包括3177G>A突变的CYP2D6基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用转让专利
申请号 : CN201310403482.0
文献号 : CN103451209B
文献日 : 2015-09-16
发明人 : 蔡剑平 , 胡国新 , 戴大鹏 , 耿培武 , 蔡杰
申请人 : 蔡剑平
摘要 :
权利要求 :
1.核酸片段,所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.1的第3177位的突变位点,且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其反向互补序列,其中第3177位的核苷酸是A;或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.2的第1006位的突变位点,且是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其反向互补序列,其中第1006位的核苷酸是A。
2.根据权利要求1所述的核酸片段,其特征在于,所述核酸片段的长度是10-100、
101-200、201-500或501-1000个核苷酸。
3.根据权利要求1所述的核酸片段,其特征在于,所述核酸片段的长度是10-20、
21-30、31-40、41-50、51-60、61-100或101-300个核苷酸。
4.根据权利要求1所述的核酸片段,其特征在于,所述核酸片段是SEQ ID NO.1、2或
14-18所示的序列。
5.一种用于检测和/或分析单碱基突变的试剂盒,包括根据权利要求1-4任一项所述的核酸片段,或包含能够作为引物扩增所述单碱基突变但不包含该单碱基的核酸片段,所述单碱基对应于SEQ ID NO.1的第3177位或SEQ ID NO.2的第1006位。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.12所示的序列片段。
7.根据权利要求1-4任一项所述的核酸片段在制备检测CYP2D6基因突变的药物中的应用;或者用作检测CYP2D6基因突变的检验标志物的应用。
8.CYP2D6蛋白或其片段或变异体,所述蛋白序列为SEQ ID NO.3所示的序列;所述片段或变异体包含对应于SEQ ID NO.3的第336位的天冬酰胺,且为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。
说明书 :
包括3177G>A突变的CYP2D6基因片段、所编码的蛋白质片
段及其应用
技术领域
点的试剂、检测方法和鉴定该位点在指导用药中的应用。
背景技术
1620-5909位)。人体内该细胞色素的量只占肝脏酶总量的2%~4%,却参与临床上20%~
30%药物的代谢,这样药物包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药、镇痛药、止咳药、止吐药、抗糖尿病药及β受体阻滞药等,研究其代谢多态性具有十分重要的临床应用价值(参
见参考文献1)。
发现的突变型尚未被命名(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm)。每个等位基因
都不同程度涉及点突变、缺失、插入、重排等,从而影响CYP2D6的活性,进而影响对药物的代谢活性,产生不同程度的药物效应。除去野生型CYP2D6*1外,目前研究较多且临床意
义较大的突变型主要包括以下7种:CYP2D6*2、*3、*4、*5、*10、*17、*41,其中人种分布最广、研究最多、中国人群研究资料相对最丰富的突变型是CYP2D6*2(2850C>T;4180G>C)和CYP2D6*10(100C>T;4180G>C)(参见参考文献1、2、3)。
异,甚至产生严重的药物毒副作用或治疗不充分。因此,研究CYP2D6基因多态性对药物疗
效的影响将对临床合理用药提供重要的科学依据(参见参考文献3、4)。
发明内容
中第3177位的核苷酸是A;或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.2的第1006位的突
变位点,且是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸,其中第1006位的
核苷酸是A;或者所述核酸片段为上述核酸片段的反向互补序列。
位基因特异性寡核苷酸,其中SEQ ID NO.1的第3177位或SEQ ID NO.2的第1006位的突
变位点的核苷酸是A;所述等位基因片段是SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序
列中的至少10个连续核苷酸或其反向互补序列。
所述单碱基突变但不包含该单碱基的核酸片段;所述单碱基对应于SEQ ID NO.1的第3177
位或SEQ ID NO.2的第1006位。
核苷酸用于制备检测CYP2D6基因突变的药物的应用;或者本发明的核酸片段或寡核苷酸
用作检测CYP2D6基因突变的检验标志物的应用。
的突变,调整由CYP2D6代谢的药物的给药量。
