一种从蜜蜂球囊菌中提取没药烷倍半萜的方法

摘要

本发明公开了一种从蜜蜂球囊菌中提取新没药烷倍半萜的方法，包括：1)活化菌株；2)初级培养；3)次级培养；4)减压抽滤得到菌液，菌液乙酸乙酯萃取；5)旋蒸浓缩；6)多次进行200~300目硅胶柱层析，经EI-MS、NMR、HMBC、NOESY谱图分析证明新没药烷倍半萜Ⅰ首次在该菌种代谢物中提取到。

权利要求

1.一种从蜜蜂球囊菌中提取没药烷倍半萜的方法，其特征在于：所述的没药烷倍半萜如式I所示：

I；

所述的提取包括以下步骤：

1）将蜜蜂球囊菌活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在140 r/min、25℃条件下培养

4天，按10％接种量再次转接到PDB培养基中，在160 r/min、25℃条件下继续培养7天；

2）抽滤得到菌液，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液旋蒸得菌液浸膏；

3）将菌液浸膏上200-300目硅胶柱，进行粗分，先用石油醚洗脱，再之后换二氯甲烷：丙酮体积比=8:1和二氯甲烷：丙酮体积比5:1洗脱：收集并合并两部分的洗脱液，旋蒸浓缩；

4）将步骤3）中得到的浓缩物继续上200-300目硅胶柱，以二氯甲烷：丙酮体积比=30:1梯度洗脱，收集二氯甲烷：丙酮体积比=10:1部位洗脱液，旋蒸浓缩；

5）将步骤4）中得到的浓缩物进一步上200~300目硅胶柱，先以石油醚洗脱，之后换石油醚：丙酮体积比=8：1梯度洗脱，最后以乙酸乙酯：丙酮体积比=5:1梯度洗脱，收集乙酸乙酯：丙酮体积比=3:1部位洗脱液，旋蒸浓缩，得到无色针状没药烷倍半萜。

2.根据权利要求1所述的从蜜蜂球囊菌中提取没药烷倍半萜的方法，其特征在于：所述步骤1）中接种菌块的大小为0.5×0.5cm，接种量为4块。

说明书

一种从蜜蜂球囊菌中提取没药烷倍半萜的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从蜜蜂球囊菌中提取新没药烷倍半萜的方法。

背景技术

[0002] 蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis) 是以异宗配合的真菌。由于它能引起蜜蜂白垩病的发生，并且在蜜蜂幼虫时期发生率极高，导致蜜蜂幼虫极高的死亡率，这使得它的次生代谢产物在养蜂行业成为潜在的应用。随着研究的深入，近年来人们发现蜜蜂球囊菌的代谢产物具有抗氧化、抗菌等生物活性，这预示该菌在养蜂行业或医药上存在很大应用价值。

[0003] 蜜蜂球囊菌的代谢产物中含有亚麻油酸、萜类化合物、等多种具有抗炎、抗菌等活性物质，因此，充分开发利用蜜蜂球囊菌，将有利于蜜蜂行业的发展。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种从蜜蜂球囊菌中提取新没药烷倍半萜的方法，以促进其在养蜂行业药理学的研究和作为先导化合物的开发和应用。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0006] 本发明所用的蜜蜂球囊菌为蜜蜂球囊菌(梁勤，陈大福，王建鼎. 营养生态条件对蜜蜂球囊菌生长及产孢的影响. 中国生态农业学报, 2001, 9(4): 31-34)；

[0007] 从蜜蜂球囊菌中提取新没药烷倍半萜Ⅰ的方法包括以下步骤：

[0008] 1）将蜜蜂球囊菌活化后，取菌块接种PDB培养基中，在140 r/min、25℃条件下培养4天，按10％接种量再次转接到PDB培养基中，在160 r/min、25℃条件下继续培养7天。

