大肠埃希氏菌O104：H4多重PCR检测引物组和试剂盒

摘要

本发明公开一种大肠埃希氏菌O104：H4多重PCR检测引物组和试剂盒。所述检测O104：H4血清型和致病性基因的引物组，是由检测orfO104基因、fliCH4基因、stx1基因、stx2基因、eaeA基因和aggR基因的6个引物对组成。本发明建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法，利用分析设计得到的所述引物对，对待测样品提取的DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR产物进行电泳分析，在确定样品是否为大肠埃希氏菌O104：H4血清型的同时，确定其含有的毒力基因种类，并且能够对潜在的EAEC和EHEC的新型重组模式进行有效的检测。

权利要求

1.一种大肠埃希氏菌O104：H4多重PCR检测引物组，其特征在于，其是由检测血清型和致病性基因的引物对组成；

其中，检测血清型和致病性基因的引物对是由检测orfO104基因、fliCH4基因、stx1基因、stx2基因、eaeA基因和aggR基因的6个引物对组成；

所述检测orfO104基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；

所述检测fliCH4基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

所述检测stx1基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；

所述检测stx2基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；

所述检测eaeA基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；

所述检测aggR基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。

说明书

大肠埃希氏菌O104：H4多重PCR检测引物组和试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属微生物检测领域，涉及大肠埃希氏菌O104：H4多重快速PCR检测引物组和试剂盒。

背景技术

[0002] 2011年5月，德国发生由大肠埃希氏菌O104：H4引起的暴发疫情，并波及欧盟其他13个国家及美国、加拿大等地。由于导致此次疫情的大肠埃希氏菌的血清型比较罕见，人群普遍易感，疫情快速蔓延。直至当年7月疫情终止，共报告大肠埃希氏菌O104：H4感染病例4400余例。

[0003] 感染大肠埃希氏菌O104：H4的临床表现主要有腹部绞痛和腹泻，一些病例为血便样腹泻。多数患者10天内康复，少数患者，可出现严重并发症，如以急性肾功能衰竭、溶血性贫血和血小板减少为特点的溶血尿毒综合症(HUS)。随访发现感染O104：H4的预后较差，20%的感染者转化为HUS。一旦发生HUS，病死率将显著增高。

[0004] 此次引发疫情的大肠埃希氏菌O104：H4菌株与以往发现的致泻性大肠埃希氏菌都不一样，是一种新发现的具有强毒力的大肠埃希氏菌新变种。对O104：H4全基因组测序发现，O104：H4是肠出血性大肠埃希菌（EHEC）和肠集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）重组产生的新菌株。O104：H4既含有EAEC中介导集聚性黏附的aggR，又含有EHEC中可导致HUS的志贺样毒素2（stx2）。但与EHEC致病相关的其他毒力基因，如粘附因子基因eaeA、志贺样毒素1（stx1）在O104：H4中均未发现。其中，eaeA介导菌体粘附，stx1和stx2的致病机制类似。

[0005] 新型的大肠埃希氏菌O104：H4兼具有EAEC和EHEC的基因特性，因此具有更大危害性。O104：H4中含有的aggR，可使菌体在肠细胞表面产生集聚性黏附，抑制吸收，产生腹泻。同时其携带的志贺样毒素2（stx2），造成肠黏膜上皮细胞破坏、黏膜溃疡、出血，血管内皮细胞损伤、溶血、血小板减少。更严重的是，肾小管上皮细胞坏死、堵塞和肾小球破坏，引发溶血性尿毒综合征（HUS）和出血性结肠炎（HC）。严重者可发展为多器官功能障碍综合征，导致感染患者死亡。

[0006] O104：H4型大肠埃希氏菌主要通过被污染的食物传播，根据既往的经验，在欧美等国，被污染的碎牛肉馅和未经消毒的奶制品是一个重要的传染源，被污染的一些农产品也可以成为传染源。

[0007] 研究表明O104：H4在人群中暴发之前，已经在动物间传播达10年之久。因此开展O104：H4的主动检测，对潜在的EAEC和EHEC的新型重组模式进行探索，建立有效的暴发预警机制，对O104：H4和新型重组致病菌感染的防控有重大意义。

