制rictor表达的化合物PP242不利于心肌细胞分化，而促进rictor表达的化合物淫羊藿苷有利于心肌细胞分化。即利用本发明可应用于以rictor/mTORC2为靶点的促心肌细胞分化剂的筛选与评价，有利于发现新一类心肌分化诱导剂。

[0005] 本发明提供一种新的心肌细胞肥大模型，应用于筛选与评价以rictor/mTORC2为靶点的抗心肌肥大药物研究。本发明利用percoll试剂纯化出由小鼠胚胎干细胞体外定向分化而来的心肌细胞，转染编有rictor的组蛋白乙酰转移酶转录辅激活子p300的质粒，使心肌细胞中rictor乙酰化水平增加，进而促进rictor下游效应器Akt（ser473）磷酸化，增加mTORC2活性，从而构建心肌细胞肥大模型。并进一步利用该模型，评价了白藜芦醇抗心肌肥大的作用。

附图说明

[0006] 图1为 ES-D3细胞干扰rictor后对其定向分化为心肌细胞的影响，**P<0.01，***P<0.001 vs 溶剂对照组。

[0007] 图2为Western blot法检测ES-D3细胞干扰rictor后对心肌细胞分化时心肌特异性蛋白表达的影响。

[0008] 图3为流式细胞术定量检测ES-D3细胞干扰rictor后对心肌细胞数量的影响，其中A是流式结果图，B是心肌细胞数量定量柱状图，n=3，**P<0.01 vs 溶剂对照组。

[0009] 图4A为免疫荧光法检测ES-D3细胞自发分化（阴性对照）为心肌细胞中肌小节蛋白α-Actinin的表达。

[0010] 图4B为免疫荧光法检测ES-D3细胞干扰rictor后（干扰组）衍生化心肌细胞中肌小节蛋白α-Actinin的表达。

[0011] 图5为PP242对ES-D3细胞定向分化为心肌细胞的影响，其中A是rictor及下游效应蛋白，心肌特异性蛋白表达情况，B是ES细胞定向分化为心肌细胞百分率统计柱状图，n= 3，*P < 0.05，**P < 0.01 vs 溶剂对照组。

[0012] 图6为淫羊藿苷诱导ES-D3细胞定向心肌细胞分化时对rictor的影响。

[0013] 图7为ES-D3细胞分化而来的心肌细胞中rictor乙酰化引起心肌细胞肥大，其中A是WB检测心肌细胞乙酰化效果，B是WB法检测心肌肥大相关蛋白的表达。（C）免疫荧光法观察心肌细胞形态。

[0014] 图8为WB法检测白藜芦醇抗rictor乙酰化引起心肌细胞肥大的作用。

[0015] 具体实例方式

[0016] 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。此外应理解，下面的优选具体实施方案仅仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

[0017] 实施例1 ES-D3细胞干扰rictor后对定向心肌细胞分化的影响

[0018] 1. 通过慢病毒shRNA干扰ES-D3细胞中rictor基因

[0019] 采用小鼠ES-D3细胞，加入shRNA-rictor进行转染，并设置对照组。shRNA-rictor干 扰 序 列 如 下：5'-CCGGGCCAGTAAGATGGGAATCATTCTCGAGAATGATTCCCATCTTACTGGCTTTTTG-3'； 转染当天，吸去细胞上清液，按MOI值为10 PFU/细胞，将病毒原液加入培养瓶中，再加正常培养液到2 ml，边加边轻摇培养皿，确保均匀分布和避免局部高浓度。把细胞放回培养箱孵育，37°C感染 72-96 h后，观察荧光表达情况。转染效率达80%左右，按悬滴-悬浮-贴壁培养法进行细胞分化实验。

[0020] 悬滴-悬浮培养

[0021] 将上述转染成功的ES-D3细胞用胰蛋白酶消化制成细胞密度为2×104个/ml的单细胞悬液，以30 接种于直径为10-cm的培养皿的盖子内表面上，培养皿内加入10ml D-Hanks液，然后小心盖上带有许多小滴的盖子，使盖子上的小滴倒挂成悬滴（每个悬滴约含600个细胞），置培养箱中培养3天。收集 EBs 转至铺有琼脂含有 10 ml 分化培养液的-1培养皿中悬浮培养 2 天。分化培养液为高糖DMEM，含0.1 mmol.L -巯基乙醇, 非必需氨基酸和20 %胎牛血清，不含LIF因子。

[0022] 贴壁培养

[0023] 在显微镜下用吸管将悬滴培养形成的拟胚体（embryoid body, EB），转移到24孔板内，使其吸附贴壁后，每孔中缓慢加入1 ml分化培养液，此时开始用倒置显微镜每天观察细胞，以捕捉心肌细胞定向分化的形态变化。将EB转移至24孔板内记为d 5+0。