含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中对应于第1006位的核苷酸。
并且为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的至少10个 连续氨基酸。
冬氨酸突变为天冬酰胺,即对应于SEQ ID NO.3的第336位的天冬酰胺。该突变的CYP2D6
蛋白(命名为D336N)对药物的代谢活性与野生型相比降低。该单碱基突变对携带此突变位点的个体的用药具有指导意义。
附图说明
具体实施方式
CYP2D6等位基因的第1位(起始密码子的第一个碱基A位于M33388序列的第1620位),则
本发明确定的突变点位于CYP2D6 等位基因的第3177位(SEQ ID NO.1)。
上对该突变位点进行检测。本申请中,SEQ ID NO.1是根据国际P450等位基因命名委员会
的规定定义的本发明的CYP2D6等位基因序列,其中第3177位是本发明涉及的突变位点。
SEQ ID NO.2是具有所述突变位点的CYP2D6基因的cDNA序列,其中第1006位是本发明涉
及的突变位点。本领域技术人员可知,在本文中,对应于SEQ ID NO.1的第3177位位点和
对应于SEQ ID NO.2的第1006位位点同义互用。
此外,由该突变的CYP2D6基因编码的蛋白的第336位由天冬氨酸突变为天冬酰胺(D336N)。
第3177位的核苷酸是A;或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.2的第1006位的突变
位点,且是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸,其中第1006位的核
苷酸是A;或者为上述核酸片段的反向互补序列。
61-100或101-300个核苷酸。
位基因特异性寡核苷酸,其中SEQ ID NO.1的第3177位或SEQ ID NO.2的第1006位的突
变位点的核苷酸是A;所述等位基因片段是SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序
列中的至少10个连续核苷酸或其反向互补序列。
补,只要能与靶序列特异杂交即可。在优选的实施方案中,所述杂交条件可以满足使探针仅与靶序列特异性杂交。所述探针的长度可以是5-100个核苷酸,如5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、
60、70、80、90或100个核苷酸。所述突变位点可以出现在探针的任何位置。在优选的实施方式中,所述突变位点出现在探针序列的中心或大约中心处。
DNA合成。所述引物的长度可以是15-40个核苷酸长度,优选地为18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29或30个核苷酸。所述突变位点可以出现在所述引物的任何位置;优选地,所述突变位点出现在所述引物的3’末端。
所述单碱基突变但不包含该单碱基的核酸片段;所述单碱基对应于SEQ ID NO.1的第3177
位或SEQ ID NO.2的第1006位。优选地,所述试剂盒包含SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.7
和/或SEQ ID NO.12所示的序列片段。
用作检测CYP2D6基因突变的检验标志物的应用。
因在对应于SEQ ID NO.1的第3177位或SEQ ID NO.2的第1006位的位点为A时,相对应
地调整经CYP2D6代谢的药物的给药量。在具体的实施例中,当CYP2D6基因在SEQ ID NO.2
的第1006位的位点为A时,该基因编码的CYP2D6蛋白酶活性下降,故需要调整经CYP2D6
代谢的药物的给药量,如下调给药量。
含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中对应于第1006位的核苷酸。
的核苷酸或包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中的对应于第1006位的核苷酸是否为
A。测序法可以是本领域已知的任何可用 的测序方法。测序引物可以根据本领域技术人员
的常识进行设计,如在待检测位点的上下游适当位置处设计引物,以扩展包含该待测位点
的片段,从而判断该位点的核苷酸。也可以采用本发明的寡核苷酸作为引物序列。
ID NO.2的序列的核酸中对应于第1006位的核苷酸是否为A;所述方法中采用的探针是本
发明的寡核苷酸。例如,从待测样品中分离出核酸,在允许探针与核酸中可能存在的特异性靶序列杂交的条件下使探针与核酸接触;可被检测的杂交可以通过使用由可检测的试剂标
记过的探针来实现;例如,用放射性同位素、荧光染料或能催化形成可检测产物的酶来标记探针。标记探针、用标记探针检测样品中是否存在靶序列的方法都是本领域技术人员所熟
知的。
因。
DNA或RNA为目标物。本领域技术人员可知,当以DNA为检测目标物时,分析待测样品中的
包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第3177位的核苷酸,所使用的探针或引物