[0008] 采用传统方法鉴定O104：H4，如增菌培养、生化鉴定和血清凝集，需要在增菌富集后采用生化方法确定是大肠埃希氏菌，用血清凝集方法确定其O抗原和H抗原。但确定一株大肠埃希氏菌是O104：H4血清型后，因不清楚其毒力基因携带情况，仍不能判定该株菌是否为致病菌，无法确定检出是否有意义。且传统检测方法费时费力，结果受血清质量和主观判断影响大。

[0009] 除了传统方法外，已建立了一些分子生物学的检测方法。欧盟的大肠埃希氏菌参比实验室推荐使用单重实时荧光对stx2、rfbO104和fliCH4基因逐个筛查（Detection and identification of Verocytotoxin-producing Escherichia coli(VTEC)O104:H4in food by Real time PCR）。中国专利申请号201110376158.5公开了一种致泻大肠杆菌四重荧光定量PCR检测试剂盒，通过一个反应，可以从标本中检出O157：H7、和O104：H4血清型的大肠埃希氏菌的存在，但只能确定是否是O104：H4血清型的大肠埃希氏菌，并不能判定该菌是否是致病株。中国专利申请号201210068180.8公开了肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒及其使用方法，通过荧光定量PCR，检测是否含有wzy（O104）、fliC(H4)和aggR基因，从而判断待测细菌为肠出血性大肠杆菌O104:H4。中国专利申请号201110197208.3公开了一种肠出血性大肠杆菌O104:H4的多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法，检测志贺样毒素2型基因（stx2），O抗原翻转酶基因（wzx）和H4鞭毛抗原基因（fliCH4），若Stx2、wzx和fliCH4均呈阳性，则判断待测细菌为肠出血性大肠杆菌O104:H4。

[0010] 采用分子生物学方法对O104：H4的检测，多局限于普通单重PCR和荧光PCR，前者需要对相关的O抗原、H抗原编码基因以及志贺样毒素和粘附相关基因进行逐一检测，费时费力，无法满足应急检测对时限性的要求，后者荧光定量检测平台投入高，试剂昂贵，且受制于荧光通道的限制，不能将O104：H4血清型和致病相关基因系统筛查，且对潜在的EAEC和EHEC的新型重组模式无法检测，极大地限制了其在一线检测中的应用。

发明内容

[0011] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种大肠埃希氏菌O104：H4多重PCR检测引物组和试剂盒，可快速筛查大肠埃希氏菌O104：H4血清型及其致病株和重组株，建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法。

[0012] 为了实现本发明目的，本发明首先提供了设计和筛选特异性引物的技术方案及一种多重PCR检测大肠埃希氏菌O104：H4的引物组：

[0013] 1、设计阳性内对照(IAC)扩增引物和基因

[0014] 以pET28a质粒为IAC模板设计一对引物，扩增其中的1176bp大小的片段，作为检测的IAC。IAC上游引物序列为5’-TGCAGGTCGACTCTAGAGGA-3’，IAC下游引物的序列为5’-TTCGAGCTCGGTACCCGGGGA-3’。pET28a的碱基序列如SEQ ID No.15所示。

[0015] 2、筛选检测目标的基因或者DNA片段用于引物设计

[0016] 本发明通过文献分析和检测需求分析，获得了每一种待检目标的基因或者DNA片段作为扩增目标候选（见表1）。

[0017] 表1大肠埃希氏菌O104：H4多重PCR检测候选目标基因

[0018]待检目标 候选扩增基因
O104抗原 orfO104
H4抗原 fliCH4
志贺样毒素1 stx1
志贺样毒素2 stx2
粘附因子基因 eaeA
介导集聚性粘附 aggR

[0019] 3、引物候选方案设计

[0020] 本发明使用primer premier6软件针对所有扩增目标候选基因或者片段设计1-2套备用方案。

[0021] 4、对扩增目标基因的引物候选方案进行Blast分析

[0022] 在Genbank中对所有引物候选方案进行Blast分析，获得特异性较高的引物方案作为实验验证用方案，每个扩增目标会有1-3个实验验证方案。

[0023] 5、对每一个可用实验验证方案进行单重PCR验证，确定引物的可用性，包括特异性评估和敏感性评估。

[0024] 6、将所有扩增目标的引物混合进行多重PCR，验证引物共同扩增时的可用性，对不能工作的引物需要按照步骤2-4重复设计新的引物进行替换。最终获得本发明提供的一套特异的引物序列（详见表2）。

