一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用检测方法

摘要

本发明涉及一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱与高分辨质谱联用检测方法，它利用离子对反相色谱与高分辨质谱进行联用检测低分子肝素部分降解产物的各个组分，通过离子对反相色谱分离样品中各组分，并通过高分辨质谱获得精确的分子量，计算出各组分的糖链序列信息，包括两端结构、糖链长度、乙酰基及硫酸基取代数量，从而对各低分子肝素部分降解产物的结构进行比较精细的表征。本发明可以检测低分子肝素部分降解产物的两端结构、糖链长度、乙酰基及硫酸基取代数量，解决了现有技术中仅能获得低分子肝素部分降解的紫外吸收图谱的问题，对于提高肝素的检测水平、保障药品安全具有极大的实用价值。

权利要求

1.一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用检测方法，步骤如下：（1）将胺类离子对试剂及六氟异丙醇溶解于去离子水，制得胺类离子对浓度为10～

40mM、六氟异丙醇浓度为20～100mM的流动相A’；

（2）将胺类离子对试剂及六氟异丙醇溶解于体积百分比为75%的乙腈或体积百分比为

75%甲醇溶液，制得胺类离子对浓度为10～40mM、六氟异丙醇浓度为20～100mM的流动相B’；

（3）将待测低分子肝素样品溶于流动相A’，配制成浓度为6～10 mg/mL的待测溶液，经过滤后，使用C18反相色谱柱；流速8～12µL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：

0～5 min，95%流动相A’，5%流动相B’；5～60 min，60～95%流动相A’，5～40%流动相B’；

（4）在正离子模式或负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；

（5）通过紫外检测色谱图确定低分子肝素的种类，然后根据步骤（4）获得的高分辨质谱图获得主要峰的质荷比M，经如下公式计算组分的精确分子量m：正离子模式：m=zM-nX-zY

负离子模式：m=zM-nX+zY

其中：z表示电荷数，n表示离子对试剂分子个数，X表示离子对试剂的分子量，Y表示质子氢的分子量；

（6）使用计算机辅助方法进行解谱，具体过程为：通过计算机生成各肝素组分的分子量数据库，用步骤（5）中得到的精确分子量与数据库中的理论分子量进行比对获得误差值Ⅰ，按误差值Ⅰ的大小对数据库中的数据进行排列，然后，根据质谱仪检测标准品的误差值Ⅱ与误差值Ⅰ进行比对，选取误差值Ⅱ与误差值Ⅰ最为接近的数据库中的理论样品，通过该理论样品的信息即可获知待测低分子肝素样品的结构信息。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中的胺类离子对试剂选自：正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺或正己胺。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中的胺类离子对试剂选自：正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺或正己胺。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中的高分辨质谱采用离子阱时间飞行串联质谱仪（IT-TOF），设定参数为：正离子模式喷雾电压：+3.6 kV；负离子模式喷雾电压：-3.0 kV；喷雾气流速：0.5L/min或者1.5L/min；扫描质量范围：50～5000；如果采用四级杆时间飞行串联质谱仪（Q-TOF），设定参数为：正离子模式喷雾电压：+5.5 kV；

负离子模式喷雾电压：-4.0 kV；帘气压25 psi；喷雾气压：30 psi；扫描质量范围：50～

4000。

说明书

一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用

检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱与高分辨质谱联用检测方法，属于药物、原料药、原料检测技术领域。

背景技术

[0002] 肝素是一种糖胺聚糖类抗凝血抗血栓药物，低分子肝素是肝素经物理方法、化学方法或者酶法降解制备而成的新型抗血栓药物，具有强极性、高度不均一性、硫酸基团不稳定等特点，很难对其进行结构表征。低分子肝素部分降解片段的指纹图谱分析是其结构表征中一个非常重要的环节，通过它可以获得肝素糖链的序列信息，但低分子肝素经肝素酶部分降解会增强酶解产物的不均一性，使得分析变得更加困难。通常分析低分子肝素部分降解片段的方法有反相高效液相色谱法及强阴离子交换高效液相色谱法（Chuang W L，et al.Journal of Chromatography A，2001,932:65-74.），但通过这些方法仅能获得紫外检测图谱，无法对各种糖链片段进行准确定性分析。