根据SEQ ID NO.1的序列设计;当以RNA为检测目标物时,分析待测样品中的包含对应于
SEQ ID NO.2的序列的核酸中对应于第1006位的核苷酸,所使用的探针或引物根据SEQ ID
NO.2的序列设计。
且为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸,如10-20、21-50或51-100
个氨基酸。
性2分钟,94℃变性30秒,60℃退火30秒,68℃延伸3分钟,35个循环后再延伸3分钟。引
物序列信息见表1。
外显子1 AGGAAGCAGGGGCAAGAAC(SEQ ID NO.8)
外显子2 CGCCCTCTCTGCCCAGC(SEQ ID NO.9)
外显子3&4 TTGGAGTGGGTGGTGGA(SEQ ID NO.10)
外显子5&6 AGGARGTYAGGCTTACAGGA(SEQ ID NO.11)
外显子7 GCACAGGCTTGACCAGGAT(SEQ ID NO.12)
外显子8&9 TGTTTGGTGGCAGGGGTCC(SEQ ID NO.13)
中R表示G和A杂合)。该突变位于CYP2D6基因的第7外显子内,突变点位于cDNA第1006
位,据此推断该CYP2D6基因编码的蛋白质中,第336位氨基酸由天冬氨酸(D)突变为天冬
酰胺(N)。
方法:分离样品中的核酸,在本实施例中对应的实验条件下进行扩增反应,引物使用引物对SEQ ID NO.6和7;用测序引物SEQ ID NO.12对扩增的产物进行测序;将测序结果与野生型
结果比对,分析对应于SEQ ID NO.1的第3177位位点的核苷酸。
可以代表对其它底物药的代谢活性。从而,根据某一基因型所表达的酶对特异性底物代谢
活性数据可以类推该基因型所表达的酶对其它底物药的代谢活性(如,可以将该基因型所
表达的酶的代谢活性与野生型所表达的酶的代谢活性进行比较)。
尔,经孵育后,通过分析底物和代谢产物量来检测该突变型CYP2D6蛋白的体外代谢活性,
以判断与野生型CYP2D6.1相比,其酶促代谢活性是否发生改变。该实验设计类似于我们在
CYP2C9新突变体体外药代活性分析时的操作步骤,其科学性已被国际药物基因组学领域最
权威的杂志Pharmacogenomics J认可(见参考文献5)。
cDNA。定点诱变技术是本领域公知技术,本领域技术人员根据确定的模板和目标,可以毫无疑义地知道如何完成该步骤。将经检测序列正确的各目的基因及内参基因Gluc(一种分泌
型荧光素酶,其翻译产物可分泌到培养基中,并通过特定试剂盒检测到荧光信号;其骨架载体是pIRES pGluc-Basic,购自NEB公司,货号N8082S)分别连接至双基因表达载体pIRES
(购自Clontech公司,货号631605)的A、B多克隆位点中,使一种目的基因和内参基因位于同一CMV启动子控制下,最终获得双基因表达载体pIRES-Gluc-2D6(结构示意图谱见图2)。
构建分别包括CYP2D6(*1)cDNA、CYP2D6*2cDNA、CYP2D6*10cDNA和本发明的D336N突变体
的cDNA的四种CYP2D6双基因表达载体。
pIRES-Gluc-2D6,以表达各种目的蛋白CYP2D6及内参蛋白Gluc。转染24h后进行western
杂交检测,确定上述四种目的蛋白已正确表达。
公司)来检测该酶的活性,该药的终浓度为10μM。在37℃下,在5%CO2培养箱中,300rpm震荡孵育3h。从CO2培养箱中取出培养物,加入20μL的0.1M NaOH并震荡涡旋1min(原因是
丁呋洛尔是弱碱,溶液用NaOH碱化后将以分子形态存在,在下一步萃取过程中容易进入有
机相从而被萃取出来)。加入800μL冰乙酸乙酯,震荡涡旋2min后置于-40℃冰箱30min,
直至下层冰冻。取出样品,在4℃下,以12000g离心10min。将上层乙酸乙酯转移至新的EP
管中,在37℃氮吹仪上将乙酸乙酯吹干。加入200μL各自初始流动相溶液复溶,震荡涡旋
1min后以12000g离心5min。上清使用初始流动相溶液按1:10稀释后转移至进样瓶中。
0.01 30 70
0.8 5 95
3 5 95
4.01 30 70
10 30 70
[产物/(产物+底物)]来表示该 探针药的代谢率,经内参Gluc数值校正后,用突变型的代谢率与野生型的代谢率的比值来表示突变型蛋白的酶活性。每种蛋白针对丁呋洛尔的体外
代谢实验重复4次,取平均值后统计结果分别见表4和图3;各种蛋白对丁呋洛尔的典型质
谱检测结果见图4。CYP2D6变异体的代谢能力越强,底物(丁呋洛尔)峰的峰面积就会越小,而产物(1’-羟基丁呋洛尔)峰的峰面积就会越大,从图中可以看出,新变异体D336N的代谢能力明显较野生型降低,也明显小于典型突变体CYP2D6.2,但大于典型突变体CYP2D6.10。
物的代谢活性明显下降,下降幅度约为90%,这一结果与已有文献基本一致,表明我们的体外检测体系获得的数据具有非常高的可信度(参见参考文献6、7)。
不良反应的发生。这种通过基因导向的药物调整对于个体差异较大的药物(如丙咪嗪、阿米替林等)更为重要。
Genomics.2008,92(3):152-158.