[0025] 表2大肠埃希氏菌O104：H4多重PCR引物汇总表

[0026]

[0027]

[0028] 注：虽然所选检测目标的基因或者DNA片段为保守区域，但仍有个别碱基插入或缺失的可能型，PCR产物的大小也会随之增加或减少几个bp。

[0029] 基于上述技术方案，本发明提供了一种大肠埃希氏菌O104：H4多重PCR检测引物组，其是由检测血清型和致病性基因的引物对组成；

[0030] 其中，检测血清型和致病性基因的引物对是由检测orfO104基因、fliCH4基因、stx1基因、stx2基因、eaeA基因和aggR基因的6个引物对组成；

[0031] 所述检测orfO104基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；

[0032] 所述检测fliCH4基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

[0033] 所述检测stx1基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；

[0034] 所述检测stx2基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；

[0035] 所述检测eaeA基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；

[0036] 所述检测aggR基因引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；

[0037] 本发明还提供了一种对大肠埃希氏菌O104：H4进行多重PCR检测的方法，将所述引物组与待测样品的DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR产物进行电泳分析，以确定样品是否为大肠埃希氏菌O104：H4，同时确定其含有的毒力基因种类，判定其是否为致病株和（或）重组株。

[0038] 进一步地，在进行多重PCR反应时，反应体系中还加入阳性内对照引物对。

[0039] 所述阳性内对照引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

[0040] 该方法能快速确定大肠埃希氏菌O104：H4血清型的同时，确定其是否含有与集聚性粘附和致病相关的stx1、stx2、eaeA和aggR，进而判定是否有EAEC和EHEC的新型重组模式，其实现的技术方案如下：

[0041] 1、引物合成

[0042] 按照表2中的引物序列，在基因合成公司合成所有的寡聚核苷酸序列。

[0043] 2、DNA模板提取

[0044] 选择沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、霍乱弧菌、非致泻大肠埃希氏菌、肠出血性大肠埃希菌（EHEC，O157：H7血清型）、肠集聚性大肠埃希氏菌（EAEC，O9:K99血清型）、嗜水气单胞菌和大肠埃希氏菌O104：H4（德国爆发株，aggR+，stx2+）作为建立检测方法的目标微生物，分别按照国标或者行业标准方法对相应微生物进行增菌培养，采用细菌基因组提取试剂盒提取DNA模板。

[0045] 3、使用普通PCR平台构建多重PCR检测体系

[0046] 在确定多重反应体系中引物序列后，还需要从引物浓度、退火温度、反应体系配置、反应条件等方面分别进行优化。反应体系的配置如下：

[0047] Taq DNA聚 合 酶 1-2U，5×PCR buffer（Tris·HCl100mM（PH8.3），KCl250mM，tween-200.2%）5μL，10mm 的 dNTP0.5-1.5μL，25mM 的 MgCl21-5μL，10× 引 物混合物2.5μL(包括阳性内对照在内的每个待测目标的引物浓度1μM-8μM)，pET28a0.0003-0.01ng，DNA模板2-5μL，超纯水补至25μL。多重体系的反应条件如下：

[0048] a：95℃4min；

[0049] b：95℃15-60S，

[0050] c：55-65℃15-60s，

[0051] d：72℃30-120s，b-d循环30-35个反应；

[0052] e：72℃5-10min。

[0053] 4、多重PCR产物分析和结果判定

[0054] 将5μL多重PCR产物进行电泳分析PCR产物片段大小，根据片段大小对照表2判定扩增目标基因的情况。

[0055] 5、检测体系的验证

[0056] 针对已经建立的大肠埃希氏菌O104：H4多重PCR检测方法进行特异性验证和敏感性验证。

[0057] 特异性验证：选用沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、霍乱弧菌、非致泻大肠埃希氏菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等作为特异性评估用菌株，进行核酸提取，采用前期建立和优化的反应条件，应用本发明检测试剂进行检测。

[0058] 结果表明IAC（阳性内对照）均为阳性。除IAC外，特异性验证菌株无非特异性条带扩增，重复检测结果全部一致，表明该检测方法具有较好的特异性，能够将非目标菌有效区分开。

