克鲁维酵母属的突变体酵母和使用了该突变体酵母的乙醇的制造方法

摘要

将属于克鲁维酵母属的酵母进行改变以提高来自木糖的乙醇收率。减弱属于克鲁维酵母属的酵母中的选自来源于马克斯克鲁维酵母的ADH1基因、与该ADH1基因在功能上等价的基因、来源于马克斯克鲁维酵母的ADH4基因、和与该ADH4基因在功能上等价的基因中的至少一种基因。

权利要求

1.乙醇的制造方法，其包括以下工序：

用含木糖的培养基来培养马克斯克鲁维酵母突变体的培养工序，所述马克斯克鲁维酵母突变体减弱了马克斯克鲁维酵母中的选自ADH1基因和ADH4基因中的至少一种基因，和然后，从培养基回收乙醇的回收工序。

2.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，将所述培养工序在包含所述马克斯克鲁维酵母突变体、含木素纤维素的生物质和糖化酶的反应体系中进行。

3.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述ADH1基因编码包含序列号2的氨基酸序列的蛋白质。

4.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，所述ADH4基因编码包含序列号4的氨基酸序列的蛋白质。

说明书

克鲁维酵母属的突变体酵母和使用了该突变体酵母的乙醇

的制造方法

技术领域

[0001] 本发明涉及利用了克鲁维酵母属(Kluyveromyces)酵母的突变体酵母和使用了该突变体酵母的乙醇的制造方法。

背景技术

[0002] 包含木素纤维素的生物质可以作为乙醇等有用醇和/或有机酸的原料而被有效地利用。包含木素纤维素的生物质包括木质系生物质和草本系生物质。木质系生物质等包含木素纤维素的生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素构成。为了由包含木素纤维素的生物质制造乙醇等液体燃料，将纤维素和/或半纤维素水解(糖化)至构成单糖，通过发酵而将单糖转换为乙醇。纤维素由葡萄糖构成，半纤维素主要由阿拉伯糖和木糖构成。因此，在利用包含木素纤维素的生物质制造乙醇时，期望不仅葡萄糖，连木糖也作为发酵的底物而被有效地利用。

[0003] 另外，在由包含木素纤维素的生物质制造乙醇时，如果能够将上述的糖化反应和发酵反应同时(不区分各反应工序地)进行，则可以实现制造成本的减低。将该方法称为同时糖化发酵方法。同时糖化发酵中，需要具有能够在糖化酶的反应温度区域(约40℃以上)发酵的耐热性、不仅能够利用葡萄糖还能够利用5碳单糖木糖作为底物的微生物。

[0004] 作为具有耐热性的酵母，已知马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)等克鲁维酵母属(Kluyveromyces)酵母。该克鲁维酵母属酵母能够利用木糖进行乙醇发酵，但其收率不充分。例如，非专利文献1和2中关于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的醇脱氢酶基因(包含多个异构体)报告了功能分析。另外，专利文献1中公开了被赋予了将木糖异构化为木酮糖的能力的重组酵母，还记载了减少醇脱氢酶活性。但是，由这些知识不能判断通过醇脱氢酶基因的缺失和/或破坏会对乙醇发酵能力有怎样的影响。并且，不能判断作为分类学上不同的种的马克斯克鲁维酵母等克鲁维酵母属酵母中的醇脱氢酶基因的功能。

[0005] 现有技术文献

[0006] 专利文献

[0007] 专利文献1：日本特表2005-514951号公报

[0008] 非专利文献

[0009] 非专利文献1：FEMS Yeast Research2,(2002)p.481-494

[0010] 非专利文献2：FEMS Yeast Research8,(2008)p.967-978

发明内容

[0011] 发明要解决的课题

[0012] 如上所述，克鲁维酵母属酵母具有木糖同化性且具有耐热性，因而被较大地期待作为在上述的同时糖化发酵法等中有用的微生物。但是，克鲁维酵母属酵母来自木糖的乙醇收率非常差，另外也不知晓改善该收率的手段。因此，本发明鉴于这样的事实，目的在于提供以提高来自木糖的乙醇收率的方式进行了改变而得的属于克鲁维酵母属的突变体酵母、和使用了该突变体酵母的乙醇的制造方法。