database.Pharmacogenomics J.2013,DOI:10.1038/tpj.2013.2.
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,27,36,39,47-51,53-55,and57).Drug Metab Dispos.2008,36:2460-2467。
GGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTGCTGAGGCTC
CCCTACCAGAAGCAAACATGGATGGTGGGTGAAACCACAGGCTGGACCAGAAGCCAGGCTGAGAAGGGGAAGCAGGT
TTGGGGGACGTCCTGGAGAAGGGCATTTATACATGGCATGAAGGACTGGATTTTCCAAAGGCCAAGGAAGAGTAGGG
CAAGGGCCTGGAGGTGGAGCTGGACTTGGCAGTGGGCATGCAAGCCCATTGGGCAACATATGTTATGGAGTACAAAG
TCCCTTCTGCTGACACCAGAAGGAAAGGCCTTGGGAATGGAAGATGAGTTAGTCCTGAGTGCCGTTTAAATCACGAA
ATCGAGGATGAAGGGGGTGCAGTGACCCGGTTCAAACCTTTTGCACTGTGGGTCCTCGGGCCTCACTGCCTCACCGG
CATGGACCATCATCTGGGAATGGGATGCTAACTGGGGCCTCTCGGCAATTTTGGTGACTCTTGCAAGGTCATACCTG
GGTGACGCATCCAAACTGAGTTCCTCCATCACAGAAGGTGTGACCCCCACCCCCGCCCCACGATCAGGAGGCTGGGT
CTCCTCCTTCCACCTGCTCACTCCTGGTAGCCCCG GGGGTCGTCCAAGGTTCAAATAGGACTAGGACCTGTAGTCT
GGGGTGATCCTGGCTTGACAAGAGGCCCTGACCCTCCCTCTGCAGTTGCGGCGCCGCTTCGGGGACGTGTTCAGCCT
GCAGCTGGCCTGGACGCCGGTGGTCGTGCTCAATGGGCTGGCGGCCGTGCGCGAGGCGCTGGTGACCCACGGCGAGG
ACACCGCCGACCGCCCGCCTGTGCCCATCACCCAGATCCTGGGTTTCGGGCCGCGTTCCCAAGGCAAGCAGCGGTGG
GGACAGAGACAGATTTCCGTGGGACCCGGGTGGGTGATGACCGTAGTCCGAGCTGGGCAGAGAGGGCGCGGGGTCGT
GGACATGAAACAGGCCAGCGAGTGGGGACAGCGGGCCAAGAAACCACCTGCACTAGGGAGGTGTGAGCATGGGGACG
AGGGCGGGGCTTGTGACGAGTGGGCGGGGCCACTGCCGAGACCTGGCAGGAGCCCAATGGGTGAGCGTGGCGCATTT
CCCAGCTGGAATCCGGTGTCGAAGTGGGGGCGGGGACCGCACCTGTGCTGTAAGCTCAGTGTGGGTGGCGCGGGGCC
CGCGGGGTCTTCCCTGAGTGCAAAGGCGGTCAGGGTGGGCAGAGACGAGGTGGGGCAAAGCCTGCCCCAGCCAAGGG
AGCAAGGTGGATGCACAAAGAGTGGGCCCTGTGACCAGCTGGACAGAGCCAGGGACTGCGGGAGACCAGGGGGAGCA
TAGGGTTGGAGTGGGTGGTGGATGGTGGGGCTAATGCCTTCATGGCCACGCGCACGTGCCCGTCCCACCCCCAGGGG
TGTTCCTGGCGCGCTATGGGCCCGCGTGGCGCGAGCAGAGGCGCTTCTCCGTGTCCACCTTGCGCAACTTGGGCCTG
GGCAAGAAGTCGCTGGAGCAGTGGGTGACCGAGGAGGCCGCCTGCCTTTGTGCCGCCTTCGCCAACCACTCCGGTGG
GTGATGGGCAGAAGGGCACAAAGCGGGAACTGGGAAGGCGGGGGACGGGGAAGGCGACCCCTTACCCGCATCTCCC