[0059] 敏感性验证：对初始浓度为108CFU/mL的大肠埃希氏菌O104:H4和O157：H7菌液提取模板，前者验证orfO104基因、fliCH4基因、stx2基因、和aggR基因的检测敏感性，后者7 6 5
验证stx1基因和eaeA基因的检测敏感性，分别稀释到10CFU/mL，10CFU/mL，10CFU/mL，
4
10CFU/mL。采用前期建立和优化的反应条件进行检测，每种待检目标的检测限均可达到
5
10CFU/mL，重复检测结果全部一致，表明该检测方法具有高度的敏感性和良好的重复性。

[0060] 本发明还提供了一种含有前述多重PCR检测引物组的试剂盒。

[0061] 本发明的有益效果在于：

[0062] 本发明建立的大肠埃希氏菌O104：H4多重PCR检测方法，能够实现血清学、病原培养学、免疫学所无法完成的鉴定工作，克服其他分子生物学技术手段鉴定毒力基因的不足之处，达到如下的检测效果：

[0063] （一）多重检测

[0064] 本发明所建立的检测方法能够在一个PCR反应中全面筛查与EHEC和EAEC致病相关的stx1、stx2、eaeA和aggR四种毒力基因，以及O104和H4的编码基因orfO104和fliCH4，快速确定样品是否为大肠埃希氏菌O104：H4血清型和含有的毒力基因种类，判定其是否为致病株和（或）重组株。节省时间、人力和物力成本。

[0065] （二）特异性高

[0066] 本发明所建立的检测方法特异性主要体现在一整套引物的特异性，所有引物都经过Blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性验证，能够很好的区分与检测目标种属相近、生存环境相同的细菌，包括沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、霍乱弧菌、非致泻大肠埃希氏菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非目标细菌准确分辨出来。

[0067] （三）灵敏度高

[0068] 本发明所建立的检测方法能够实现对与EHEC和EAEC致病相关的stx1、stx2、eaeA和aggR四种毒力基因筛查的同时，快速确定O104：H4血清型，在每一个反应体系中每个检5
测目标的检测灵敏度可达到10CFU/mL。

[0069] （四）成本较低

[0070] 本发明所建立的多重PCR检测方法在操作性上降低了人力成本和时间成本，原来单重检测需要6次人工和6倍时间，现在使用此方法只需要1次人工和1次反应的时间；该多重检测方法同时节省了重复检测同一个样本的试剂消耗，最大可节省50%以上的试剂成本。

[0071] （五）预防假阴性结果

[0072] 体系中添加的IAC，可以有效的提示假阴性检测结果。

[0073] 本发明为大肠埃希氏菌O104:H4的血清型鉴定和毒力基因快速检测提供了完备的解决方案，能实现O104：H4暴发后和新型重组菌株出现后的快速应急检测，为尽快处置疫情节省宝贵的时间。

[0074] 综上所述，本发明提供一种多重PCR检测大肠埃希氏菌O104：H4的引物组，并建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法。本发明采用高灵敏度和特异性的引物序列，保证检测结果的质量；该检测方法操作简单，省时省力；检测通量高，试剂耗材成本低；可以对样本的增菌液进行检测，相比较于传统检测方法，能够提前24-48小时锁定可疑致病菌；对检测平台和检测人员的要求低，能够在检验检疫第一线广泛推广。

附图说明

[0075] 图1为本发明实施例2中特异性分析的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；

[0076] 其中：M:100bp DNA marker；1.aggR-1；2.aggR-2；3.aggR-3；4.阳性对照。

[0077] 图2为本发明实施例2中敏感性评估的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；

[0078] 其中：M:100bp DNA marker；1.aggR-1；2.aggR-2；3.aggR-3。

[0079] 图3为本发明实施例4中三个菌株的扩增结果；

[0080] 其中：M：100bp DNA marker；1.大肠埃希氏菌O104：H4（德国爆发株，stx2+，aggR+）；2.EHEC（O157：H7）；3.EAEC(O9:K99)；4.空白对照；5.阳性对照（1和2的混合模板）。

具体实施方式

[0081] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0082] 实施例1aggR基因引物设计与合成