[0013] 用于解决课题的方法

[0014] 为了实现上述目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现，通过减弱克鲁维酵母属酵母中的多个醇脱氢酶基因中的特定的基因，从而该酵母中的来自木糖的乙醇收率大幅提高，从而完成了本发明。即，本发明包含以下(1)～(6)。

[0015] (1)突变体酵母，减弱了属于克鲁维酵母属的酵母中的选自来源于马克斯克鲁维酵母的ADH1基因、与该ADH1基因在功能上等价的基因、来源于马克斯克鲁维酵母的ADH4基因、和与该ADH4基因在功能上等价的基因中的至少一种基因。

[0016] (2)根据(1)所述的突变体酵母，其特征在于，所述属于克鲁维酵母属的酵母是马克斯克鲁维酵母。

[0017] (3)根据(1)所述的突变体酵母，其特征在于，所述与ADH1基因在功能上等价的基因来源于除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母，并编码以下(a)～(c)的任一蛋白质，

[0018] (a)包含序列号2的氨基酸序列的蛋白质，

[0019] (b)包含相对于序列号2的氨基酸序列具有90％以上的序列类似性的氨基酸序列，并具有醇脱氢酶活性的蛋白质，

[0020] (c)包含相对于序列号2的氨基酸序列缺失、替换、添加或插入了1～多个氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脱氢酶活性的蛋白质。

[0021] (4)根据(1)所述的突变体酵母，其特征在于，所述与ADH4基因在功能上等价的基因来源于除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母，并编码以下(a)～(c)的任一蛋白质，

[0022] (a)包含序列号4的氨基酸序列的蛋白质，

[0023] (b)包含相对于序列号4的氨基酸序列具有90％以上的序列类似性的氨基酸序列，并具有醇脱氢酶活性的蛋白质，

[0024] (c)包含相对于序列号4的氨基酸序列缺失、替换、添加或插入了1～多个氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脱氢酶活性的蛋白质。

[0025] (5)乙醇的制造方法，其包括以下工序：

[0026] 用含木糖的培养基来培养(1)～(4)的任一项所述的突变体酵母的培养工序，和[0027] 然后，从培养基回收乙醇的回收工序。

[0028] (6)根据(5)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，将所述培养工序在包含所述突变体酵母、含木素纤维素的生物质和糖化酶的反应体系中进行。

[0029] 本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2011-076715号的说明书和/或附图所记载的内容。

[0030] 发明的效果

[0031] 本发明的突变体酵母来自葡萄糖的乙醇收率几乎不变，来自木糖的乙醇收率大幅提高。因此，本发明的突变体酵母可以在包含例如来源于木质系生物质等包含木素纤维素的生物质的木糖的培养基中高收率地制造乙醇。

[0032] 本发明的乙醇的制造方法通过利用来自木糖的乙醇收率大幅提高了的突变体酵母，从而可以大幅提高乙醇制造效率。

附图说明

[0033] 图1是显示用含木糖的培养基培养4种ADH破坏株时的培养基中的木糖浓度变化的特性图。

[0034] 图2是显示用含木糖的培养基培养4种ADH破坏株时的培养基中的乙醇浓度变化的特性图。

[0035] 图3是显示用含木糖的培养基培养4种ADH破坏株时的菌体浓度变化的特性图。

[0036] 图4是显示用含葡萄糖的培养基培养4种ADH破坏株时的培养基中的木糖醇浓度变化的特性图。

[0037] 图5是显示用含葡萄糖的培养基培养4种ADH破坏株时的培养基中的乙醇浓度变化的特性图。

[0038] 图6是显示用含葡萄糖的培养基培养4种ADH破坏株时的菌体浓度变化的特性图。

[0039] 图7是显示来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)的ADH1与来源于马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)的ADH1之间的比对(alignment)的图。