发明内容

[0003] 本发明针对现有技术的不足，提供一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱与高分辨质谱联用检测方法，可用于分析低分子肝素部分降解产物中的各种组分，对各种组分进行定性分析。

[0004] 发明概述

[0005] 本发明利用离子对反相色谱与高分辨质谱进行联用检测低分子肝素部分降解产物的各个组分，通过离子对反相色谱分离样品中各组分，并通过高分辨质谱获得精确的分子量，计算出各组分的糖链序列信息，包括两端结构、糖链长度、乙酰基及硫酸基取代数量，从而对各低分子肝素部分降解产物的结构进行比较精细的表征。

[0006] 发明详述

[0007] 一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用检测方法，步骤如下：

[0008] （1）将胺类离子对试剂溶解于去离子水，制得胺类离子对浓度为10～40mM的流动相A，并将pH调至5.5～8.5；

[0009] 或者，将胺类离子对试剂及六氟异丙醇溶解于去离子水，制得胺类离子对浓度为10～40mM、六氟异丙醇浓度为20～100mM的流动相A’；

[0010] （2）将胺类离子对试剂溶解于体积百分比为75%的乙腈或体积百分比为75%的甲醇溶液中，制得胺类离子对浓度为10～40mM的流动相B，并将pH调至5.5～8.5；

[0011] 或者，将胺类离子对试剂及六氟异丙醇溶解于体积百分比为75%的乙腈或体积百分比为75%甲醇溶液，制得胺类离子对浓度为10～40mM、六氟异丙醇浓度为20～100mM的流动相B’；

[0012] （3）将待测低分子肝素样品溶于流动相A或流动相A’，配制成浓度为6～10mg/mL的待测溶液，经过滤后，使用C18反相色谱柱；流速8～12μL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：

[0013] 0～5min，95%流动相A，5%流动相B；5～60min，65～95%流动相A，5～35%流动相B，

[0014] 或者，0～5min，95%流动相A’，5%流动相B’；5～60min，60～95%流动相A’，5～40%流动相B’；

[0015] （4）在正离子模式或负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；

[0016] （5）通过紫外检测色谱图确定低分子肝素的种类，然后根据步骤（4）获得的高分辨质谱图获得主要峰的质荷比M，经如下公式计算组分的精确分子量m：

[0017] 正离子模式：m=zM-nX-zY

[0018] 负离子模式：m=zM-nX+zY

[0019] 其中：z表示电荷数，n表示离子对试剂分子个数，X表示离子对试剂的分子量，Y表示质子氢的分子量；

[0020] （6）使用计算机辅助方法进行解谱，具体过程为：通过计算机生成各肝素组分的分子量数据库，用步骤（5）中得到的精确分子量与数据库中的理论分子量进行比对获得误差值Ⅰ，按误差值Ⅰ的大小对数据库中的数据进行排列，然后，根据质谱仪检测标准品的误差值Ⅱ与误差值Ⅰ进行比对，选取误差值Ⅱ与误差值Ⅰ最为接近的数据库中的理论样品，通过该理论样品的信息即可获知待测低分子肝素样品的结构信息。

[0021] 所述步骤（1）中的胺类离子对试剂选自：正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺或正己胺。

[0022] 所述步骤（2）中的胺类离子对试剂选自：正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺或正己胺。

[0023] 所述步骤（4）中的高分辨质谱如采用离子阱时间飞行串联质谱仪（IT-TOF），设定参数为：正离子模式喷雾电压：+3.6kV；负离子模式喷雾电压：-3.0kV；喷雾气流速：0.5L/min或者1.5L/min；扫描质量范围：50～5000；如果采用四级杆时间飞行串联质谱仪（Q-TOF），设定参数为：正离子模式喷雾电压：+5.5kV；负离子模式喷雾电压：-4.0kV；帘气压25psi；喷雾气压：30psi；扫描质量范围：50～4000。

