包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒的制备方法

摘要

本发明公开了包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒的制备方法。该方法先将玉米肽和多糖分别溶于磷酸盐缓冲液，将玉米肽溶液和多糖溶液混合，然后冷冻干燥，所得的干燥粉末放于密闭干燥器中，在温度为55～65℃条件下进行干热反应4～7天；得到玉米肽糖基化产物；再将上述玉米肽糖基化产物加入水中，充分搅拌，调节pH；滴加脂溶性维生素乙醇溶液，充分搅拌，旋转蒸发，即得到包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒。本发明的包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒，脂溶性维生素包埋率高，粒径小，溶液具有较好的透明度和pH稳定性，可作为配料应用于乳制品及饮料中。而且该方法工艺简单、成本低、操作性强。

权利要求

1.一种包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤和工艺条件：(1)将玉米肽和多糖分别溶于10～20mM磷酸盐缓冲液，搅拌均匀；所述多糖为麦芽糊精；控制玉米肽溶液和多糖溶液的浓度均为50～100mg/mL；所述的磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠‐磷酸氢二钠缓冲液，pH值为7.5；

(2)将玉米肽溶液和多糖溶液混合，调节pH值至7.4～7.6，搅拌均匀，然后冷冻干燥；

(3)将步骤(2)所得的干燥粉末放于密闭干燥器中，在温度为55～65℃条件下进行干热反应4～7天；

(4)将步骤(3)所得的固体溶解于去离子水中，搅拌均匀，离心，取上清，冷冻干燥，干燥的粉末存放在冰箱中，得到玉米肽糖基化产物；

(5)将步骤(4)所得的玉米肽糖基化产物溶解于去离子水中，控制溶液中肽浓度为

0.5～5mg/mL，搅拌均匀，调节pH至7～3；

(6)将脂溶性维生素溶解于无水乙醇中，控制浓度为1～10mg/mL，搅拌均匀；

(7)将步骤(6)所得脂溶性维生素乙醇溶液滴加至步骤(5)所得溶液中，搅拌1～2h；

所得溶液中脂溶性维生素与玉米肽的质量比为1:10～1:50；

(8)将步骤(7)所得的溶液旋转蒸发后，放置在冰箱或冷冻干燥密封保存，得到包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒的制备方法，其特征在于：脂溶性维生素为维生素E或维生素D。

3.根据权利要求1所述的包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的干热反应的相对湿度为79％。

4.根据权利要求1所述的包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述离心为10000r/min条件下离心15min。

5.根据权利要求1所述的包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(2)和(5)所述的pH通过用0.1mol/L盐酸或氢氧化钠进行控制。

6.根据权利要求1所述的包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的旋转蒸发温度为45～55℃，真空度0.1MPa，时间5～10min。

7.根据权利要求1所述的包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的冰箱的温度为3～6℃。

说明书

包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒的制备方

法

技术领域

[0001] 本发明属于农副产品深加工及食品工业技术领域，涉及一种包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化纳米颗粒的制备，可作为配料应用于乳制品及饮料中。

背景技术

[0002] 脂溶性维生素是人类必需的营养物质，其难溶于水而易溶于有机溶剂。维生素E、维生素D均属于脂溶性维生素，由于水溶性差，它们在食品工业的应用受到了限制。

[0003] 近年来，包埋疏水活性物质的微胶囊技术越来越受到人们的关注。玉米醇溶蛋白具有特殊溶解性以及自组装形成纳米球形颗粒的特点。同时，作为天然的生物大分子，玉米醇溶蛋白具有良好的生物相容性和生物可降解性。因此，目前国内外有大量研究以玉米醇溶蛋白作为疏水活性物质的载体，采用的包埋方法为反溶剂法。

[0004] 中国发明专利申请CN102783693A和CN101785867A分别公开了玉米醇溶蛋白纳米颗粒的制备方法。按照这些专利方法得到的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，虽然可以在一定程度上提高玉米醇溶蛋白的溶解性，然而玉米醇溶蛋白的溶解需要大量使用有机溶剂，容易造成有机溶剂残留。此外，蛋白纳米颗粒的粒度大于150nm，不利用人体细胞的吸收。因此，我们使用玉米醇溶蛋白的改性产物作为载体，不仅解决了上述问题，还对于研究和开发新型食品基料、改善食品的加工特性开辟了一条新的途径。本专利以玉米肽糖基化产物为例。

[0005] 玉米肽是指玉米醇溶蛋白经蛋白酶作用后，再经分离、精制等过程得到的蛋白质的水解产物。它改善了玉米醇溶蛋白的水不溶性，在酸性条件下不易凝聚，具有较强的乳化性。此外，肽和多糖通过接枝形成的共聚物具有优越的乳化特性、溶解性和热稳定性，抗氧化作用。目前，关于玉米肽糖基化产物在包埋脂溶性维生素的应用还未见相关专利和报道。