[0040] 图8是显示来源于酿酒酵母的ADH1与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH2之间的比对的图。

[0041] 图9是显示来源于酿酒酵母的ADH1与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH3之间的比对的图。

[0042] 图10是显示来源于酿酒酵母的ADH1与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH4之间的比对的图。

[0043] 图11是显示来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH1之间的比对的图。

[0044] 图12是显示来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH2之间的比对的图。

[0045] 图13是显示来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH3之间的比对的图。

[0046] 图14是显示来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH4之间的比对的图。

[0047] 图15是显示来源于酿酒酵母的ADH1与来源于酿酒酵母的ADH2之间的比对的图。

具体实施方式

[0048] 本发明的突变体酵母具有以下特征：减弱了克鲁维酵母属酵母中的特定醇脱氢酶基因，来自木糖的乙醇收率提高了。

[0049] 这里，克鲁维酵母属酵母是包含K.aestuarii、K.africanus、K.bacillisporus、K.blattae、多布克鲁维酵母(K.dobzhanskii)、湖北克鲁维酵母(K.hubeiensis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、K.lodderae、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、非发酵克鲁维酵母(K.nonfermentans)、K.piceae、中国克鲁维酵母(K.sinensis)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、K.waltii、威克海姆克鲁维酵母(K.wickerhamii)和亚罗克鲁维酵母(K.yarrowii)等酵母的含义。即，本发明的突变体酵母可以通过对这些具体的克鲁维酵母属酵母及其突变体减弱特定的醇脱氢酶基因来制作。作为克鲁维酵母属酵母，特别优选使用作为耐热性酵母已知的马克斯克鲁维酵母。作为马克斯克鲁维酵母，不特别限定，可以使用在保藏机构能够分售地保存的公知株，另外还可以使用由公知株衍生的突变株。作为马克斯克鲁维酵母的公知株，可列举马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株。作为由公知株衍生的突变株，可例示例如，为了对马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株付与营养缺陷型而破坏ura3基因和/或leu2基因而得的株。

[0050] 本发明的突变体酵母中减弱了特定的醇脱氢酶基因。这里“基因的减弱”是包含降低该基因的表达量、降低由该基因编码的酶的活性这两方面。例如，通过使特定的醇脱氢酶基因破坏或缺失的方法、使该基因的表达控制区(启动子等)破坏或缺失的方法、表达针对该基因的反义RNA的方法等，可以降低该基因的表达量。另外，应用所谓转座子法、转基因法、转录后基因沉默法、RNAi法、无义介导的降解(Nonsense mediated decay,NMD)法、核酶法、反义法、miRNA(微小RNA，micro-RNA)法、siRNA(小干扰RNA，small interfering RNA)法等，可以减低该基因的表达量。进而，通过使醇脱氢酶的抑制剂作用的方法等，可以降低由该基因编码的酶的活性。此外，还可以组合这些方法，来减弱特定的醇脱氢酶基因。

[0051] 另外，本发明的突变体酵母具有来自木糖的乙醇收率提高了的特征。换言之，本发明的突变体酵母具有木糖代谢能力提高了的特征。这里，木糖代谢能力是指将培养基所含的木糖代谢而形成醇的发酵反应的效率。因此，木糖代谢能力的提高，与提高该发酵反应的反应效率成为同义。酵母的木糖代谢能力可以通过用含木糖的培养基进行培养，对产生的醇进行定量来评价。另外，酵母的木糖代谢能力可以以例如培养基所含的木糖的摄入速度(消耗速度)为指标来评价。木糖的摄入速度可以通过经时地测定培养开始时已知浓度的木糖的减少量来计算。

[0052] 减弱的醇脱氢酶基因是存在于克鲁维酵母属酵母中的多个醇脱氢酶基因中的特定的醇脱氢酶基因。具体地，醇脱氢酶基因在马克斯克鲁维酵母中已知4个种类(KmADH1～KmADH4)。在马克斯克鲁维酵母中减弱的醇脱氢酶基因是它们中的KmADH1基因和/或KmADH4基因。在除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母中减弱的醇脱氢酶基因是与KmADH1基因在功能上等价的ADH基因和/或与KmADH4基因在功能上等价的ADH基因。