[0024] 有益效果

[0025] 本发明可以检测低分子肝素部分降解产物的的两端结构、糖链长度、乙酰基及硫酸基取代数量，解决了现有技术中仅能获得低分子肝素部分降解的紫外吸收图谱的问题，对于提高肝素的检测水平、保障药品安全具有极大的实用价值。

附图说明

[0026] 图1、实施例1中克赛部分降解产物的总离子流图；

[0027] 图2、实施例1中克赛部分降解产物的高分辨质谱图；

[0028] 图3、实施例1中克赛部分降解产物的高分辨质谱图；

[0029] 图4、实施例2中克赛部分降解产物的总离子流图；

[0030] 图5、实施例2中克赛部分降解产物的高分辨质谱图；

[0031] 图6、实施例2中克赛部分降解产物的高分辨质谱图。

具体实施方式

[0032] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

[0033] 液相色谱仪为Agilent1100series毛细管液相色谱仪，检测器为二极管阵列检测器，工作站为Agilent ChemStation；质谱为岛津IT-TOF型高分辨质谱，工作站为LC-Solution。

[0034] 实施例1：

[0035] 一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用检测方法，步骤如下：

[0036] 1.1将正戊胺溶解于去离子水，制得正戊胺浓度为15mM的流动相A，并将pH调至7.0；

[0037] 1.2将正戊胺溶解于体积百分比为75%的乙腈溶液，制得正戊胺浓度为15mM的流动相B，并将pH调至7.0；

[0038] 1.3将克赛（购自赛诺菲-安万特）注射液透析后冻干制得依诺肝素的原料药，用肝素酶I进行部分降解，降解产物用Millipore10KDa的超滤膜过滤后转干，然后用流动相A配制成10mg/mL的待测溶液；

[0039] 1.4使用填料粒径为5μm、色谱柱内径为0.5mm、色谱柱长度为250mm的C18反相色谱柱；在流速10μL/min，进样量为2.0μL，洗脱梯度为：0～5min，95%流动相A，5%流动相B；5～60min，65～95%流动相A，5～35%流动相B；

[0040] 1.5使用岛津IT-TOF高分辨质谱在正离子模式下进行检测，得到高分辨质谱图，设定参数为：喷雾电压：+3.6kV；喷雾气流速：0.5L/min；扫描质量范围：50～5000。

[0041] 1.6根据步骤1.5中获得的高分辨质谱图中获得的主要峰的质荷比M，经如下公式计算组分的精确分子量m：

[0042] m=zM-nX-zY

[0043] 其中：z表示电荷数，n表示离子对试剂分子个数，X表示离子对试剂的分子量，Y表示质子氢的分子量。

[0044] 1.7通过计算机生成依诺肝素部分降解产生的各组分的分子量数据库，用步骤1.6中得到的精确分子量与数据库中的理论分子量进行逐一比对，获得误差值Ⅰ，其计算公式如下：

[0045] 误差值Ⅰ=（实测分子量-理论分子量）/理论分子量

[0046] 按误差值Ⅰ的大小对数据库中的数据进行排列，然后，根据质谱仪检测标准品的误差值Ⅱ与误差值Ⅰ进行比对，选取误差值Ⅱ与误差值Ⅰ最为接近的数据库中的理论样品，通过该理论样品的信息即可获知待测低分子肝素样品的结构信息。总离子流图（TIC）中所标依诺肝素钠样品各组分的结构信息如表1所示。

[0047] 表1

[0048]编号 寡糖大小 硫酸取代基数目
1 dp2 *1NS
2 dp2 1NS
3 dp2 *1OS,1NS
4 dp2 1OS,1NS
5 dp2 2OS,1NS
6 dp3 2OS,1NS
7 dp3 3OS,1NS
8 dp4 *2NS
9 dp4 2NS
10 dp4 1OS,1NS
11 dp4 *1OS,2NS
12 dp4 1OS,2NS
13 dp4 *2OS,1NS
14 dp4 2OS,1NS
15 dp4 *2OS,2NS