ACCCCCAGGACGCCCCTTTCGCCCCAACGGTCTCTTGGACAAAGCCGTGAGCAACGTGATCGCCTCCCTCACCTGC
GGGCGCCGCTTCGAGTACGACGACCCTCGCTTCCTCAGGCTGCTGGACCTAGCTCAGGAGGGACTGAAGGAGGAGT
CGGGCTTTCTGCGCGAGGTGCGGAGCGAGAGACCGAGGAGTCTCTGCAGGGCGAGCTCCCGAGAGGTGCCGGGGCTG
GACTGGGGCCTCGGAAGAGCAGGATTTGCATAGATGGGTTTGGGAAAGGACATTCCAGGAGACCCCACTGTAAGAAG
GGCCTGGAGGAGGAGGGGACATCTCAGACATGGTCGTGGGAGAGGTGTGCCCGGGTCAGGGGGCACCAGGAGAGGCC
AAGGACTCTGTACCTCCTATCCACGTCAGAGATTTCGATTTTAGGTTTCTCCTCTGGGCAAGGAGAGAGGGTGGAGG
CTGGCACTTGGGGAGGGACTTGGTGAGGTCAGTGGTAAGGACAGGCAGGCCCTGGGTCTACCTGGAGATGGCTGGGG
CCTGAGACTTGTCCAGGTGAACGCAGAGCACAGGAGGGATTGAGACCCCGTTCTGTCTGGTGTAGGTGCTGAATGCT
GTCCCCGTCCTCCTGCATATCCCAGCGCTGGCTGGCAAGGTCCTACGCTTCCAAAAGGCTTTCCTGACCCAGCTGGA
TGAGCTGCTAACTGAGCACAGGATGACCTGGGACCCAGCCCAGCCCCCCCGAGACCTGACTGAGGCCTTCCTGGCAG
AGATGGAGAAGGTGAGAGTGGCTGCCACGGTGGGGGGCAAGGGTGGTGGGTTGAGCGTCCCAGGAGGAATGAGGGGA
GGCTGGGCAAAAGGTTGGACCAGTGCATCACCCGGCGAGCCGCATCTGGGCTGACAGGTGCAGAATTGGAGGTCATT
TGGGGGCTACCCCGTTCTGTCCCGAGTATGCTCTCGGCCCTGCTCAGGCCAAGGGGAACCCTGAGAGCAGCTTCAAT
GATG AGAACCTGCGCATAGTGGTGGCTGACCTGTTCTCTGCCGGGATGGTGACCACCTCGACCACGCTGGCCTGGG
GCCTCCTGCTCATGATCCTACATCCGGATGTGCAGCGTGAGCCCATCTGGGAAACAGTGCAGGGGCCGAGGGAGGAA
GGGTACAGGCGGGGGCCCATGAACTTTGCTGGGACACCCGGGGCTCCAAGCACAGGCTTGACCAGGATCCTGTAAGC
CTGACCTCCTCCAACATAGGAGGCAAGAAGGAGTGTCAGGGCCGGACCCCCTGGGTGCTGACCCATTGTGGGGACGC
ATGTCTGTCCAGGCCGTGTCCAACAGGAGATCAACGACGTGATAGGGCAGGTGCGGCGACCAGAGATGGGTGACCAG
GCTCACATGCCCTACACCACTGCCGTGATTCATGAGGTGCAGCGCTTTGGGGACATCGTCCCCCTGGGTGTGACCCA
TATGACATCCCGTGACATCGAAGTACAGGGCTTCCGCATCCCTAAGGTAGGCCTGGCGCCCTCCTCACCCCAGCTCA
GCACCAGCACCTGGTGATAGCCCCAGCATGGCTACTGCCAGGTGGGCCCACTCTAGGAACCCTGGCCACCTAGTCCT
CAATGCCACCACACTGACTGTCCCCACTTGGGTGGGGGGTCCAGAGTATAGGCAGGGCTGGCCTGTCCATCCAGAGC
CCCCGTCTAGTGGGGAGACAAACCAGGACCTGCCAGAATGTTGGAGGACCCAACGCCTGCAGGGAGAGGGGGCAGTG
TGGGTGCCTCTGAGAGGTGTGACTGCGCCCTGCTGTGGGGTCGGAGAGGGTACTGTGGAGCTTCTCGGGCGCAGGAC
TAGTTGACAGAGTCCAGCTGTGTGCCAGGCAGTGTGTGTCCCCCGTGTGTTTGGTGGCAGGGGTCCCAGCATCCTAG