[0053] 在除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母中，与KmADH1基因在功能上等价的ADH基因和与KmADH4基因在功能上等价的ADH基因可以通过现有公知的方法来鉴定。例如，首先，在除了马克斯克鲁维酵母以外的克鲁维酵母属酵母中特定多个醇脱氢酶基因。而且，从由这些基因编码的醇脱氢酶中，特定具有与由KmADH1基因编码的醇脱氢酶的氨基酸序列序列类似性最高的氨基酸序列的醇脱氢酶。这样特定的醇脱氢酶基因，可以特定为与马克斯克鲁维酵母中的KmADH1基因在功能上等价的基因。此外，在特定与KmADH4基因在功能上等价的基因时也是同样的。这里，序列类似性的值是指使用安装了BLAST(序列局部比对查询工具，Basic Local Alignment Search Tool)程序的计算机以默认的设定求出的值。

[0054] 这里，KmADH1基因的编码区的碱基序列和由KmADH1基因编码的醇脱氢酶的氨基酸序列分别示于序列号1和2。另外，KmADH4基因的编码区的碱基序列和由KmADH4基因编码的醇脱氢酶的氨基酸序列分别示于序列号3和4。

[0055] 此外，存在于马克斯克鲁维酵母中的这些KmADH1基因和KmADH4基因不限于以上的具体的碱基序列和氨基酸序列。即，KmADH1基因和KmADH4基因只要编码具有醇脱氢酶活性的蛋白质，还包含编码含有分别相对于序列号2和4所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、最优选为98％以上的序列类似性的氨基酸序列的蛋白质的基因。这里，序列类似性的值是指使用安装了BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序的计算机以默认的设定求出的值。

[0056] 另外，KmADH1基因和KmADH4基因只要编码具有醇脱氢酶活性的蛋白质，还包含编码含有分别对序列号2和4所示的氨基酸序列缺失、替换、添加或插入了1个或多个(例如2～35个、优选为2～30个、更优选为2～20个、进一步优选为2～10个)氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。

[0057] 进而，KmADH1基因和KmADH4基因只要编码具有醇脱氢酶活性的蛋白质，则也包含相对于分别包含序列号1和3所示的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸的一部分或全部在严格条件下杂交的多核苷酸。这里，严格条件是指具有90％左右、优选为95％、进一步优选为98％的同一性的一对多核苷酸形成特异性杂交的条件(温度条件、盐浓度条件)。

[0058] ＜乙醇制造＞

[0059] 通过利用以上所说明的突变体酵母，可以进行以木糖等糖为底物的乙醇发酵。特别是，上述的本发明的突变体酵母具有优异的木糖代谢能力，即来自木糖的乙醇收率优异，因而适合利用了含木糖的培养基的乙醇发酵。含木糖的培养基是克鲁维酵母属酵母能够生长的培养基，是指至少含有木糖作为成为乙醇合成的底物的糖成分的培养基。此外，含木糖的培养基还可以含有除了木糖以外的糖成分，例如葡萄糖。

[0060] 对含木糖的培养基不特别限定，可以通过在SD培养基、YPD培养基、YPAD培养基、YM培养基和含Yeast Nitrogen Base的各种合成培养基中添加木糖，或者将这些公知培养基所含的糖成分替换成木糖来制备。

[0061] 另外，还可以从木质系生物质、草本系生物质这样的包含木素纤维素的生物质制备含木糖的培养基。即，将包含木素纤维素的生物质所含的纤维素、半纤维素进行糖化处理，使用所得的处理物作为含木糖的培养基。作为糖化处理不特别限定，可以毫不限制地利用现有公知的方法。作为糖化方法，可列举例如，利用稀硫酸或浓硫酸的硫酸法、利用纤维素酶、半纤维素酶的酶法等。另外，可以在糖化处理之前，对木质系生物质、草本系生物质实施现有公知的前处理。作为前处理不特别限定，可列举例如，将木质素用微生物分解的处理，木质系生物质、草本系生物质的粉碎处理，浸渍在离子液体、碱溶液中缓和结构的处理，用高温水进行蒸煮的水热处理，利用氨的处理等。