[0049]16 dp4 2OS,2NS
17 dp4 3OS,1NS
18 dp4 4OS
19 dp4 *3OS,2NS
20 dp4 3OS,2NS
21 dp4 4OS,1NS
22 dp4 5OS
23 dp4 *4OS,2NS
24 dp4 4OS,2NS
25 dp5 3OS,1NS
26 dp5 3OS,2NS
27 dp6 *3OS,2NS
28 dp5 4OS,1NS
29 dp5 4OS,2NS
30 dp5 5OS,1NS
31 dp5 5OS,2NS
32 dp6 2OS,1NS
33 dp6 1OS,2NS
34 dp6 2OS,2NS
35 dp6 2OS,3NS
36 dp6 3OS,1NS
37 dp6 *3OS,2NS
38 dp6 3OS,2NS
39 dp6 *3OS,3NS
40 dp6 3OS,3NS
41 dp6 *4OS,2NS
42 dp6 4OS,2NS
43 dp6 *4OS,3NS
44 dp6 4OS,3NS
45 dp6 *5OS,2NS
46 dp6 5OS,2NS
47 dp6 *5OS,3NS
48 dp6 5OS,3NS
49 dp6 6OS,2NS
50 dp7 2OS
51 dp7 5OS,2NS
52 dp7 6OS,2NS
53 dp8 1OS,4NS
54 dp8 3OS,3NS
55 dp8 4OS,2NS
56 dp8 4OS,3NS
57 dp8 *5OS,3NS
58 dp8 5OS,3NS
59 dp8 *5OS,4NS

[0050]60 dp8 5OS,4NS
61 dp8 7OS,3NS
62 dp8 7OS,4NS
63 dp8 8OS,4NS
64 dp9 2OS,3NS
65 dp10 5OS,3NS

[0051] 注：“*”表示糖链末端含内醚结构，“OS”表示“-O-SO3H”,“NS”表示“-NH-SO3H”，*如“6OS,2NS”则表示这种组分还原末端含1,6内醚结构，有6个“-O-SO3H”结构，2个“-NH-SO3H”结构。

[0052] 克赛的原料药部分降解产物的质谱分析总离子流图如图1，组分24的高分辨质谱图示例如图2，组分48的高分辨质谱图示例如图3。通过本方法成功检测到克赛的原料药部分降解产物中从二糖到十糖的65种主要组分，并对其糖链长度、末端结构及“-O-SO3H”和“-NH-SO3H”数目进行确定。

[0053] 实施例2：

[0054] 一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用检测方法，步骤如下：

[0055] 2.1将正戊胺和六氟异丙醇溶解于去离子水，制得正戊胺浓度为15mM、六氟异丙醇浓度为50mM的流动相A’；

[0056] 2.2将正戊胺和六氟异丙醇溶解于体积百分比为75%的乙腈溶液，制得正戊胺浓度为15mM、六氟异丙醇浓度为50mM的流动相B’；

[0057] 2.3将克赛（购自赛诺菲-安万特）注射液透析后冻干制得依诺肝素的原料药，用肝素酶I进行部分降解，降解产物用Millipore 10KDa的超滤膜过滤后转干，然后用流动相A’配制成10mg/mL的待测溶液；

[0058] 2.4使用填料粒径为5μm、色谱柱内径为0.5mm、色谱柱长度为250mm的C18反相色谱柱；在流速10μL/min，进样量为2.0μL，洗脱梯度为：0～5min，95%流动相A’，5%流动相B’；5～60min，60～95%流动相A’，5～40%流动相B’；

[0059] 2.5使用岛津IT-TOF高分辨质谱在正离子模式下进行检测，得到高分辨质谱图，设定参数为：喷雾电压：+3.6kV；喷雾气流速：1.5L/min；扫描质量范围：50～5000。

