一种可并行检测多种弧菌的基因芯片及其检测方法转让专利
申请号 : CN201310437410.8
文献号 : CN103451310B
文献日 : 2015-02-18
发明人 : 曲凌云 , 朱鹏飞 , 李壹 , 田欣欣 , 王琛
申请人 : 国家海洋局第一海洋研究所
摘要 :
本发明涉及到一种可并行检测多种弧菌的基因芯片及其检测方法。提供了溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌四种水产环境中常见病原弧菌的种特异性基因——编码热休克蛋白的hsp60基因的寡核苷酸探针序列，毒力基因toxR的寡核苷酸探针序列。该检测方法基于碱基互补配对原则，结合经优化的普通PCR及荧光标记PCR反应体系，通过固定于固相醛基芯片上的寡核苷酸探针来实现检测的目的。本发明针对当前病原微生物检测方法瓶颈，提出了一种高通量、高特异性、高灵敏度、快捷高效的检测方法。
权利要求 :
1.一种可并行检测多种弧菌的基因芯片，包括有芯片载体，其特征在于，在芯片载体上固定有用于检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌和创伤弧菌的核苷酸探针；所述的用于检测溶藻弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因中设计的，其序列为SEQ ID NO：1；
所述的用于检测副溶血弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因中设计的，其序列为SEQ ID NO：3；
所述的用于检测哈维氏弧菌的探针是从溶藻弧菌的toxR基因中设计的，其序列为SEQ ID NO：5；
所述的用于检测创伤弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因中设计的，其序列为SEQ ID NO：6。
2.权利要求1所述的基因芯片还固定有显示探针坐标位置的阳性质控探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7；而与阳性质控探针杂交的阳性质控片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：
8。
3.权利要求1所述的基因芯片的制备，包括如下步骤：
将核苷酸探针稀释至适当浓度后，在适当的温度、湿度条件下使用点制仪点制探针于固相醛基芯片上；然后将探针与芯片水合交联；洗脱去未连接的、连接不紧密的探针，封闭完成制备；
所述步骤核苷酸探针稀释至适当浓度，是使用缓冲液稀释至浓度为4-10μmol/L，与
0.3M Na2HPO4溶液；按照1:1的比例混合后进行点制；
所述在适当的温度、湿度条件下使用点制仪点制探针于固相醛基芯片上：点样在室温(20℃)、湿度60％-70％的条件下进行。
说明书 :
一种可并行检测多种弧菌的基因芯片及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种可并行检测多种弧菌的基因芯片及其检测方法。
[0002] 背景技术
[0003] 针对微生物检测的方法有多种，目前较广泛使用的有传统的生理生化实验法、免疫抗体检测技术、PCR检测技术等。传统的生理生化实验需要对待测样本的菌种分离培养，通过一系列繁琐的生理生化实验的特征、结果来甄别菌种，该方法虽然是微生物实验室中一种常用的、经典的鉴别方法，但其过程往往需要数天时间、需要耗费较大的人力物力、实验得到的表型特征可能受外界环境影响而出错、对于一些非典型株系及临近种较难根据表型分辨。特别是对于一些处于“活的不可培养状态”（VBNC）的细菌，传统的培养方法难以培养、甄别，这会在水产养殖和食品安全领域留下重大隐患。
[0004] PCR检测技术是通过设计特定的引物来大量扩增目的基因片段，根据待检测菌种的相关基因信息来鉴定菌种，PCR技术的灵敏度高而且快捷高效，特别是随着核酸测序技术的跨越式发展，使得PCR技术的耗费更低。但其检测的灵敏度往往受制于琼脂糖凝胶的灵敏度，且同时检测大量样本的能力有限，近年来在普通PCR技术的基础上又衍生出多重PCR技术能在一定程度上解决这个问题，但仍受限于可扩增的基因种类数。
[0005] 免疫抗体检测技术特异性和灵敏度较高，但往往单次只能检验单一菌种，需要制备抗血清。
[0006] 基因芯片技术自上世纪90年代以来进展飞速，其在功能基因组研究中作用巨大，随着材料学、机械自动化、全基因组测序等领域的不断发展，使得基因芯片在微生物检测领域也得到了越来越多的应用。基因芯片的基本原理是通过人工合成目的基因的核苷酸片段，点制于一定的载体上（如固相醛基芯片）；提取待测样本的全基因组DNA，通过PCR等方式扩增目的基因片段，并在这些基因片段上标记荧光物质；将之加入芯片上在合适的条件下杂交，同源性高的片段会通过碱基互补配对而结合，经过清洗扫描，会在相应的点处出现荧光信号。