[0062] 特别是，在由马克斯克鲁维酵母制作的突变体酵母中，耐热性特别优异，因而可以在例如40℃上、优选为35～48℃、更优选为40～42℃这样的比较高温度下进行乙醇发酵。这样的温度区域是纤维素酶、半纤维素酶这样的糖化酶也显示活性的温度区域。因此，该突变体酵母适合利用了糖化酶的所谓同时糖化发酵。这里，同时糖化发酵是指将利用糖化酶的木质系生物质的糖化处理、和来自木糖的乙醇发酵处理在同一反应体系中进行的处理。
更具体地，将含有木质系生物质、糖化酶和突变体酵母的溶液在例如40℃这样的温度条件进行孵育。由此，可以进行木质系生物质的糖化、和来自由糖化而得的木糖、葡萄糖的乙醇发酵，从而制造乙醇。另外，此时即可以搅拌溶液，也可以振荡溶液。

[0063] 另外，在回收由培养基所含的木糖等碳源发酵生产而得的乙醇时，不特别限定，可以应用现有公知的任何方法。例如，上述的乙醇发酵结束后，通过固液分离操作而分离成含乙醇的液层、和含有突变体酵母、固体成分的固层。然后，将液层所含的乙醇通过蒸馏法分离·纯化，从而可以回收纯度高的乙醇。此外，乙醇的纯化度可以根据乙醇的使用目的适宜调整。

[0064] 实施例

[0065] 以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术的范围不限于以下的实施例。

[0066] 〔实施例1〕

[0067] 在本实施例中，使用马克斯克鲁维酵母作为克鲁维酵母属酵母，制作醇脱氢酶基因的破坏株，对来自木糖的乙醇收率进行比较研究。

[0068] ＜株的制作＞

[0069] ＜利用接合、孢子形成的ura3-leu2-突变株的制作＞

[0070] 使用作 为马克 斯克鲁 维酵母DMKU3-1042 株的ura3-株的RAK3605 株(Nonklang,S.et al.,Appl.Environ.Microbiol.74,p.7514-7521(2008))作为基准株。明确了来源于马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的营养缺陷型突变株以低频率成为2倍体。通过紫外线突变可以获得多重营养缺陷型突变株，其结果是在染色体DNA中引入突变的概率上升。为了制作更稳定的株，通过接合和孢子形成，从而为了由2倍体简单地制作多重营养缺陷型株而制作了以下的株。

[0071] 首先，对RAK3605株照射紫外线照射，获得lys-株(RAK3896株:ura3-lys2-)、ade-株(RAK3919株:ura3-ade2-)和leu-株(RAK3966株:ura3-leu2-)。制作在 这些株中将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的URA3随机地向染色体转化而得的 株、RAK4088 株 (ura3-leu2-ScURA3)、RAK4152 株 (ura3-ade2-ScURA3)、RAK4153 株(ura3-lys2-ScURA3)。将RAK4152和RAK4153株在YPD培养基(1%w/v酵母提取物,2%w/v胨,2%葡萄糖,2%w/v琼脂)上以混合的方式划线，向MM培养基(0.17%w/v yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate(酵母氮源，不含氨基酸，不含硫酸铵),0.5%w/v硫酸铵,2%w/v葡萄糖,2%w/v琼脂)复制。将在MM培养基中生长的株RAK4154株(ura3-/ura3-ade2-/ADE2,lys2-/LYS2ScURA3/ScURA3)接菌到在酿酒酵母(S.cerevisiae)中使用的SPO培养基(1%w/v醋酸钾,0.1%w/v酵母提取物,0.05%w/v葡萄糖)中使其形成孢子。