AGTCCAGTCCCCACTCTCACCCTGCATCTCCTGCCCAGGGAACGACACTCATCACCAACCTGTCATCGGTGCTGAAG
GATGAGGCCGTCTGGGAGAAGCCCTTCCGCTTCCACCCCGAACACTTCCTGGATGCCCAGGGCCACTTTGTGAAGCC
GGAGGCCTTCCTGCCTTTCTCAGCAGGTGCCTGTGGGGAGCCCGGCTCCCTGTCCCCTTCCGTGGAGTCTTGCAGGG
GTATCACCCAGGAGCCAGGCTCACTGACGCCCCTCCCCTCCCCACAGGCCGCCGTGCATGCCTCGGGGAGCCCCTGG
CCCGCATGGAGCTCTTCCTCTTCTTCACCTCCCTGCTGCAGCACTTCAGCTTCTCGGTGCCCACTGGACAGCCCCGG
CCCAGCCACCATGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGAGCCCATCCCCCTATGAGCTTTGTGCTGTGCCCCGCTAG
GGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGTTGCGGCGCCGCTTCGGGGACGTGTTCAGCCTGCAGCTGGCCT
GGACGCCGGTGGTCGTGCTCAATGGGCTGGCGGCCGTGCGCGAGGCGCTGGTGACCCACGGCGAGGACACCGCCGAC
CGCCCGCCTGTGCCCATCACCCAGATCCTGGGTTTCGGGCCGCGTTCCCAAGGGGTGTTCCTGGCGCGCTATGGGCC
CGCGTGGCGCGAGCAGAGGCGCTTCTCCGTGTCCACCTTGCGCAACTTGGGCCTGGGCAAGAAGTCGCTGGAGCAGT
GGGTGACCGAGGAGGCCGCCTGCCTTTGTGCCGCCTTCGCCAACCACTCCGGACGCCCCTTTCGCCCCAACGGTCTC
TTGGACAAAGCCGTGAGCAACGTGATCGCCTCCCTCACCTGCGGGCGCCGCTTCGAGTACGACGACCCTCGCTTCCT
CAGGCTGCTGGACCTAGCT CAGGAGGGACTGAAGGAGGAGTCGGGCTTTCTGCGCGAGGTGCTGAATGCTGTCCCC
GTCCTCCTGCATATCCCAGCGCTGGCTGGCAAGGTCCTACGCTTCCAAAAGGCTTTCCTGACCCAGCTGGATGAGCT
GCTAACTGAGCACAGGATGACCTGGGACCCAGCCCAGCCCCCCCGAGACCTGACTGAGGCCTTCCTGGCAGAGATGG
AGAAGGCCAAGGGGAACCCTGAGAGCAGCTTCAATGATGAGAACCTGCGCATAGTGGTGGCTGACCTGTTCTCTGCC
GGGATGGTGACCACCTCGACCACGCTGGCCTGGGGCCTCCTGCTCATGATCCTACATCCGGATGTGCAGCGCCGTG
TCCAACAGGAGATCAACGACGTGATAGGGCAGGTGCGGCGACCAGAGATGGGTGACCAGGCTCACATGCCCTACACC
ACTGCCGTGATTCATGAGGTGCAGCGCTTTGGGGACATCGTCCCCCTGGGTGTGACCCATATGACATCCCGTGACA
TCGAAGTACAGGGCTTCCGCATCCCTAAGGGAACGACACTCATCACCAACCTGTCATCGGTGCTGAAGGATGAGGC
CGTCTGGGAGAAGCCCTTCCGCTTCCACCCCGAACACTTCCTGGATGCCCAGGGCCACTTTGTGAAGCCGGAGGCCT
TCCTGCCTTTCTCAGCAGGCCGCCGTGCATGCCTCGGGGAGCCCCTGGCCCGCATGGAGCTCTTCCTCTTCTTCACC
TCCCTGCTGCAGCACTTCAGCTTCTCGGTGCCCACTGGACAGCCCCGGCCCAGCCACCATGGTGTCTTTGCTTTCCT
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