黄曲霉菌LAMP检测引物及其可视化检测方法

摘要

本发明公开了一种黄曲霉菌 LAMP检测引物及其可视化检测方法，专用于黄曲霉菌特异检测。主要设计了一种黄曲霉菌的LAMP检测引物（包括1对外侧引物和1对内侧引物），并经过恒温扩增和加入50μM Calcein-500μM MnCl2显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形带。本发明可被用于生产实践中黄曲霉菌感染的花生和玉米等作物中黄曲霉菌的可视化检测，同时可用于自然发病的花生或玉米组织中早期诊断和病菌的监测和鉴定。

权利要求

1.一种非疾病诊断目的的黄曲霉菌LAMP 可视化检测方法，其特征在于：具体步骤如下：（1）LAMP反应体系为：外侧引物F3 5μM 和B3 5μM 各0.25μL，内侧引物FIP 40μM 和BIP 40μM 各0.25μL，12.5μL反应混合液，1μL 显色剂，1μL 8U Bst DNA 聚合酶，

25ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足到25 μL；

其中，外侧引物 F3 ：GTGAATTGCAGAATTCCGTGAAB3 ：CCTACAGAGCGGGTGACAA

内侧引物FIP ：ATGACGCTCGGACAGGCATG-ATCGAGTCTTTGAACGCACABIP ：TTGGGTCGTCGTCCCCTCTC-CCCCATACGCTCGAGGAT；

其中，反应混合液配方为40mM Tris-HCl，20mM (NH4)2SO4，20mM KCl，16 mM MgSO4，0.2% Triton X-100，1.6M Betaine，2.8 mM dNTPs；

其中，显色剂为50μM Calcein-500μM MnCl2；

（2）LAMP 反应条件：65℃温育60 min，82℃保温10min；

（3）结果判断：显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；或取2μL 扩增产物用2% 琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现则判断为阴性。

说明书

黄曲霉菌LAMP检测引物及其可视化检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种黄曲霉菌LAMP检测引物及其可视化检测方法，专用于黄曲霉菌快速可视化检测，同时可用于自然发病的花生或玉米组织中早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于有害生物检测、鉴定领域。

背景技术

[0002] 黄曲霉毒素（Aflatoxin）是黄曲霉和寄生曲霉生长繁殖过程中产生的真菌次生代谢产物，它是所有真菌毒素中对环境污染最严重，对人畜危害最大的一种毒素，具有致癌、致畸、致突变作用，主要以侵染花生、玉米、大豆、小麦、坚果等农作物及其制品为主，被其侵染的食品及饲料大部分都失去营养价值和经济价值，因此，各国为了保护国民的身体健康及农牧业的经济利益都制定了毒素的限量标准，黄曲霉毒素限量已成为农产品出口的技术壁垒。黄曲霉及其毒素污染不仅直接危害人们的健康，而且影响农作物的品质和外贸出口，所以人们一直设法采取各种措施防止其污染，可迄今为止还没有一种理想的方法。国内外研究的焦点主要集中在黄曲霉毒素的检测方法，而对产黄曲霉毒素菌的分子检测技术鲜有报道。传统曲霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性和血清学反应鉴定等，目前对黄曲霉菌的检测大多仍沿用传统的培养及鉴定方法，传统的病原菌检测技术是在分离得到病原物的基础上，通过形态学观察和柯赫氏法则来判断病原物的种类。整个过程常常需要耗费大量的劳动力和时间，一般需要几天才能完成。而且要求操作者具备专业的病原菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术，由于其耗时长，效率低，而且容易出现假阳性或假阴性结果，难以满足对黄曲霉病快速敏感诊断的实际需要，很容易错过病害防治的最佳时期。因此，建立一种快速、灵敏、准确的黄曲霉检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。

[0003] PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，然而目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了PCR检测方法的推广应用。循环恒温扩增技术（Ioop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种链式置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒温条件下（60–65℃）保温30–90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速9 10
扩增的特点，在90分钟内可将扩增10–10 倍。LAMP扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，黄曲霉菌的LAMP可视化检测国内外均未见报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的是针对现有技术中黄曲霉菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种黄曲霉菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的黄曲霉菌的可视化检测方法。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 一种黄曲霉菌LAMP检测引物，其特征在于引物序列如下：

[0007] 外侧引物 F3：GTGAATTGCAGAATTCCGTGAA

[0008] B3：CCTACAGAGCGGGTGACAA

[0009] 内侧引物 FIP：ATGACGCTCGGACAGGCATG-ATCGAGTCTTTGAACGCACA

[0010] BIP：TTGGGTCGTCGTCCCCTCTC-CCCCATACGCTCGAGGAT。

[0011] 一种利用权利要求1的引物的黄曲霉菌LAMP可视化检测方法，其特征在于： LAMP反应体系为：外侧引物F3 5μM和B3 5μM 各0.25μL，内侧引物FIP 40μM 和BIP 40 M 各0.25μL，12.5μL反应混合液，1μL 显色剂，1μL 8U BstDNA 聚合酶，25ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足到25 μL。

[0012] 其中，所述的反应混合液为40mM Tris-HCl，20mM (NH4)2SO4，20mM KCl，16 mM MgSO4，0.2% Triton X-100，1.6M Betaine，2.8 mM dNTPs。

[0013] 所述的LAMP反应条件为在65℃温育60 min，82℃保温10min。

[0014] 其中，所述的显色剂为50μM Calcein-500μM MnCl2，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；或取2μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现则判断为阴性。

[0015] 本发明方法适用于黄曲霉菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中黄曲霉菌引起的病害中病菌的检测具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