[0072] 为了分离制作的孢子，获得ura-lys-ade-的3重营养缺陷型株，向-A培养基(MM+尿嘧啶,色氨酸,组氨酸盐酸盐,蛋氨酸,亮氨酸,赖氨酸盐酸盐),-K培养基(MM+尿嘧啶,色氨酸,组氨酸盐酸盐,蛋氨酸,亮氨酸,腺嘌呤硫酸盐),-U培养基(MM+色氨酸,组氨酸盐酸盐,蛋氨酸,亮氨酸,赖氨酸盐酸盐,腺嘌呤硫酸盐)复制，成功地从RAK4154株的孢子获得了3株在3种培养基中不能增殖的株。将该株命名为RAK4155株(ura3-lys2-ade2-)。通过同样的方法使RAK4088株与RAK4155株接合，制作RAK4156株(ura3-/ura3-lys2-/LYS2ade2-/ADE2leu2-/LEU2ScURA3/ScURA3)。使该株形成孢子，制作RAK4174株(leu2-ura3-)。

[0073] ＜Ku70破坏株的制作＞

[0074] 马克斯克鲁维酵母由于以高频率发生非同源末端结合修复，因而不能像酿酒酵母(S.cerevisiae)那样利用同源重组修复容易地进行基因破坏(Nonklang,S.et al.,Appl.Environ.Microbiol.74,p.7514-7521(2008))。因此，通过破坏非同源末端结合修复所需的KU70基因来进行高频率地发生同源重组的株的制作。由RAK4174株制作破坏了KU70的RAK4736株(leu2-ura3-Kmku70Δ::ScLEU2)(Abdel-Banat,B.M.et al.,Yeast27,29-39(2010))。

[0075] ＜ADH1破坏株的制作＞

[0076] 马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的ADH1基因中的推定开放阅读框(open reading frame)用Genetyx ver.10(株式会社ゼネティクス)预测。马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的ADH1基因编码由348个氨基酸组成的蛋白质。利用该碱基序列信息设计以下的一对引物。

[0077] KmADH1-167-ASC：5’-GGGGGCACTTCGAACGCTGAAGTATCTTCATCTGGAGTATACCTTTTTTTCGCCACTGGAggcgcgcccggg-3’(序列号5)

[0078] KmADH1+1070c-TDHu：5’-TACCATATCAAAAGGGTCCTTGCTTATTTGGAAGTGTCAACGACAATTCTACCAATGATTtggcagtattgataatgag-3’(序列号6)

[0079] 此外，在上述引物的碱基序列中大写字母表示ADH1的同源区。用该引物由pST106载体(Ano,A.et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.73,p.633-640(2009))合成ScURA3，向RAK4736株转化。其结果制作了RAK6148株(ura3-leu2-ku70Δ::ScLEU2adh1Δ::ScURA3)。

[0080] ＜ADH4破坏株的制作＞

[0081] 马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的ADH4基因中的推定开放阅读框(open reading frame)用Genetyx ver.10(株式会社ゼネティクス)预测。马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的ADH4基因编码由379个氨基酸组成的蛋白质。利用该碱基序列信息设计以下的一对引物。

[0082] KmADH4-60-ASC：5’-CGTACACCCTCAAGCTCATCGCCCGTACACCCACATTATACTATTAATAAACCACAAACAggcgcgcccggg-3’(序列号7)

[0083] KmADH4+1206c：5’-GAAGGATCATCCAAATGAAAAGAAAGGGACGTTAAGTTAGCATAGCTTAGTTGGACTGAGtggcagtattgataatgag-3’(序列号8)

[0084] 此外，在上述引物的碱基序列中大写字母表示ADH4的同源区。用该引物由pST106载体合成ScURA3，向RAK4736株转化。其结果制作了RAK6150株(ura3-leu2-ku70Δ::ScLEU2adh4Δ::ScURA3)。