[0083] 在Genbank中下载大肠埃希氏菌O104：H4aggR基因的全长序列10条，把10条aggR基因全长序列导入Mega4软件中，使用alignment功能比对分析aggR基因的保守序列，获得保守序列区段，碱基序列如SEQ ID No.16所示。

[0084] 把上述aggR的保守序列输入primer premier6软件中，自动分析获得多种引物设计方案。在此基础上手动调节引物位置和序列长度，将Tm值设定为55±5℃，GC含量35%～60%，尽可能不产生发夹结构和引物二聚体，无错误引发产生。将上述手动调节获得的引物设计方案在NCBI网站上进行Blast分析，如果其中任何引物对与非检测目标存在交叉反应，需要重新调整引物的位置和序列长度，直至获得高特异性的aggR基因引物序列。最终获得如表3的三种aggR基因引物备选方案。

[0085] 表3aggR基因引物备选方案

[0086]

[0087] 其他基因的引物设计方法与aggR基因相同。获得的引物备选方案均在invitrogen公司合成。

[0088] 实施例2aggR引物筛选试验

[0089] 特异性评估的细菌组：包括志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、非致泻大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等常见食源性致病菌。

[0090] 对上述细菌采用细菌基因组提取试剂盒提取DNA模板。将提取的模板各取5μL混匀，作为特异性验证的模板。

[0091] 大肠埃希氏菌O104：H4的特异性分析试验：使用实施例1中设计完成的引物对，按照如下项目配置PCR反应体系：Taq DNA聚合酶0.4μL（5U/μL），5×PCR buffer（Tris·HCl100mM（PH8.3），KCl250mM，tween-200.2%）5μL，dNTP1.25μL（10mM），MgCl24μL（25mM），特异性引物1μL（10μM）；特异性验证DNA模板5μL，超纯水补至25μL。按照如下反应条件进行PCR扩增：

[0092] a：95℃4min；

[0093] b：95℃30S，

[0094] c：62℃30s，

[0095] d：72℃90s，b-d循环30个反应；

[0096] e：72℃5min。

[0097] PCR扩增产物5μL使用2%琼脂糖凝胶电泳分析结果如图1所示。由图1可知，在阳性对照成立的前提下，设计的三对aggR引物aggR-1、aggR-2和aggR-3与志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、非致泻大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等生境相似、高频并存的菌均无交叉反应。因此可认为，三对引物aggR-1、aggR-2和aggR-3均具有较好的特异性。

[0098] 敏感性评估：选择O104：H4的模板，其初始浓度为108CFU/mL，梯度稀释到105CFU/mL，作为aggR引物敏感性评估的模板。体系配置如下：Taq DNA聚合酶0.4μL（5U/μL），5×PCR buffer（Tris·HCl100mM（PH8.3），KCl250mM，tween-200.2%）5μL，dNTP1.25μL（10mM），MgCl24μL（25mM），特异性引物1μL（10μM）；O104：H4模板2μL，超纯水补至
25μL。PCR反应条件同特异性实验。

[0099] PCR扩增产物5μL使用2%琼脂糖凝胶电泳分析结果如图2所示。由图2可以看出，5
三个引物对均可以达到10CFU/mL，其中引物对aggR-2的条带亮度最高，其次是aggR-1，aggR-3。

[0100] 综合敏感性和特异性的评估结果，选择aggR-2作为aggR基因扩增的引物。

[0101] 其他基因的评估方法与aggR基因相同。

[0102] 实施例3大肠埃希氏菌O104：H4多重PCR检测试剂盒的组建

[0103] 该试剂盒由2×反应体系缓冲液、DNA聚合酶、10×引物混合液、阳性对照、超纯水构成。

[0104] 其 具 体 组 分 如 下：2×PCR Buffer（Tris·HCl40mM(PH8.3)，KCl100mM，tween-200.08%，0.0006ng/μL pET28a，1mm dNTP、8mm MgCl2）；25×DNA聚合酶(2U/μL)；10×引物混合液（包括IAC在内的特异性引物各2μM）；阳性对照（大肠埃希氏菌O104:H4，
6
EHEC（O157：H7）的混合模板，每种均为10CFU/ml）。