[0007] 用于微生物检测领域的检测芯片也在原有芯片的基础上得到改进：使用的人工合成的寡核苷酸探针，再结合其他改进使得其特异性和灵敏度极高；荧光标记方法方式多样，大多使用荧光素Cy3标记的单碱基或者随机引物等物质，操作方便、耗费较低；芯片点制、扫描设备的自动化、智能化水平也在逐渐提高，可以大幅缩短检测时间、减少人为误差；芯4
片的高通量性体现在芯片打印密度的提高（目前已能达到每平方厘米打印10 个探针），这在环境监测、食品检测中的大量、复杂样品的检测方面优势明显。
片的高通量性体现在芯片打印密度的提高（目前已能达到每平方厘米打印10 个探针），这在环境监测、食品检测中的大量、复杂样品的检测方面优势明显。
[0008] 本发明的溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌的基因芯片检测芯片能够实现对复杂样本的并行快捷、高通量、高特异性、高灵敏度检测，在此四种病原弧菌的基础上其还具有良好的可扩展性，这对于海水环境病原微生物的监控检测具有实际意义。
发明内容
[0009] 本发明的目的是提供一种可并行检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌的基因芯片及其检测方法，从而弥补现有技术的不足。
[0010] 已有的基因芯片常常利用编码热休克蛋白的hsp60基因来做为菌株种类鉴定靶基因。该基因属于管家基因，其在细菌中广泛存在且具有种特异性差异，在当前的细菌分类学中通常被用为种类鉴定、系统发生分析的靶标。然而管家基因建立的鉴定探针只能鉴定到病原菌株的种类，在复杂的水产养殖环境中，往往同一菌中的不同株系其致病性有无、强弱也有差异，因此了解相关毒力基因是否存在具有实际意义。而申请人在长期的研究中发现，编码跨膜转录调控蛋白的toxR基因能够作为鉴定毒力基因的分子靶标，该基因对于致病菌株的毒素的产生具有关键性的调节功能，在致病菌株中也广泛存在。因此，本发明针对溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌的这两种基因分别选取特异性片段设计探针，以保证各个菌种探针只和对应的菌种产生特异性信号。
[0011] 本发明的一种可并行检测多种弧菌的基因芯片，包括有芯片载体，在芯片载体上固定有用于检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌和创伤弧菌的核苷酸探针；
[0012] 所述的用于检测溶藻弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因和/或toxR基因中设计的；
[0013] 所述的用于检测副溶血弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因和/或toxR基因中设计的；
[0014] 所述的用于检测哈维氏弧菌的探针是从溶藻弧菌的toxR基因中设计的；
[0015] 所述的用于检测创伤弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因中设计的。
[0016] 所述的用于检测溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。
[0017] 所述的用于检测副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。
[0018] 所述的用于检测创伤弧菌（Vibrio vulnificus）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO：5。
[0019] 所述的用于检测哈维氏弧菌（Vibrio haeveyi）的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO：6。
[0020] 表1：本发明所用到的探针序列信息
[0021]
[0022] 本发明的芯片上还固定有显示探针坐标位置的阳性质控探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7；而与阳性质控探针杂交的阳性质控片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：8（表2）。