[0060] 2.6根据步骤2.5中获得的高分辨质谱图中获得的主要峰的质荷比M，经如下公式计算组分的精确分子量m：

[0061] m=zM-nX-zY

[0062] 其中：z表示电荷数，n表示离子对试剂分子个数，X表示离子对试剂的分子量，Y表示质子氢的分子量。

[0063] 2.7通过计算机生成依诺肝素部分降解产生的各组分的分子量数据库，用步骤2.6中得到的精确分子量与数据库中的理论分子量进行逐一比对，获得误差值Ⅰ，其计算公式如下：

[0064] 误差值Ⅰ=（实测分子量-理论分子量）/理论分子量

[0065] 按误差值Ⅰ的大小对数据库中的数据进行排列，然后，根据质谱仪检测标准品的误差值Ⅱ与误差值Ⅰ进行比对，选取误差值Ⅱ与误差值Ⅰ最为接近的数据库中的理论样品，通过该理论样品的信息即可获知待测低分子肝素样品的结构信息。总离子流图（TIC）中所标依诺肝素钠样品各组分的结构信息如表2所示。

[0066] 表2

[0067]编号 寡糖大小 硫酸取代基数目

[0068]1 dp2 *1NS
2 dp2 1NS
*
3 dp2 1OS,1NS
4 dp2 1OS,1NS
5 dp2 2OS,1NS
6 dp3 2OS,1NS
7 dp3 3OS,1NS
8 dp4 *2NS
9 dp4 2NS
10 dp4 1OS,1NS
11 dp4 *1OS,2NS
12 dp4 1OS,2NS
13 dp4 *2OS,1NS
14 dp4 2OS,1NS
15 dp4 *2OS,2NS
16 dp4 2OS,2NS
17 dp4 3OS,1NS
18 dp4 4OS
19 dp4 *3OS,2NS
20 dp4 3OS,2NS
21 dp4 4OS,1NS
22 dp4 5OS
23 dp4 *4OS,2NS
24 dp4 4OS,2NS
25 dp5 3OS,1NS
26 dp5 3OS,2NS
27 dp6 *3OS,2NS
28 dp5 4OS,1NS
29 dp5 4OS,2NS
30 dp5 5OS,1NS
31 dp5 5OS,2NS
32 dp6 2OS,1NS
33 dp6 1OS,2NS
34 dp6 2OS,2NS
35 dp6 2OS,3NS
36 dp6 3OS,1NS
37 dp6 *3OS,2NS
38 dp6 3OS,2NS
39 dp6 *3OS,3NS
40 dp6 3OS,3NS
41 dp6 *4OS,2NS
42 dp6 4OS,2NS
43 dp6 *4OS,3NS
44 dp6 4OS,3NS

[0069]45 dp6 *5OS,2NS
46 dp6 5OS,2NS
47 dp6 *5OS,3NS
48 dp6 5OS,3NS
49 dp6 6OS,2NS
50 dp7 2OS
51 dp7 5OS,2NS
52 dp7 6OS,2NS
53 dp8 1OS,4NS
54 dp8 3OS,3NS
55 dp8 4OS,2NS
56 dp8 4OS,3NS
57 dp8 *5OS,3NS
58 dp8 5OS,3NS
*
59 dp8 5OS,4NS
60 dp8 5OS,4NS
61 dp8 7OS,3NS
62 dp8 7OS,4NS
63 dp8 8OS,4NS
64 dp9 2OS,3NS
65 dp10 5OS,3NS

[0070] 注：“*”表示糖链末端含内醚结构，“OS”表示“-O-SO3H”,“NS”表示“-NH-SO3H”。

[0071] 克赛的原料药部分降解产物的质谱分析的总离子流图如图4，组分24的高分辨质谱图示例如图5，组分48的高分辨质谱图示例如图6。通过本方法成功检测到克赛的原料药部分降解产物中从二糖到十糖的65种主要组分，并对其糖链长度、末端结构及“-O-SO3H”和“-NH-SO3H”数目进行确定。