发明内容

[0006] 为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒的制备方法；该方法既能保持脂溶性维生素固有的性质，又克服了其不溶于水、生物利用率低的缺点。

[0007] 本发明的另一目的在于提供上述方法制备的高品质（包埋率高、粒度小、溶解性好、稳定性高）的玉米肽糖基化产物纳米颗粒。

[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0009] 一种包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤和工艺条件：

[0010] （1）将玉米肽和多糖分别溶于10～20mM磷酸盐缓冲液，搅拌均匀；所述多糖为麦芽糊精；控制玉米肽溶液和多糖溶液的浓度均为50～100mg/mL；

[0011] （2）将玉米肽溶液和多糖溶液混合，调节pH值至7.4～7.6，搅拌均匀，然后冷冻干燥；

[0012] （3）将步骤（2）所得的干燥粉末放于密闭干燥器中，在温度为55～65℃条件下进行干热反应4～7天；

[0013] （4）将步骤（3）所得的固体溶解于去离子水中，搅拌均匀，离心，取上清，冷冻干燥，干燥的粉末存放在冰箱中，得到玉米肽糖基化产物；

[0014] （5）将步骤（4）所得的糖基化产物溶解于去离子水中，控制溶液中肽浓度为0.5～5mg/mL，搅拌均匀，调节pH至7～3；

[0015] （6）将脂溶性维生素溶解于无水乙醇中，控制浓度为1～10mg/mL，搅拌均匀；

[0016] （7）将步骤（6）所得脂溶性维生素乙醇溶液滴加至步骤（5）所得溶液中，搅拌1～2h；所得溶液中脂溶性维生素与玉米肽的质量比为1:10～1:50；

[0017] （8）将步骤（7）所得的溶液旋转蒸发后，放置在冰箱或冷冻干燥密封保存，得到包埋脂溶性维生素的玉米肽糖基化产物纳米颗粒。

[0018] 优选地，所述脂溶性维生素为维生素E或维生素D。所述的磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠‐磷酸氢二钠缓冲液，pH值为7.5。所述的干热反应的相对湿度为79%。所述离心为10000r/min条件下离心15min。步骤（2）和（5）所述的pH通过用0.1mol/L盐酸或氢氧化钠进行控制。所述的旋转蒸发温度为45～55℃，真空度0.1MPa，时间5～10min。所述的冰箱的温度为3～6℃。

[0019] 本发明采用反溶剂法制备复合纳米颗粒。当脂溶性维生素乙醇溶液加到玉米肽糖基化产物水溶液中，由于疏水相互作用，脂溶性维生素与玉米肽相互聚集，形成纳米颗粒，同时将脂溶性维生素包埋其中。此时，糖基化产物的糖链形成亲水外壳，从而获得粒径较小、溶解性好、稳定性高的复合纳米颗粒。

[0020] 相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

[0021] （1）本发明不需要引入任何除乙醇之外的其他有机溶剂，并且乙醇的引入量不超过溶液总体积的5%，旋转蒸发后的最终产品乙醇含量不超过总体积的0.1%。同时，该方法不需要添加助溶剂、乳化剂或常规的表面活性剂。

[0022] （2）本发明提供一种玉米肽糖基化产物纳米颗粒的制备方法。玉米肽与麦芽糊精发生美拉德反应，提高了玉米肽的溶解性。同时，由于糖链的引入，玉米肽糖基化产物分子间的空间阻力较大，阻止了分子间聚集，可以有效地提高纳米颗粒的稳定性。因此，本发明纳米颗粒可长时间稳定地存在于液体中，且干燥后复溶性良好。

[0023] （3）本发明制备的纳米颗粒包埋率高，粒径小于150nm，多分散性小于0.3，其溶液外观具有较好的透明度。

[0024] （4）本发明制备的纳米颗粒在较宽的pH值范围内仍可保持溶解状态，酸性条件下不易凝聚。可应用于乳制品及饮料的生产加工中。

附图说明

[0025] 图1是实施例1包埋维生素E的玉米肽糖基化产物纳米颗粒的原子力图，扫描范围1μm×1μm。

具体实施方式

[0026] 以下结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

[0027] 实施例1

[0028] 将2g玉米肽和2g麦芽糊精分别溶于20mL20mM、pH7.5磷酸二氢钠‐磷酸氢二钠缓冲液中，500rpm搅拌2h；将两种溶液按体积比1:1混合后，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH值至7.5，500rpm搅拌2h，然后冷冻干燥；将干燥粉末放于密闭干燥器中，在相对湿度79%、温度60℃条件下反应4天；所得固体溶解于40mL去离子水中，500rpm搅拌2h，10000rpm离心15min，取上清液，冷冻干燥，干燥的粉末存放在4℃冰箱，得到玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物，其中玉米肽与麦芽糊精质量比为1:1。