[0023] 表2：阳性质控探针和阳性质控片段的序列信息
[0024]
[0025] 以上所有的探针的5’端均加上氨基进行修饰。
[0026] 本发明的基因芯片的制备步骤为：
[0027] 将核苷酸探针稀释至适当浓度后，在适当的温度、湿度条件下使用点制仪点制探针于固相醛基芯片上；然后将探针与芯片水合交联；洗脱去未连接的、连接不紧密的探针，封闭完成制备。
[0028] 所述步骤核苷酸探针稀释至适当浓度，是使用缓冲液稀释至浓度为4-10 μ mol/L，与0.3M Na2HPO4溶液（pH=8.5）按照1:1的比例混合后进行点制。
[0029] 所述在适当的温度、湿度条件下使用点制仪点制探针于固相醛基芯片上：点样在室温（20℃）、湿度60%-70%的条件下进行。
[0030] 本发明基因芯片用于检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌。
[0031] 本发明所述的基因芯片的检测方法，依次包括以下步骤：（1）待检测样本核酸的提取；（2）普通或多重PCR扩增反应；（3）PCR产物的回收纯化；（4）荧光标记PCR反应；（5）预杂交；（6）杂交；（7）洗脱；（8）使用扫描仪扫描，分析结果。
[0032] 所述步骤（1）待检测样本核酸的提取：按照DNA提取的方法或者使用试剂盒提取待检测样本的全基因组DNA作为模板备用。
[0033] 所述步骤（2）的普通或多重PCR扩增体系是：10×PCR reaction buffer 2.5μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTPs mixture 4μL，Taq DNA聚合酶 2.5U，10μM正向引物和
10μM反向引物各1μL，待检样品DNA 1-2μL，双蒸水补足25μL。且所述PCR反应的条件为：94℃ 7分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 7分钟，4℃保存。
10μM反向引物各1μL，待检样品DNA 1-2μL，双蒸水补足25μL。且所述PCR反应的条件为：94℃ 7分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 7分钟，4℃保存。
[0034] 所述步骤（3）PCR产物的回收纯化：按照PCR产物的回收纯化试剂盒的操作流程回收。
[0035] 所述步骤（4）荧光标记PCR体系及步骤是：（1）预处理： PCR回收纯化DNA产物5μL， 100μM Cy3标记的随机引物 0.75-1.5μL，双蒸水补足19μL，上述混合物于PCR仪经95℃变性3分钟，置于冰上冷激3分钟；（2）荧光标记：再加入Klenow酶 1μL，Klenow buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs mixture 2.5μL，荧光标记PCR的条件为：37℃ 90分钟，
72℃ 10分钟。
72℃ 10分钟。
[0036] 所述步骤（5）、（6）预杂交和杂交：预杂交混合液的配制方法是去离子甲酰胺500mL，50×标准柠檬酸盐溶液 100mL，50× Denhardt’s溶液 100mL，10%十二烷基硫酸钠50mL，灭菌双蒸水定容至1000mL。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。
杂交混合液的配制是在预杂交液的配方中加入硫酸葡聚糖 100g。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。且杂交液同步骤（4）所述的荧光标记产物的添加比例须近似
1:1，另需加入10μM阳性质控 1μL。
杂交混合液的配制是在预杂交液的配方中加入硫酸葡聚糖 100g。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。且杂交液同步骤（4）所述的荧光标记产物的添加比例须近似
1:1，另需加入10μM阳性质控 1μL。
[0037] 所述步骤（7）洗脱中使用的三种洗脱液配制及操作方法：洗脱液Ⅰ为1×柠檬酸钠盐溶液和0.2%十二烷基硫酸钠溶液混合物；洗脱液Ⅱ为0.2×柠檬酸钠盐溶液；洗脱液Ⅲ为0.1×柠檬酸钠盐溶液。且洗脱前须60℃预热各洗脱液，在42℃、150rpm的条件下依次使用上述三种洗脱液震荡洗脱15分钟。
[0038] 所述步骤（8）使用扫描仪扫描，分析结果：使用扫描仪扫描出结果，可肉眼查看合成的点是否有信号，亦可使用分析软件量化各点的信号值。