[0105] 试剂盒检测的反应体系为25μL，其配置如下：2×PCR Buffer12.5μL；25×DNA聚合酶1μL；10×引物混合液2.5μL；模板2μL，超纯水7μL。

[0106] 实施例4试剂盒的操作和结果判断

[0107] 1、基因组的提取

[0108] 取大肠埃希氏菌O104:H4、EHEC（O157：H7）、EAEC（O9：K99）增菌液或划线培养的8
菌落溶于水中，用浊度计调整细菌悬液浓度至10CFU/ml，取1ml细菌悬液，沸水浴10min后冰浴，13000rpm离心10min，取上清作为试剂盒检测用模板。

[0109] 2、反应体系的配制

[0110] 取200μL的PCR管配置25μL的反应体系，其配置如下：2×PCR Buffer12.5μL；25×DNA聚合酶1μL；10×引物混合液2.5μL，模板2μL，超纯水7μL。

[0111] 3、PCR反应

[0112] 将PCR管放入Bio-Rad C1000型PCR仪中，开启热盖后，按照如下程序进行PCR反应：

[0113] a：95℃4min；

[0114] b：95℃30S，

[0115] c：62℃30s，

[0116] d：72℃90s，b-d循环30个反应；

[0117] e：72℃5min。

[0118] 4、琼脂糖凝胶电泳平台分析PCR产物

[0119] 取5μL的PCR产物与1μL的6xloading buffer混匀，加入到琼脂糖凝胶的加样孔中。采用2%的琼脂糖凝胶，5V/cm电泳60min，使用凝胶成像仪显示扩增目标条带的大小。

[0120] 5、结果判断

[0121] 三个菌株扩增的结果如图3所示，由图3可知，包括空白对照在内的所有泳道均至少有一个条带扩增，空白对照（4泳道）有IAC（1176bp）的扩增，其他检测有目标条带和（或）IAC的扩增，表明所有PCR反应均成立，排除假阴性的结果。否则视实验无效，需要重复。

[0122] 在IAC扩增的基础上，O104:H4(第1泳道)还出现4条PCR产物，192bp的是fliCH4基因的扩增条带，253bp的是aggR基因的扩增条带，385bp的是orfO104基因的扩增条带，640bp的是stx2基因的扩增条带。EHEC（第2泳道）还出现150bp的是stx1基因的扩增条带，501bp的是eaeA基因的扩增条带，640bp的是stx2基因的扩增条带；EAEC（第3泳道）还出现253bp的条带，为aggR基因的扩增产物；阳性对照（第五泳道）将6条片段全部扩增出来，说明体系的共扩增能力强。

[0123] 实施例5试剂盒的保存期试验

[0124] 以105CFU/ml的大肠埃希氏菌O104：H4、EHEC(O157：H7)、EAEC（O9：K99）作为评估用检测样本，在第0天时，分装成9份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、20、30、60、90、120、150和180天的试剂盒进行保存期试验。保存期检测结果如表4所示：

[0125] 表4保存期试验结果

[0126]

[0127]

[0128] 由表4可知，试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期待检目标的扩增均为阳性，表明该试剂盒的保存期至少为6个月。

[0129] 实施例6试剂盒的特异性试验

[0130] 选择包括志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、非致泻大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等与检测目标菌种属相近，存在环境相似的细菌作为待检细菌，经检测均只有一条IAC条带扩增，无杂带产生。且对O104:H4、EHEC、EAEC等目标菌检测时，除特异性条带外，无杂带产生。表明本发明试剂盒能够有效区分非目标细菌，具有较好的特异性。

[0131] 实施例7试剂盒的敏感性试验

[0132] 评估用检测样本：调整大肠埃希氏菌O104：H4、EHEC(O157：H7)、EAEC（O9：K99）菌8 7 6
液浓度至10CFU/mL数量级上，提取DNA模板。每个模板梯度稀释成10CFU/mL，10CFU/mL，
5 4
10CFU/mL，10CFU/mL的检测样品。

[0133] 使用本发明试剂盒分别检测不同稀释度的待测目标模板。根据实例4结果判断方法，试剂盒检测目标基因的敏感性试验结果如表5所示：

[0134] 表5试剂盒检测待测基因敏感性试验结果

[0135]

[0136] 从表5看出，待检目标的敏感性均为105CFU/mL。

[0137] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。