[0085] ＜ADH2破坏株的制作＞

[0086] 马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的ADH2基因中的推定开放阅读框(open reading frame)通过Genetyx ver.10(株式会社ゼネティクス)预测。马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的ADH2基因与ADH1基因同样地编码由348个氨基酸组成的蛋白质。利用该碱基序列设计以下的一对引物。

[0087] KmADH2-764：5’-CCCACCCACCCACTGCTACA-3’(序列号9)

[0088] KmADH2-1c：5’-catttctagttgttggttgttgttt-3’(序列号10)

[0089] 用这些一对引物以马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042基因组为模板合成ADH2开放阅读框(open reading frame)的上游部分。

[0090] 另外，利用ADH2基因的碱基序列设计以下的一对引物。

[0091] KmADH2+1045：5’-GCGGACTAACTAGCCCATTAGT-3’(序列号11)

[0092] KmADH2-2141c：5’-CCCCACGCACAACGTAAACCTT-3’(序列号12)

[0093] 用这些一对引物以马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042基因组为模板合成ADH2开放阅读框(open reading frame)的下游部分。

[0094] 另一方面，由酿酒酵母(S.cerevisiae)BY4704(MATa ade2Δ::hisGhis3Δ200leu2Δ0met15Δ0trp1Δ63)按照规定方法合成ScURA3基因。

[0095] 以位于ADH2上游区与ADH2下游区之间的方式使如上所得的ScURA3基因融合，向RAK3605株转化。其结果制作了RAK6396株(ura3-adh2Δ::ScURA3)。

[0096] ＜ADH3破坏株的制作＞

[0097] 马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的ADH3基因中的推定开放阅读框(open reading frame)通过Genetyx ver.10(株式会社ゼネティクス)来预测。马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042株的ADH3基因编码由375个氨基酸组成的蛋白质。利用该碱基序列设计以下的一对引物。

[0098] KmADH3-842：5’-GGCCTGGGTTACCACTGGTCCCCTG-3’(序列号13)

[0099] KmADH3-1c：5’-tgttgcgtgatattttctgtgcctg-3’(序列号14)

[0100] 用这些一对引物以马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042基因组为模板合成ADH3开放阅读框(open reading frame)的上游部分。

[0101] 另外，利用ADH3基因的碱基序列设计以下的一对引物。

[0102] KmADH3+1076：5’-TGGAACAAGGTAAGATCTTGGG-3’(序列号15)

[0103] KmADH3+2069c：5’-TTGCAGGATCCAGAATGGGTCAGTG-3’(序列号16)

[0104] 用这些一对引物以马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042基因组为模板合成ADH3开放阅读框(open reading frame)的下游部分。

[0105] 而且，与上述的ADH2破坏株的制作步骤同样地，使ScURA3以位于ADH3上游区与ADH3下游区之间的方式融合，向RAK3605株转化。其结果制作了RAK6398株(ura3-adh3Δ::ScURA3)。

[0106] ＜乙醇发酵试验＞

[0107] 对于如上制作的ADH1破坏株、ADH2破坏株、ADH3破坏株和ADH4破坏株，进行利用葡萄糖的乙醇发酵试验、和利用木糖的乙醇发酵试验。

[0108] ＜前培养＞

[0109] 在加入了YPX(木糖20g/L)培养基20ml的50ml辅管中将上述破坏株接菌一铂环，以30℃、140转/分钟振荡培养6～8小时。接着，将该菌液2.5%在加入了YPX培养基(木糖:20g/L)200ml的500ml三角烧瓶中以30℃、140转/分钟振荡培养一夜。将培养后的酵母离心回收，用灭菌水洗涤3次，制备OD600=30的酵母悬浮液。

[0110] ＜主培养＞

[0111] 在表1所示的条件下培养，确认糖的利用、菌体增殖和乙醇生产。初始的糖浓度，葡萄糖培养为50g/L、木糖培养为20g/L。

[0112] 表1.实验条件

[0113]

[0114] 另外，通过使用岛津制作所社制的分光光度计UV-1800(λ=600)测定菌体浓度来评价菌体增殖。另外，培养基中的糖、乙醇浓度使用岛津制作所社制的HPLC(检测器:RI)来测定。