[0039] 本发明在传统基因芯片的基础上经过一系列的优化探索，使得整个样品检测时间在24小时内完成，若不算入制备基因芯片的时间则能在12小时内完成检测；而且探针特异性能达到100%；芯片能达到识别3.5fg细菌全基因组DNA（或4 CFU/mL 菌体）的灵敏度水平,这高出PCR检测技术、免疫抗体检测技术两个数量级，且已达到国内外基因芯片研究中在微生物检测其他领域的灵敏度最高水平；优化的标准操作流程尽可能避免人为操作的影响，稳定性更好。总体而言，本发明能够突破现有微生物检测技术的种种弊端，实现对海水环境中的病原菌株能够实现高通量、高特异性、高灵敏度、高效快捷的检测，对于渔业养殖、水产品中病害监测预警具有实际意义。
附图说明
[0040] 图1：本发明基因芯片检测溶藻弧菌全基因组DNA梯度浓度的灵敏度曲线；
[0041] 图2：本发明基因芯片检测溶藻弧菌菌体梯度浓度的灵敏度曲线。
具体实施方式
[0042] 1.探针的设计
[0043] 本发明的基因芯片用来检测渔业养殖环境、水产品中的溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌。其使用的探针均根据菌种的hsp60和toxR基因的高变区序列设计而成，经过BLAST比对保证其特异性，探针序列同其他已公开专利的近似探针的序列比对信息见表3。所使用引物、探针由专门的公司商业合成。
[0044] 表3. 本发明所申请探针同其他已公开专利的近似探针的序列比对信息[0045]
[0046] 注：近 似 探 针 专 利 公 开 号：1. CN101475986A;2. CN101475986A;3. CN101967510A; 4. CN101967510A; 5. CN101113476A。
[0047] 2. 所述基因芯片的构建 ：
[0048] （1）商业合成的寡核苷酸探针稀释至适当浓度：使用1×TE缓冲液稀释至浓度为4-10 μmol/L，与0.3M Na2HPO4溶液（pH=8.5）按照1:1的比例混合后点制于固态醛基芯片上。在室温（20℃），湿度60%-70%的条件下使用点制仪点制探针于醛基芯片上。
[0049] 表4. 本发明的基因芯片探针的一种点样阵列
[0050]SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.2SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.4SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.6SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.7[0051] （2）探针与芯片水合交联：点制之后需要在37℃湿盒内水合杂交12小时。
[0052] （3）水合后芯片处理：使用双蒸水清洗3次，每次2分钟，洗脱去未连接的、连接不紧密的探针。使用0.2% NaBH4封闭：使芯片完全浸没，静置5分钟后，150 rpm震荡5分钟，再静置5分钟；最后用双蒸水清洗3次，每次2分钟。离心去除芯片表面水迹，离心参数：2000rpm，2分钟。4℃避光保存备用。
[0053] 3. 所述的基因芯片的检测方法
[0054] （1）待检测样本核酸的提取：按照DNA提取的方法或者使用试剂盒提取待检测样本（如海水鱼类）的全基因组DNA作为模板备用。
[0055] （2）PCR扩增：普通或多重PCR扩增体系为：10×PCR reaction buffer 2.5μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTPs mixture 4μL，Taq DNA聚合酶 2.5U，10μM正向引物和
10μM反向引物各1μL，待检样品DNA 1-2μL，双蒸水补足25μL。且PCR反应的条件为：
94℃ 7分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 7分钟，4℃保存。
10μM反向引物各1μL，待检样品DNA 1-2μL，双蒸水补足25μL。且PCR反应的条件为：
94℃ 7分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 7分钟，4℃保存。
[0056] （3）PCR产物的回收纯化：按照商业化的PCR产物回收纯化试剂盒的操作流程回收。
[0057] （4）荧光标记PCR： PCR回收纯化DNA产物5μL， 100μM Cy3标记的随机引物0.75-1.5μL，双蒸水补足19μL，上述混合物于PCR仪经95℃变性3分钟，置于冰上冷激3分钟；再加入Klenow酶 1μL，Klenow buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs mixture 2.5μL，PCR标记的条件为：37℃ 90分钟，72℃ 10分钟。