[0016] 1、结果可靠：本发明所设计出的LAMP检测引物，已经对来源不同的黄曲霉菌和带黄曲霉菌的花生、玉米组织进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证。

[0017] 2、特异性强：本发明所采用的LAMP引物是针对黄曲霉菌ITS基因序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性高。

[0018] 3、灵敏度高：LAMP对黄曲霉菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg。

[0019] 4、实用性好：本发明所设计出的LAMP引物，可用于带黄曲霉菌高灵敏度快速检测，因此本方法的实用性强，可满足对黄曲霉菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要。

[0020] 5、操作简便快速：应用本发明方法，对带黄曲霉菌的组织和土壤进行检测可在数小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。

附图说明

[0021] 图1为本发明黄曲霉菌的特异LAMP检测结果图。其中：上图为琼脂糖凝胶电泳结果，图中泳道1为黄曲霉菌，泳道2-9为其他曲霉菌、真菌和细菌菌株，泳道M为DL 2000 DNA marker；下图为荧光显色结果，离心管号与泳道号相对应。

[0022] 图2为本发明黄曲霉菌的LAMP灵敏性检测结果图。其中：上图为琼脂糖凝胶电泳结果，图中泳道1–7分别为 1ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, and 1 fg，泳道M为DL 2000 DNA marker；下图为荧光显色结果，离心管号与泳道号相对应。

具体实施方式

[0023] 以下为本发明的具体实施例，进一步说明本发明，但本发明不仅限于此。

[0024] 实施例1：LAMP引物对黄曲霉菌的特异性扩增

[0025] 1．LAMP引物的设计

[0026] 根据黄曲霉核糖体转录间隔区（ITS）序列，采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物，包括1对外引物(F3 和 B3) 和 1对内引物 (FIP 和 BIP)，引物序列分别为：

[0027] F3：5’-GTGAATTGCAGAATTCCGTGAA-3’

[0028] B3：5’-CCTACAGAGCGGGTGACAA-3’

[0029] FIP：5’-ATGACGCTCGGACAGGCATG-ATCGAGTCTTTGAACGCACA-3’

[0030] BIP：5’-TTGGGTCGTCGTCCCCTCTC-CCCCATACGCTCGAGGAT-3’

[0031] 2．基因组DNA的提取

[0032] 采用CTAB法提取包括黄曲霉在内的5种曲霉菌和17种不同真菌、细菌基因组DNA。

[0033] 具体方法如下：取50mg 冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μl 2% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液（提取液的配方为：2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）, pH 8.0；20mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠）, pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90μl 10% SDS（十二烷基苯磺酸钠）后混匀,于55～60℃水浴1.5 h,每10 min振荡混匀一次,水浴1.5h后离心（12,000rpm）15min，取上清液加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇（酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1）,离心(12,000rpm)5 min，取上清液（水相），加入与上清液等体积的氯仿抽提一次（12,000rpm）离心5min，吸上清(350μl），加0.1体积(35μl)的3mol/L NaAc溶液和2体积（700μl）的冰无水乙醇,-20℃下沉淀30min后12,000rpm离心5 min,轻轻地倒去上清液，加入700μl冰70%乙醇进行洗涤（稍离心，倾掉上清），在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE（10mmol/L Tris-HCL,0.1mmol/L EDTA,pH8.0）溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/μl待用。

[0034] 3. 黄曲霉菌的LAMP特异检测

[0035] 对供试菌株进行LAMP扩增验证。

[0036] ①LAMP反应体系25 μL：包括外侧引物F3（5μM）和B3（5μM）各0.25μL，内侧引物FIP（40μM）和BIP（40 μM）各0.25μL，12.5μL反应混合液[40mM Tris-HCL，20mM (NH4)2SO4，20mM KCL，16 mM MgSO4，0.2% Triton X-100，1.6M Betaine，2.8 mM dNTPs]，1μL50μM Calcein-500μM MnCl2，1μL（8U）BstDNA 聚合酶，25ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足到25 μL。LAMP反应条件为在65℃温育60 min，82℃保温10min。

[0037] ②在LAMP反应液中加入1μL显色剂，所述显色剂为50μM Calcein-500μM MnCl2，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

[0038] 4．检测结果

[0039] 检测的特异性结果见图1，只有第1个样品即黄曲霉菌样品出现了绿色荧光和特征性梯形带。除了不同来源的黄曲霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带外，检测了另外4种曲霉菌和17种真菌、细菌菌株显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带，说明此引物具有很强的特异性，可被用于生产实践中黄曲霉菌快速可靠的检测和鉴定。

[0040] 实施例2：LAMP引物对黄曲霉菌的灵敏性检测

[0041] 1．黄曲霉菌的LAMP灵敏性检测

[0042] 采用10倍浓度系列稀释法将提取的黄曲霉菌DNA稀释成1ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, 和 1 fg共7个不同浓度梯度。

[0043] ①LAMP反应体系25 μL：包括外侧引物F3（5μM）和B3（5μM）各0.25μL，内侧引物FIP（40μM）和BIP（40μM）各0.25μL，12.5μL反应混合液[40mM Tris-HCL，20mM (NH4)2SO4，20mM KCl，16 mM MgSO4，0.2% Triton X-100，1.6M Betaine，2.8 mM dNTPs]，1μL50μM Calcein-500μM MnCl2，1μL（8U）BstDNA 聚合酶，25ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足到25 μL。LAMP反应条件为在65℃温育60 min，82℃保温10min。

[0044] ②在LAMP反应液中加入1μL显色剂，所述显色剂为50μM Calcein-500μM MnCl2，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

[0045] 2．检测结果

[0046] 黄曲霉菌LAMP灵敏性检测结果见图2，第1~6个样品的显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，说明检测灵敏度可达10fg。