[0024] 观察并统计EB贴壁1、2、3天时分化成心肌细胞搏动情况。

[0025] 结果参见图1。结果显示，ES细胞干扰rictor后显著抑制其定向分化为心肌细胞。干扰组在分化d 5＋2时心肌细胞分化率仅为20.9±6.7%，较溶剂对照组38.1±3.9%显著减少（**P<0.01）；干扰组在d 5＋3心肌细胞分化率为42.2±5.8%，较溶剂对照组65.4±6.3%显著减少（***P<0.001）。

[0026] 实施例2 Western blot法检测ES-D3细胞干扰rictor后对心肌细胞分化时心肌特异性蛋白表达的影响。

[0027] 收集分化d 3，d 5，d 5+1和d 5+3天的EB和心肌细胞团进行相关蛋白表达的考察。取蛋白加入5×SDS缓冲液，煮沸5 min变性，于10 % SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，约2 h；然后用电转膜仪将蛋白转印到PVDF 膜上，约1.5 h；5 %脱脂牛奶溶于室温封闭1 h，T-PBS（0.05% Tween）漂洗3次（15 min，5 min，5 min）；加入羊抗rictor（1：1000），兔抗p-Akt（1：1000），兔抗p- Akt（1：1000），兔抗brachyury（1:1000），兔抗Nkx2.5，（1:1000），鼠抗α-Actinin（1:1000），鼠抗GAPDH（1：10000），4°C孵育过夜，T-PBS漂洗3次（15 min，10 min，5 min）；分别加入辣根过氧化物酶标记的抗兔，鼠或羊二抗（1：5000），室温孵育1 h；T-PBS漂洗3次（15 min，10 min，5 min）； 采用ECL法检测印迹膜。

[0028] 结果参见图2。结果显示，从分化d 3到d 5+3，慢病毒sh-rictor可以显著抑制mTORC2重要组成部分rictor以及mTORC2下游效应器Akt（Ser473）磷酸化蛋白表达。从分化d 3到d 5，干扰组分化细胞中胚层蛋白brachyury和心肌转录因子Nkx2.5表达下调；分化d 5+1到d 5+3，干扰组分化而来的细胞心肌特异性蛋白α-Actinin表达也显著下调。

[0029] 实施例3：流式细胞术定量检测ES-D3细胞干扰rictor后对心肌细胞数量的影响。

[0030] 收集贴壁分化3天的ES-D3细胞衍生心肌细胞样本，用胶原酶II消化成单个细胞，并用1 %多聚甲醛固定1 h，再用3 %的BSA封闭1 h，上一抗：心肌细胞特异性蛋白Monoclonal mouse anti-α-Actinin，1：500稀释，4°C孵育过夜。第二天加入二抗：Dylight549-Conjugatedgoat anti- mouse IgG，1：500稀释，，37°C孵育1.5 h。上机检测。

[0031] 结果参见图3。结果显示，ES-D3细胞干扰rictor后定向分化为心肌细胞数量显著减少。干扰rictor组心肌细胞数量为5.8±1.7%，较阴性对照组12.5±1.1%显著减少（**P<0.01）。

[0032] 实施例4：免疫荧光实验检测ES-D3细胞干扰rictor后衍生化心肌细胞中肌小节蛋白α-Actinin的表达。

[0033] 收集贴壁分化3天的ES-D3细胞衍生心肌细胞样本，用纯冷甲醇固定10 min，再用牛血清封闭处理30 min，然后加入一抗：心肌细胞特异性蛋白Monoclonal mouse anti-α-Actinin，1：500稀释，4°C孵育过夜。1：500稀释，4°C孵育过夜。第二天加入二抗：Dylight549-Conjugatedgoat anti- mouse IgG，1：500稀释，，37°C孵育1.5 h。用DAPI以1:1000处理1min，用荧光显微镜观察，拍照记录。

[0034] 结果参见图4。结果显示，阴性对照组分化来的心肌细胞肌小节清晰、明暗相间，呈梯形，并且阳染区域（红色）多，而干扰组中肌小节发生紊乱，明暗相间不明显，阳染区域显著减少。

[0035] 实施例5：mTORC2抑制剂PP242对ES-D3细胞定向心肌细胞分化的影响。

[0036] 按实施例1中“悬滴-悬浮-贴壁”方法进行心肌细胞分化实验。同时在悬滴培养时加入mTORC2抑制剂PP242，终浓度为100 nmol/L，整个分化过程都加抑制剂。在贴壁分化第3和7天分别统计搏动心肌细胞分化百分率及相关蛋白表达情况。