[0058] （5）预杂交：预杂交液的配制方法是去离子甲酰胺 500mL，50×标准柠檬酸盐溶液 100mL，50× Denhardt’s溶液 100mL，10%十二烷基硫酸钠50mL，灭菌双蒸水定容至2
1000mL。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。按照10μL /cm 的比例在已经制备好的基因芯片的点样区加入预杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中预杂交1小时。然后取出离心（2000rpm，2分钟）备用。
1000mL。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。按照10μL /cm 的比例在已经制备好的基因芯片的点样区加入预杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中预杂交1小时。然后取出离心（2000rpm，2分钟）备用。
[0059] （6）杂交：杂交液的配制是在预杂交液的配方中加入硫酸葡聚糖 100g。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。将杂交液同步骤（4）所述的荧光标记产物按照2
近似1:1的比例混合，另需加入10μM阳性质控 1μL。按照10μL /cm 的比例在已经预杂交好的基因芯片的点样区加入杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中杂交2小时。
近似1:1的比例混合，另需加入10μM阳性质控 1μL。按照10μL /cm 的比例在已经预杂交好的基因芯片的点样区加入杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中杂交2小时。
[0060] （7）洗脱：使用的三种洗脱液进行洗脱：洗脱液Ⅰ为1×柠檬酸钠盐溶液和0.2%十二烷基硫酸钠溶液混合物；洗脱液Ⅱ为0.2×柠檬酸钠盐溶液；洗脱液Ⅲ为0.1×柠檬酸钠盐溶液。且洗脱前须60℃预热各洗脱液，在42℃、150rpm的条件下依次使用上述三种洗脱液震荡洗脱15分钟。随后离心甩干水分（2000rpm，2分钟）。
[0061] （8）扫描芯片，分析结果：使用扫描仪扫描芯片，输出图像。使用分析软件量化各点的信号值。阳性结果有清晰的杂交信号。
[0062] 4. 使用基因芯片检测溶藻弧菌
[0063] (1).待检测样本核酸的提取：按照DNA提取的方法或者使用试剂盒提取溶藻弧菌的全基因组DNA作为模板备用。
[0064] (2).PCR扩增：普通或多重PCR扩增体系为：10×PCR reaction buffer 2.5μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTPs mixture 4μL，Taq DNA聚合酶 2.5U，10μM正向引物和
10μM反向引物各1μL，待检样品DNA 1-2μL，双蒸水补足25μL。且PCR反应的条件为：
94℃ 7分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 7分钟，4℃保存。
10μM反向引物各1μL，待检样品DNA 1-2μL，双蒸水补足25μL。且PCR反应的条件为：
94℃ 7分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 7分钟，4℃保存。
[0065] (3).PCR产物的回收纯化：按照商业化的PCR产物回收纯化试剂盒的操作流程回收。
[0066] (4).荧光标记PCR： PCR回收纯化DNA产物5μL， 100μM Cy3标记的随机引物0.75-1.5μL，双蒸水补足19μL，上述混合物于PCR仪经95℃变性3分钟，置于冰上冷激3分钟；再加入Klenow酶 1μL，Klenow buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs mixture 2.5μL，PCR标记的条件为：37℃ 90分钟，72℃ 10分钟。
[0067] (5).预杂交：预杂交液的配制方法是去离子甲酰胺 500mL，50×标准柠檬酸盐溶液 100mL，50×Denhardt’s溶液 100mL，10%十二烷基硫酸钠50mL，灭菌双蒸水定容至2