[0115] ＜结果＞

[0116] 将用含有木糖作为糖成分培养基培养上述破坏株时的“培养基中的木糖浓度变化”、“培养基中的乙醇浓度变化”、“培养基中的木糖醇浓度变化”和“菌体浓度变化”示于图1～3。如图1所示，任一ADH破坏株与野生株相比，木糖的利用均迟缓。特别是ADH2破坏株和ADH3破坏株中木糖利用的迟缓显著。另外，如图2所示，在ADH1破坏株和ADH4破坏株中，与野生株相比，来自木糖的乙醇收率大幅提高。但是，在ADH2破坏株和ADH3破坏株中，没有发现乙醇收率的提高。另外，如图3所示，判断在ADH1破坏株和ADH4破坏株中，具有与野生株等同的菌体增殖能力。另一方面，判断ADH2破坏株和ADH3破坏株与野生株相比，菌体增殖差。

[0117] 另一方面，用含有葡萄糖作为糖成分的培养基培养上述破坏株时的“培养基中的葡萄糖浓度变化”、“培养基中的乙醇浓度变化”、“培养基中的丙三醇浓度变化”和“菌体浓度变化”示于图4～6。如图4～6所示，即使用葡萄糖培养上述破坏株，也仅能实现与野生型相比同程度或者较低的乙醇收率。即明确了，对葡萄糖的摄入、来自葡萄糖的乙醇发酵，破坏任一ADH基因，在利用葡萄糖的乙醇发酵中对乙醇生产性等没有任何影响。换言之，显示如果在克鲁维酵母属酵母中减弱ADH1基因和ADH4基因，则来自木糖的乙醇收率特异性地提高。

[0118] 此外，为了参考，将来源于酿酒酵母的ADH1和ADH2、与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH1～ADH4的氨基酸水平上的同源性的研究结果示于图7～14。图7是来源于酿酒酵母的ADH1与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH1之间的比对。图8是来源于酿酒酵母的ADH1与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH2之间的比对。图9是来源于酿酒酵母的ADH1与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH3之间的比对。图10是来源于酿酒酵母的ADH1与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH4之间的比对。图11是来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH1之间的比对。图12是来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH2之间的比对。图13是来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH3之间的比对。图14是来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH4之间的比对。

[0119] 如图7所示，来源于酿酒酵母的ADH1与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH1之间的同一性和类似性分别为79％和97％。如图8所示，来源于酿酒酵母的ADH1与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH2之间的同一性和类似性分别为86％和96％。如图9所示，来源于酿酒酵母的ADH1与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH3之间的同一性和类似性分别为79％和96％。如图10所示，来源于酿酒酵母的ADH1与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH4之间的同一性和类似性分别为80％和94％。如图11所示，来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH1之间的同一性和类似性分别为79％和97％。如图12所示，来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH2之间的同一性和类似性分别为84％和96％。如图
13所示，来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH3之间的同一性和类似性分别为78％和96％。如图14所示，来源于酿酒酵母的ADH2与来源于马克斯克鲁维酵母的ADH4之间的同一性和类似性分别为80％和95％。

[0120] 此外，将来源于酿酒酵母的ADH1与来源于酿酒酵母的ADH2之间的比对示于图15。如图15所示，来源于酿酒酵母的ADH1与来源于酿酒酵母的ADH2之间的同一性和类似性分别为93％和99％。

[0121] 如以上的图7～14所示，来源于马克斯克鲁维酵母的ADH1～ADH4与来源于酿酒酵母的ADH1和ADH2显示非常高的同一性和类似性，从与来源于酿酒酵母的ADH1和ADH2的比较来推定功能是困难的。因此，减弱克鲁维酵母属酵母的ADH1基因、或减弱ADH4基因而来自木糖的乙醇收率特异性地提高，可以说是令人惊讶的结果。

[0122] 本说明书中引用的全部发行物、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书中。