[0037] 结果参见图5。结果显示，PP242能显著抑制ES-D3细胞向心肌细胞分化，搏动心肌细胞团比率降低，心肌特异性蛋白α-Actinin表达减少，mTORC2中重要组成蛋白rictor及下游效应蛋白p-AKT（Ser473）表达均被抑制（图5）。

[0038] 实施例6：淫羊藿苷诱导ES细胞定向心肌细胞分化时对rictor的影响。

[0039] 按实施例1中通过慢病毒shRNA干扰ES-D3细胞中rictor基因，再进行心肌细胞-7分化实验。同时在贴壁培养时加入分化诱导剂淫羊藿苷，终浓度为10 mol/L。在贴壁分化第1和3天分别观察相关蛋白表达情况。

[0040] 结果参见图6。结果显示，淫羊藿苷能显著诱导ES-D3细胞向心肌细胞分化，心肌特异性蛋白α-Actinin表达增加，mTORC2中重要组成蛋白rictor及下游效应蛋白p-AKT（Ser473）表达均增加（图6）。

[0041] 实施例7.心肌细胞中rictor蛋白乙酰化引起心肌细胞肥大。

[0042] 心肌细胞分离：按实施例1中的“悬滴-悬浮-贴壁培养法”进行细胞分化实验。取贴壁分化7天的心肌细胞团，采用Percoll不连续密度梯度离心法分离ES细胞衍生心肌细胞。主要步骤如下：心肌细胞在Percoll中漂浮密度为1.065～1.069 g/ml ，对应
40.5％～58.5％Percoll液浓度；将3 ml 58.5％Percoll加到离心管底层，再将3 ml
40.5％Percoll液缓慢加到58.5％Percoll液上面，再将3 ml ES源心肌细胞轻轻加到顶层，1500×g 离心30 min；收集分离的第4层细胞，用D-Hanks液洗2次，离心去除Percoll液，加完全培养基重悬，接种于培养板中；置于37 °C，5％ CO2孵箱中培养。

[0043] 乙酰化：心肌细胞转染编有mTORC2（mTOR，LST8，mSin1.1， Rictor）有或无组蛋白乙酰转移酶转录辅激活子p300的质粒，在有或无wortmannin时，免疫共沉淀法检测rictor乙酰化与mTORC2的关系，统计Akt（ser473）磷酸化倍数变化情况。

[0044] 乙酰化后观察心肌细胞肥大情况：（1）提取蛋白加入5×SDS缓冲液，煮沸5 min变性，于10 % SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，约2 h；然后用电转膜仪将蛋白转印到PVDF 膜上，约1.5 h；5%脱脂牛奶溶于室温封闭1 h，T-PBS（0.05% Tween）漂洗3次（15 min，5 min，5 min）；加入羊抗GATA4（1：1000），兔抗 -MHC（1：1000），兔抗MEF2C（1：1000），鼠抗GAPDH（1：10000），4°C孵育过夜，T-PBS漂洗3次（15 min，10 min，5 min）；分别加入辣根过氧化物酶标记的抗兔，鼠或羊二抗（1：5000），室温孵育1 h；T-PBS漂洗3次（15 min，10 min，5 min）；采用ECL法检测印迹膜。（2）心肌细胞样本，用纯冷甲醇固定10 min，再用牛血清封闭处理30 min，然后加入FITC标记的鬼笔环肽染色后， 用荧光显微镜观察，拍照记录。

[0045] 结果参见图7。结果显示，表达p300的质粒可以显著增加心肌细胞内rictor蛋白乙酰化，进而促进rictor下游效应器Akt（ser473）磷酸化，使Akt（ser473）磷酸化的倍数增加了1.5，即rictor乙酰化可以增加mTORC2的活性。当心肌细胞中rictor乙酰化后，WB结果显示心肌肥大相关蛋白GATA4，β-MHC和MEF2C表达显著增加。免疫荧光结果显示，rictor乙酰化的心肌细胞表面积增大。

[0046] 实施例8.白藜芦醇抗rictor乙酰化引起的心肌细胞肥大药效评价。

[0047] 按实施例7中制备心肌肥大模型，加入白藜芦醇75 μmol/L，考察其抗心肌肥大作用。

[0048] 结果参见图8。结果显示，白藜芦醇具有抗rictor乙酰化引起的心肌细胞肥大作用，在75 μmol/L浓度下，显著降低Akt（ser473）磷酸化水平，及心肌肥大相关蛋白GATA4、β-MHC和MEF2C表达。

[0049] 无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。