1000mL。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。按照10μL/cm 的比例在已经制备好的基因芯片的点样区加入预杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中预杂交1小时。然后取出离心（2000rpm，2分钟）备用。
1000mL。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。按照10μL/cm 的比例在已经制备好的基因芯片的点样区加入预杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中预杂交1小时。然后取出离心（2000rpm，2分钟）备用。
[0068] (6).杂交：杂交液的配制是在预杂交液的配方中加入硫酸葡聚糖 100g。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。将杂交液同步骤（4）所述的荧光标记产物按2
照近似1:1的比例混合，另需加入10μM阳性质控 1μL。按照10μL /cm 的比例在已经预杂交好的基因芯片的点样区加入杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中杂交2小时。
照近似1:1的比例混合，另需加入10μM阳性质控 1μL。按照10μL /cm 的比例在已经预杂交好的基因芯片的点样区加入杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中杂交2小时。
[0069] (7).洗脱：使用三种洗脱液进行洗脱：洗脱液Ⅰ为1×柠檬酸钠盐溶液和0.2%十二烷基硫酸钠溶液混合物；洗脱液Ⅱ为0.2×柠檬酸钠盐溶液；洗脱液Ⅲ为0.1×柠檬酸钠盐溶液。且洗脱前各洗脱液须60℃预热，在42℃、150rpm的条件下依次使用上述三种洗脱液震荡洗脱15分钟。随后离心甩干水分（2000rpm，2分钟）。
[0070] (8).扫描芯片，分析结果：使用扫描仪扫描芯片，输出图像。使用分析软件量化各点的信号值，亦可用肉眼查看打印的点是否有信号。汇总点制阵列信息和扫描信息从而确定检测结果。
[0071] (9)本实施例方法的检测结果表明，基因芯片仅对溶藻弧菌的hsp60基因和toxR基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况；特异性好，在其他弧菌的探针处也没有出现非特异性信号。
[0072] 5. 使用基因芯片检测副溶血弧菌
[0073] 检测方法同实施例4，检测结果扫描图像表明，基因芯片仅对副溶血弧菌的hsp60基因和toxR基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况；特异性好，在其他弧菌的探针处也没有出现非特异性信号。
[0074] 6. 使用基因芯片检测创伤弧菌
[0075] 检测方法同实施例4，检测结果表明，基因芯片仅对创伤弧菌的hsp60基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况；特异性好，在其他弧菌的探针处也没有出现非特异性信号。
[0076] 7. 使用基因芯片检测哈维氏弧菌
[0077] 检测方法同实施例4，检测结果表明，基因芯片仅对哈维氏弧菌的toxR基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况；特异性好，在其他弧菌的探针处也没有出现非特异性信号。
[0078] 8. 基因芯片的灵敏度检测
[0079] (1).菌体浓度稀释：将经过过夜纯培养、菌体浓度为4.0×1012CFU/mL的溶藻弧菌以100倍梯度稀释于1×PBS溶液，依次稀释至4.0 CFU/mL，并设置空白对照一组。
[0080] (2).待检测样本核酸的提取：从各稀释组中取1.5 mL菌液，按照DNA提取的方法或者使用试剂盒提取各浓度梯度溶藻弧菌的全基因组DNA作为模板备用；同时取实施例48
（1）中的溶藻弧菌的全基因组DNA，测定其全基因组DNA浓度（3.5×10fg/μl），并以100倍梯度稀释于1×TE溶液，依次稀释至3.5fg/μl，各稀释浓度梯度溶藻弧菌的全基因组DNA也作为模板备用。
（1）中的溶藻弧菌的全基因组DNA，测定其全基因组DNA浓度（3.5×10fg/μl），并以100倍梯度稀释于1×TE溶液，依次稀释至3.5fg/μl，各稀释浓度梯度溶藻弧菌的全基因组DNA也作为模板备用。