[0029] 将80mg玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物溶解于19.2mL去离子水中，500rpm搅拌1，用0.1mol/L盐酸调节pH5；将20mg维生素E溶解于10mL无水乙醇中，500rpm搅拌30min；取0.8mL维生素E乙醇溶液，逐滴加到玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物水溶液中，搅拌1h，在
50℃、0.1MPa真空度下旋转蒸发6min，得到包埋维生素E的玉米肽糖基化产物纳米颗粒。

[0030] 玉米肽糖基化反应主要发生在肽分子中的游离氨基与糖分子的还原末端羰基之间。随着反应的进行，肽的游离氨基逐渐减少，尤其赖氨酸和精氨酸的含量明显降低，蛋白质发生共聚或交联。本发明用OPA法测得的玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物的接枝度（DG）为36.3%±2.12，表明在干热反应后玉米肽的游离氨基减少。通过氨基酸分析，发现玉米肽赖氨酸含量由1.20%减少到0.77%。说明玉米肽能与麦芽糊精发生共价结合，形成糖基化产物。

[0031] 由图1可见，包埋维生素E的玉米肽糖基化产物纳米颗粒粒度分布在70～120nm范围内。中间颜色较亮的部分可能是玉米肽自组装形成的球形颗粒，周围颜色较浅的部分可能是麦芽糊精。

[0032] 对比实施例1

[0033] 将40mg玉米肽溶解于19.2mL去离子水中，500rpm搅拌1h，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH5；将20mg维生素E溶解于10mL无水乙醇中，500rpm搅拌30min；取0.8mL维生素E乙醇溶液，逐滴加入玉米肽水溶液中，搅拌1h，在50℃、0.1MPa真空度下旋转蒸发6min，得到包埋维生素E的玉米肽纳米颗粒。

[0034] 表1糖基化产物纳米颗粒与玉米肽纳米颗粒的性质对比

[0035]

[0036] 由表1可见，对比实例1中玉米肽纳米颗粒粒度较大，电位较低，稳定性差，包埋率低。而实施例1中玉米肽糖基化产物粒度仅为88nm左右，PDI值和电位均较理想。这说明了糖基化对于玉米肽纳米颗粒的性质具有显著的改善作用。另外，玉米肽糖基化产物纳米颗粒的维生素E包埋率明显高于玉米肽纳米颗粒，表明玉米肽糖基化产物对于维生素E具有较好的包埋效果。

[0037] 表1中所采用的分析检验方法如下：

[0038] 粒度、PDI与电位的测定：采用Nano‐ZS&MPT‐2zeta电位及纳米粒度分布仪。取液体样品，用去离子水稀释至浓度为1mg/mL，于温度25°C进行测量，取三次测量平均值。

[0039] 包埋率的测定：

[0040] 由于脂溶性维生素易溶于石油醚，而玉米肽、麦芽糊精及玉米肽糖基化产物不溶，因此可以用石油醚萃取冻干颗粒表面附着的脂溶性维生素。按照紫外分光光度法，将维生素E石油醚溶液稀释成系列浓度，以石油醚作空白，于298nm最大吸收波长处测定吸光值，以吸光值A为纵坐标、质量浓度C(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线方程2
y=0.0084x‐0.0008，R=0.9995。

[0041] 称取10mg的冻干纳米颗粒，加4mL石油醚（沸程60℃‐90℃）萃取，磁力搅拌10min，0.22μm有机膜过滤，除去不溶物。重复萃取三次，合并萃取液。以石油醚为空白，在298nm下测定表面附着维生素E的吸光度A，根据标准曲线方程y=0.0084x‐0.0008，
2
R=0.9995，算出复合颗粒表面附着维生素E量。维生素E包埋率(%)=（加入维生素E量‐表面附着维生素E)÷加入维生素量E×100%。

[0042] 实施例2

[0043] 将1g玉米肽和1g麦芽糊精分别溶于20mL10mM、pH7.5磷酸二氢钠‐磷酸氢二钠缓冲液中，500rpm搅拌1h；将两种溶液按体积比2:1混合后，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH7.5，500rpm搅拌2h，然后冷冻干燥；将干燥粉末放于密闭干燥器中，在相对湿度79%、温度65℃条件下反应5天；所得固体溶解于20mL去离子水中，500rpm搅拌2h，10000rpm离心15min，取上清冷冻干燥，干燥的粉末存放在4℃冰箱，得到玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物，其中玉米肽与麦芽糊精质量比为2:1。

[0044] 将120mg玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物溶解于19.0mL去离子水中，500rpm搅拌2h，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH6；将50mg维生素D溶解于10mL无水乙醇中，500rpm搅拌40min；取1mL维生素D乙醇溶液，逐滴加到玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物水溶液中，搅拌2h，在45℃、0.1MPa真空度下旋转蒸发8min，得到包埋维生素D的玉米肽糖基化产物纳米颗粒。

[0045] 对比实施例2

[0046] 将80mg玉米肽与40mg麦芽糊精，一起溶解于19.0mL去离子水中，500rpm搅拌2h，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH6；将50mg维生素D溶解于10mL无水乙醇中，500rpm搅拌
40min；取1mL维生素D乙醇溶液，逐滴加入玉米肽/麦芽糊精混合物水溶液中，搅拌2h，在
45℃、0.1MPa真空度下旋转蒸发8min，得到包埋维生素D的玉米肽/麦芽糊精混合物纳米颗粒。

[0047] 表2糖基化产物纳米颗粒与混合物纳米颗粒的性质对比

[0048]

[0049]

[0050] 由表2可见，实施例2中糖基化产物纳米颗粒粒径为110nm左右，明显小于对比实例2中混合物纳米颗粒，且前者的电位和包埋率都高于后者。这说明了糖基化产物比玉米肽/麦芽糊精混合物具有更好的乳化性和空间稳定性，从而获得粒度更小，更稳定的复合颗粒。

[0051] 实施例3

[0052] 将2g玉米肽和2g麦芽糊精分别溶于20mL10mM、pH7.5磷酸二氢钠‐磷酸氢二钠缓冲液中，500rpm搅拌2h；将两种溶液按体积比1:2混合后，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH7.5，500rpm搅拌2h，然后冷冻干燥；将干燥粉末放于密闭干燥器中，在相对湿度79%、温度55℃条件下反应6天；所得固体溶解于40mL去离子水中，500rpm搅拌2h，10000rpm离心15min，取上清冷冻干燥，干燥的粉末存放在4℃冰箱，得到玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物，其中玉米肽与麦芽糊精质量比为1:2。

[0053] 将60mg玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物溶解于19.5mL去离子水中，500rpm搅拌1h，用0.1mol/L盐酸调节pH5；将40mg维生素E溶解于10mL无水乙醇中，500rpm搅拌35min；取0.5mL维生素E乙醇溶液，逐滴加入玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物水溶液中，搅拌1h，在
50℃、0.1MPa真空度下旋转蒸发5min，得到包埋维生素E的玉米肽糖基化产物纳米颗粒。

[0054] 本实施例对不同维生素E添加量所得纳米颗粒进行性质测试。保持溶液中玉米肽含量不变，玉米肽与维生素E的质量比为10:1、15:1、20:1、25:1、30:1，即维生素E乙醇溶液的加入量为0.5mL、0.33mL、0.25mL、0.20mL、0.17mL，其他条件不变，结果如表3所示。

[0055] 表3不同维生素E添加量的纳米颗粒的性质

[0056]

[0057] 由表3可见，随着维生素E添加量的增加，玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物颗粒粒度增大，但仍保持在105nm以下的纳米尺度。这说明玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物体系十分稳定，保持在纳米尺度，能够加载大量的维生素E。

[0058] 实施例4

[0059] 将1g玉米肽和1g麦芽糊精分别溶于20mL20mM、pH7.5磷酸二氢钠‐磷酸氢二钠缓冲液中，500rpm搅拌1h；将两种溶液按体积比1:1混合后，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH7.5，500rpm搅拌2h，然后冷冻干燥；将干燥粉末放于密闭干燥器中，在相对湿度79%、温度60℃条件下反应4天；所得固体溶解于20mL去离子水中，500rpm搅拌2h，10000rpm离心15min，取上清冷冻干燥，干燥的粉末存放在4℃冰箱，得到玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物，其中玉米肽与麦芽糊精质量比为1:1。

[0060] 将40mg玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物溶解于19.2mL去离子水中，500rpm搅拌1h，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH7；将25mg维生素E溶解于10mL无水乙醇中，500rpm搅拌
30min；取0.8mL维生素E乙醇溶液，逐滴加入玉米肽‐麦芽糊精糖基化产物水溶液中，搅拌
1h，在50℃、0.1MPa真空度下旋转蒸发6min，得到包埋维生素E的玉米肽糖基化产物纳米颗粒。

[0061] 本实施例对比不同pH所得纳米颗粒进行性质测试。溶液中pH依次为7、6、5、4、3，其他条件不变，结果如表4所示。

[0062] 表4不同pH的纳米颗粒的性质

[0063]

[0064] 由表4可见，当pH值为5～7时，纳米颗粒的粒度分布在150nm以下，并且在pH5处粒径最小，溶液十分澄清透明。随着pH从5降低到3，纳米颗粒的粒径有一定程度的增大，但不超过360nm，溶液无肉眼可见沉淀。结果表明，糖基化产物纳米颗粒具有良好的pH稳定性，可能因为糖基化反应有效避免了玉米肽在酸性条件下聚集的产生。