[0009] 2）抽滤得到菌液，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液旋蒸得菌丝体浸膏。

[0010] 3）将菌液浸膏上200~300目硅胶柱，进行粗分。先用石油醚洗脱，之后换石油醚：二氯甲烷体积比=8:1和石油醚：二氯甲烷体积比=5:1洗脱，TLC点板后将石油醚：二氯甲烷体积比=8:1和石油醚：二氯甲烷体积比=5:1合并收集该部位洗脱液，旋蒸浓缩；

[0011] 4）将步骤3）中得到的浓缩物继续上200~300目硅胶柱，以石油醚：丙酮体积比=30:1梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=10:1部位洗脱液，旋蒸浓缩。

[0012] 5）将步骤4）中得到的浓缩物进一步上200~300目硅胶柱，先以石油醚洗脱，之后换石油醚：丙酮体积比=8:1梯度洗脱，最后以乙酸乙酯：丙酮体积比=5:1梯度洗脱，收集乙酸乙酯：丙酮体积比=3:1部位洗脱液，旋蒸浓缩，经EI-MS、NMR、HMBC谱图分析证明为新没药烷倍半萜Ⅰ。

[0013] 所述PDB培养基的制备为：马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min，6层纱布过滤，称取20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1000 mL，pH自然。高压灭菌121℃，20min。

[0014] 所述步骤1）中接种菌块的大小为0.5×0.5cm，接种量为4块。最后菌液乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分共得0.7818g。

[0015] 本发明的显著优点在于：本发明以繁殖快、周期短的真菌为材料，成本低，操作简单，重复性好，无需昂贵的仪器，通过多次进行硅胶柱层析，提取到新没药烷倍半萜Ⅰ。

附图说明

[0016] 图1是化合物的TLC。

[0017] 图2是化合物的的1H NMR谱。

[0018] 图3是化合物的13C NMR谱。

[0019] 图4是化合物的DEPT 135谱。

[0020] 图5是化合物的EI-MS谱。

[0021] 图6是化合物的HMBC谱。

[0022] 图7是化合物的COSY谱。

[0023] 图8是化合物的NOESY谱。

[0024] 图9是化合物的结构。

具体实施方式

[0025] 实施例1：

[0026] 新没药烷倍半萜的制备

[0027] 1）将蜜蜂球囊菌(梁勤，陈大福，王建鼎. 营养生态条件对蜜蜂球囊菌生长及产孢的影响. 中国生态农业学报, 2001, 9(4): 31-34) 活化后，以0.5×0.5cm（4块）接种于 PDB培养基（马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min，6层纱布过滤，称取20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1000mL，pH自然。分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，高压灭菌121℃，20min。）中，在160r/min、25℃条件下连续培养4天即初级培养，按10％接种量再次转接到PDB培养基中，继续在160r/min、25℃条件下连续培养7天即次级培养；

[0028] 2）减压抽滤得到菌液，用乙酸乙酯萃取，重复3次。合并萃取液，旋蒸得菌液浸膏。

[0029] 3）将菌液浸膏上200~300目硅胶柱，进行粗分。先用石油醚洗脱，再之后换二氯甲烷：丙酮体积比=8:1和二氯甲烷：丙酮体积比5:1洗脱，TLC点板后确认两部分洗脱液洗脱成分相同，将两部分合并收集该部位洗脱液，旋蒸浓缩；

[0030] 4）将3）中得到的浓缩物继续上200~300目硅胶柱，以石油醚：丙酮体积比=30:1梯度洗脱，收集石油醚：丙酮体积比=10:1部位洗脱液，旋蒸浓缩。

[0031] 5）将4）中得到的浓缩物进一步上200~300目硅胶柱，先以石油醚洗脱，之后换石油醚：丙酮体积比=8:1梯度洗脱，最后以乙酸乙酯：丙酮甲烷体积比=5:1梯度洗脱，收集乙酸乙酯：丙酮体积比=3:1部位洗脱液，旋蒸浓缩，经HREIMS、NMR、HMBC谱图分析证明为新没药烷倍半萜Ⅰ。

[0032] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。