[0081] (3).PCR扩增：普通或多重PCR扩增体系为：10×PCR reaction buffer 2.5μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTPs mixture 4μL，Taq DNA聚合酶 2.5U，10μM正向引物和
10μM反向引物各1μL，待检样品DNA 1-2μL，双蒸水补足25μL。且PCR反应的条件为：
94℃ 7分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 7分钟，4℃保存。
10μM反向引物各1μL，待检样品DNA 1-2μL，双蒸水补足25μL。且PCR反应的条件为：
94℃ 7分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 7分钟，4℃保存。
[0082] (4).PCR产物的回收纯化：按照商业化的PCR产物回收纯化试剂盒的操作流程回收。
[0083] (5).荧光标记PCR： PCR回收纯化DNA产物5μL， 100μM Cy3标记的随机引物0.75-1.5μL，双蒸水补足19μL，上述混合物于PCR仪经95℃变性3分钟，置于冰上冷激3分钟；再加入Klenow酶 1μL，Klenow buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs mixture 2.5μL，PCR标记的条件为：37℃ 90分钟，72℃ 10分钟。
[0084] (6).预杂交：预杂交液的配制方法是去离子甲酰胺 500mL，50×标准柠檬酸盐溶液 100mL，50×Denhardt’s溶液 100mL，10%十二烷基硫酸钠50mL，灭菌双蒸水定容至2
1000mL。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。按照10μL/cm 的比例在已经制备好的基因芯片的点样区加入预杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中预杂交1小时。然后取出离心（2000rpm，2分钟）备用。
1000mL。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。按照10μL/cm 的比例在已经制备好的基因芯片的点样区加入预杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中预杂交1小时。然后取出离心（2000rpm，2分钟）备用。
[0085] (7).杂交：杂交液的配制是在预杂交液的配方中加入硫酸葡聚糖 100g。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。将杂交液同步骤（4）所述的荧光标记产物按2
照近似1:1的比例混合，另需加入10μM阳性质控 1μL。按照10μL /cm 的比例在已经预杂交好的基因芯片的点样区加入杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中杂交2小时。
照近似1:1的比例混合，另需加入10μM阳性质控 1μL。按照10μL /cm 的比例在已经预杂交好的基因芯片的点样区加入杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中杂交2小时。
[0086] (8).洗脱：使用三种洗脱液进行洗脱：洗脱液Ⅰ为1×柠檬酸钠盐溶液和0.2%十二烷基硫酸钠溶液混合物；洗脱液Ⅱ为0.2×柠檬酸钠盐溶液；洗脱液Ⅲ为0.1×柠檬酸钠盐溶液。且洗脱前各洗脱液须60℃预热，在42℃、150rpm的条件下依次使用上述三种洗脱液震荡洗脱15分钟。随后离心甩干水分（2000rpm，2分钟）。
[0087] (9).扫描芯片，分析结果：使用扫描仪扫描芯片，输出图像。使用分析软件量化各点的信号值。汇总点制阵列信息和扫描信息从而确定检测结果。
[0088] 本实施例方法的检测结果表明，所述芯片能够检测出3.5fg的溶藻弧菌全基因组DNA（见附图1）；此外当菌体浓度为4 CFU/mL时，基因芯片能够检测出较高的信号值（见附图2）。说明本发明的基因芯片灵敏度较高。
[0089] 9. 使用基因芯片检测费氏弧菌和灿烂弧菌
[0090] 检测方法同实施例4，检测结果扫描图像表明，基因芯片除阳性质控点出现杂交信号外，在其他弧菌的探针处均没有出现杂交信号，这表明该基因芯片。的探针对近缘弧菌不会产生假阳性结果。
[0091] 上述的结果表明，本发明的基因芯片能够灵敏的检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌。