提供一种颗粒分析和/或分选设备及相关方法。所述实施例的一个方面涉及具有采用用于对检测到的信号进行处理的现场可编程门阵列形式的获取和分选电子器件的分析器或分选器。另一方面，涉及用于对颗粒进行分析和分选的基于液滴的方法，并且还可以包括动态下降延迟这样的动态元素。在又一广泛方面中，提供用于动态地改变其它分选参数的设备和方法。
将包含颗粒的液流输送至检查区，并且利用电磁辐射源在所述检查区处查询所述颗粒，其中被查询颗粒产生发射或反射电磁辐射；
检测被查询颗粒的发射或反射电磁辐射并且生成包含表示被查询颗粒的至少一个特性的至少一个脉冲的至少一个信号；
将所述至少一个信号与触发阈值进行比较以判断颗粒事件的发生；
生成具有事件窗口的事件存储器映射,各所述事件窗口与所述液流的预期能够分选的单位相关联；
使各颗粒事件与所述事件存储器映射中的所述事件窗口之一协调；
根据所述至少一个信号针对各颗粒事件确定测量到的脉冲参数；
基于与各所述事件窗口相关联的事件参数和颗粒分类来应用分选逻辑以作出分选决定；
根据各分选决定来在各事件窗口内对颗粒进行分选；以及
2.根据权利要求1所述的方法，其中，生成包含表示被查询颗粒的至少一个特性的至少一个脉冲的至少一个信号的步骤还包括以下步骤：基于在所述检查区处被激发的颗粒在第一方向上产生的发射或反射电磁辐射来生成第一信号；以及基于在所述检查区处被激发的颗粒在第二方向上产生的发射或反射电磁辐射来生成第二信号。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，使各颗粒事件与所述事件存储器映射中的所述事件窗口之一协调的步骤还包括将所述颗粒事件的时间戳与和所述事件存储器映射中的所述事件窗口相关联的时间进行比较的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，用于各所述事件窗口的事件参数与表示能够分选的单位的时间量相对应。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述能够分选的单位包括预期液滴。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，还包括以下步骤：
根据与所述液滴相关的分选决定来对所述液滴充电；以及
7.根据权利要求6所述的方法，其中，形成液滴的步骤还包括向振荡器施加下降驱动信号以使所述液流形成液滴的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述事件存储器映射的事件窗口是响应于所述下降驱动信号而生成的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，还包括针对各所述事件窗口将所述分选决定记录在所述事件存储器映射中的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，还包括记录导致在所述事件窗口之一中的颗粒未被分选的事件参数的步骤。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述事件参数是从以下中所选择的：液滴数量、液滴时间戳、液滴内的颗粒事件数量、分选结果、光散射、消光、荧光、事件持续时间、事件开始时间、颗粒在液滴中的位置、颗粒分类及其组合。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，测量到的脉冲参数是从包括以下的组中所选择的：前向脉冲峰、侧向脉冲峰、前向脉冲面积、侧向脉冲面积、前向脉冲斜率、侧向脉冲斜率、脉冲持续时间及其组合。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述颗粒包括精子细胞，以及所述颗粒分类包括从包括以下的组中所选择的分类：携带X染色体的精子、携带Y染色体的精子、定向精子、非定向精子、活精子、死精子及其组合。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述至少一个信号与所述触发阈值进行比较以确定颗粒事件的发生的步骤、使各颗粒事件与所述事件存储器映射中的所述事件窗口之一协调的步骤、针对各颗粒事件确定测量到的脉冲参数的步骤、以及基于测量到的脉冲参数来对颗粒分类的步骤是在现场可编程门阵列上进行的。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，基于测量到的脉冲参数来对颗粒分类的步骤还包括将测量到的脉冲参数与采用查找表形式的位图进行比较的步骤。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，还包括从所述事件存储器映射生成状态记录的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述状态记录包括作出所述分选决定所需的信息。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述事件存储器映射中所存储的信息按分选逻辑应用于后续颗粒。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，还包括对所述事件窗口中的单一事件窗口内的颗粒分类进行比较的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，还包括基于收集到的分选颗粒的群的预计纯度来针对具有多于一个的颗粒分类的事件窗口修改分选决定的步骤。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述颗粒包括精子细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，将测量到的脉冲参数与位图查找表进行比较以将精子细胞的子群分类为定向活精子细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，将测量到的脉冲参数与位图查找表进行比较，以将精子细胞分类为携带X染色体的精子细胞或携带Y染色体的精子细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，仅将被分类为定向活精子细胞的精子细胞进一步分类为携带X染色体的精子细胞或携带Y染色体的精子细胞。
25.根据权利要求1所述的方法，其中，还包括从所述事件存储器检测操作参数的预期变化的步骤。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，还包括在根据所述事件存储器映射中所包含的信息检测到操作参数的预期变化的情况下应用补偿的步骤。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述操作参数包括分选延迟，以及在检测到操作参数的预期变化的情况下应用补偿的步骤还包括在预期能够分选的单位的尾端处检测到颗粒的情况下改变所述分选延迟。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中，应用补偿的步骤还包括针对个体的预期能够分选的单位修改分选延迟的步骤。
29.根据权利要求26或27所述的方法，其中，针对颗粒位于能够分选的单位的尾端的预期能够分选的单位，分选延迟增大。
30.根据权利要求26或27所述的方法，其中，针对颗粒位于能够分选的单位的前端的预期能够分选的单位，分选延迟减小。
检测系统，用于基于来自被查询颗粒的发射或反射电磁辐射来产生至少一个信号,将所述至少一个信号与触发阈值进行比较以判断颗粒事件的发生；
具有现场可编程门阵列的处理单元，其与所述检测系统进行通信，所述现场可编程门阵列包括用于根据所述至少一个信号确定事件参数的指令、用于对颗粒分类的指令和用于应用分选逻辑以作出分选决定的指令,所述现场可编程门阵列还包括用于判断预期液滴中的至少一个颗粒的位置的指令；以及分离器，用于根据相应的分选决定来对颗粒进行分选。
32.根据权利要求31所述的颗粒分选系统，其中，所述处理单元包括具有获取和分选电子器件的个人计算机。
33.根据权利要求32所述的颗粒分选系统，其中，所述获取和分选电子器件包括可编程处理器。
34.根据权利要求33所述的颗粒分选系统，其中，所述可编程处理器包括所述现场可编程门阵列。
35.根据权利要求34所述的颗粒分选系统，其中，所述现场可编程门阵列集成于具有PCIe接口的PCIe板上。
36.根据权利要求35所述的颗粒分选系统，其中，所述PCIe板与所述个人计算机共享共用总线。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的颗粒分选系统，其中，所述颗粒输送装置包括喷射空气流式细胞仪分选头，所述喷射空气流式细胞仪分选头用于将试样和鞘液的同轴液流输送至所述检查区。
38.根据权利要求37所述的颗粒分选系统，其中，还包括多个喷射空气流式细胞仪分选头，所述多个喷射空气流式细胞仪分选头用于将试样和鞘液的多个同轴液流输送至多个所述检查区。
39.根据权利要求31至36中任一项所述的颗粒分选系统，其中，所述颗粒输送装置包括微流控芯片，所述微流控芯片用于将通道内的颗粒输送至所述检查区。
40.根据权利要求39所述的颗粒分选系统，其中，所述微流控芯片包括具有多个检查区的多个通道。
41.根据权利要求31至36中任一项所述的颗粒分选系统，其中，所述颗粒输送装置包括喷嘴组件，所述喷嘴组件用于将液流输送至所述检查区，其中所述液流是包括被鞘液的外部流所包围的包含颗粒的试样的芯流的同轴液流。
42.根据权利要求41所述的颗粒分选系统，其中，所述喷嘴组件还包括：振荡器，用于使所述同轴液流在所述检查区的下游侧形成液滴；以及
下降驱动信号生成器，其与所述振荡器进行通信，用于对形成液滴的频率进行控制。
43.根据权利要求42所述的颗粒分选系统，其中，所述下降驱动信号生成器产生具有从包括正弦波、方波、锯齿波和三角波的组中所选择的波形的下降驱动信号。
44.根据权利要求42所述的颗粒分选系统，其中，所述下降驱动信号生成器产生具有不规则波形的下降驱动信号。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的颗粒分选系统，其中，所述下降驱动信号生成器产生具有周期可变的波形的下降驱动信号。
46.根据权利要求42至44中任一项所述的颗粒分选系统，其中，所述下降驱动信号生成器产生具有周期依赖于所述喷嘴组件中的元件或液流的共振频率的波形的下降驱动信号。
47.根据权利要求32至36中任一项所述的颗粒分选系统，其中，所述获取和分选电子器件包括具有所述现场可编程门阵列的PCIe板。
48.根据权利要求42所述的颗粒分选系统，其中，所述下降驱动信号生成器与所述现场可编程门阵列进行通信，并且所述现场可编程门阵列生成具有与各预期液滴相对应的液滴事件窗口的事件存储器映射。
49.根据权利要求48所述的颗粒分选系统，其中，所述现场可编程门阵列经由模数转换器与所述检测系统进行通信，以检测并测量来自所述检测系统的、包含表示颗粒特性的脉冲的信号。
50.根据权利要求49所述的颗粒分选系统，其中，所述现场可编程门阵列测量所述信号的电平并且将所述信号的电平与触发阈值进行比较。
51.根据权利要求50所述的颗粒分选系统，其中，在达到所述触发阈值的情况下，所述现场可编程门阵列根据所述信号计算测量到的脉冲参数，并且测量到的脉冲参数是从包括脉冲峰、脉冲面积、脉冲时间、脉冲斜率、脉冲上的点之间的飞行时间及其组合的组中所选择的。
52.根据权利要求51所述的颗粒分选系统，其中，所述现场可编程门阵列处理检测到的信号和测量到的脉冲参数以确定从包括以下的组中所选择的事件参数：预期液滴内的颗粒的有无、预期液滴内的颗粒的数量、预期液滴中的至少一个颗粒的位置、预期液滴内的颗粒的分类及其组合。
53.根据权利要求52所述的颗粒分选系统，其中，所述事件参数中的至少一个存储在所述事件存储器映射中的与预期液滴相对应的液滴事件窗口处。
54.根据权利要求31至36中任一项所述的颗粒分选系统，其中，所述检测系统至少包括与所述现场可编程门阵列进行通信的第一检测器和第二检测器，以及所述第二检测器用于以与所述第一检测器所进行的测量垂直的方式在所述检查区中进行测量。
55.根据权利要求54所述的颗粒分选系统，其中，所述现场可编程门阵列处理来自所述第一检测器和所述第二检测器的信号以计算从包括以下的组中所选择的测量到的脉冲参数：前向脉冲峰、前向脉冲面积、前向脉冲斜率、侧向脉冲峰、侧向脉冲面积、侧向脉冲斜率、脉冲持续时间、比率及其组合。
56.根据权利要求55所述的颗粒分选系统，其中，所述现场可编程门阵列根据测量到的脉冲参数产生单变量直方图和/或双变量标绘图。
57.根据权利要求55或56所述的颗粒分选系统，其中，所述现场可编程门阵列还包括用于使在所述现场可编程门阵列上确定的测量到的脉冲参数旋转的写入指令。
58.根据权利要求57所述的颗粒分选系统，其中，所述现场可编程门阵列还包括用于将旋转后的测量到的脉冲参数与采用查找表形式的位图进行比较以确定颗粒分类的写入指令。
59.根据权利要求55或56所述的颗粒分选系统，其中，所述现场可编程门阵列处理检测到的信号和测量到的脉冲参数以确定从包括以下的组中所选择的事件参数：预期液滴内的颗粒的有无、预期液滴内的颗粒的数量、预期液滴内的颗粒的分类及其组合。
60.根据权利要求59所述的颗粒分选系统，其中，所述事件参数包括8位字、16位字、
61.根据权利要求59所述的颗粒分选系统，其中，针对各事件，所述事件参数包括1～
62.根据权利要求59所述的颗粒分选系统，其中，所述现场可编程门阵列处理检测到的信号和测量到的脉冲参数以确定脉冲的状态位，其中所述状态位包括颗粒的分类或者颗粒是否并存。
63.根据权利要求62所述的颗粒分选系统，其中，将所述状态位中的至少一个记入所述事件存储器映射中的与预期液滴相对应的液滴事件窗口中。
64.根据权利要求31至36中任一项所述的颗粒分选系统，其中，所述事件参数还包括针对预期液滴的分选决定。
65.根据权利要求64所述的颗粒分选系统，其中，将所述分选决定记入所述事件存储器映射中的与预期液滴相对应的液滴事件窗口中。
66.根据权利要求41所述的颗粒分选系统，其中，所述喷嘴组件还包括定向前端，所述定向前端用于使所述液流中的颗粒定向。
67.根据权利要求31至36中任一项所述的颗粒分选系统，其中，向所述分选决定应用下降延迟。
68.根据权利要求67所述的颗粒分选系统，其中，所述现场可编程门阵列还包括用于确定预期液滴中的颗粒的位置的指令，以及所述现场可编程门阵列还包括用于在预测为预期液滴内的颗粒的位置改变所述下降延迟的情况下、针对个体预期液滴来补偿所述下降延迟的指令。
检测系统，用于产生表示所述检查区处的颗粒的颗粒特性的至少一个信号，将所述至少一个信号与触发阈值进行比较以判断颗粒事件的发生；以及具有现场可编程门阵列的处理单元，其与所述检测系统进行通信，所述现场可编程门阵列包括用于针对各颗粒确定测量到的脉冲参数的指令和用于对颗粒分类的指令，其中，所述现场可编程门阵列还包括用于使在所述现场可编程门阵列上确定的测量到的脉冲参数旋转的写入指令。
70.根据权利要求69所述的颗粒分类系统，其中，所述处理单元包括获取和分选电子器件，所述获取和分选电子器件还包括集成于具有PCIe接口的PCIe板上的所述现场可编程门阵列。
71.根据权利要求70所述的颗粒分类系统，其中，所述PCIe板与个人计算机共享共用总线。
72.根据权利要求69至71中任一项所述的颗粒分类系统，其中，所述颗粒输送装置包括流式细胞仪，所述流式细胞仪用于将试样和鞘液的同轴液流输送至所述检查区。
73.根据权利要求69至71中任一项所述的颗粒分类系统，其中，所述颗粒输送装置包括微流控芯片，所述微流控芯片用于将通道内的颗粒输送至所述检查区。
74.根据权利要求69至71中任一项所述的颗粒分类系统，其中，所述现场可编程门阵列经由模数转换器与所述检测系统进行通信，以检测并测量来自所述检测系统的、包含表示颗粒特性的脉冲的信号。
75.根据权利要求74所述的颗粒分类系统，其中，所述现场可编程门阵列测量所述信号的电平并且将所述信号的电平与触发阈值进行比较。
76.根据权利要求75所述的颗粒分类系统，其中，在达到所述触发阈值的情况下，所述现场可编程门阵列根据所述信号计算测量到的脉冲参数，并且测量到的脉冲参数是从包括脉冲峰、脉冲面积、脉冲时间、脉冲斜率、脉冲上的点之间的飞行时间及其组合的组中所选择的。
77.根据权利要求69至71中任一项所述的颗粒分类系统，其中，所述检测系统至少包括与所述现场可编程门阵列进行通信的第一检测器和第二检测器，以及所述第二检测器用于以与所述第一检测器所进行的测量垂直的方式在所述检查区中进行测量。
78.根据权利要求77所述的颗粒分类系统，其中，所述现场可编程门阵列处理来自所述第一检测器和所述第二检测器的信号以计算从包括以下的组中所选择的测量到的脉冲参数：前向脉冲峰、前向脉冲面积、前向脉冲斜率、侧向脉冲峰、侧向脉冲面积、侧向脉冲斜率、脉冲持续时间及其组合。
79.根据权利要求78所述的颗粒分类系统，其中，所述现场可编程门阵列根据测量到的脉冲参数产生单变量直方图和/或双变量标绘图。
80.根据权利要求69所述的颗粒分类系统，其中，所述现场可编程门阵列还包括用于将旋转后的测量到的脉冲参数与采用查找表形式的位图进行比较以确定颗粒分类的写入指令。
81.根据权利要求80所述的颗粒分类系统，其中，所述现场可编程门阵列处理检测到的信号和测量到的脉冲参数以确定脉冲的状态位。
颗粒分选设备和方法
[0001] 本申请要求2011年2月4日提交的美国临时专利申请61/439,757的优先权，其全部内容通过引用包含于此。
技术领域
[0002] 本发明大体涉及用于对颗粒进行分选的颗粒分选设备和相关方法，并且更特别地，涉及用于控制、操作和最优化针对富集群的颗粒的流式细胞仪的方法和系统。
背景技术
[0003] 为了分析和分离颗粒的目的，存在各种流式细胞仪和微流控系统。这些仪器各自均存在使它们对于特定应用而言不太理想的各种缺点。早期的流式细胞仪能够对液流中的颗粒计数，并且最终能够对具有诸如不同大小等的不同特征的颗粒进行辨别并计数。随着新染料和染色过程的发展，流式细胞仪的用以辨别颗粒特征的能力有所改善，从而产生了用于根据细胞的形状、密度、大小、DNA含量和DNA序列等来分析这些细胞的各种流式细胞仪和技术。细胞的DNA含量可用来确定细胞周期、癌症的有无，或者在精子的情况下，可用来将携带X染色体的精子细胞与携带Y染色体的精子细胞区分开。这些较老的系统利用无法辨别特定近似度内的颗粒的模拟的获取和分选电子器件进行工作，这导致大量颗粒无法分析或分选。
[0004] 通过引入数字信号获取和数字信号处理，流式细胞仪每秒能够评价数量增加的颗粒，并且能够进行更加复杂的多参数分析。Ellison等(WO01/28700)描述了用于与第一数字信号处理器并行地进行诸如平移等的运算的多数字信号处理器配置。同样，Durack等(WO04/088283)描述了用于获取并处理流 式细胞仪信号以对颗粒进行分选的具有四个数字信号处理器的分选器。Durack等和Ellison等各自依赖于触发事件，之后确定并发率并且以FIFO方式向事件应用下降延迟以进行分选。即使在能够并行地独立进行工作的四个数字信号处理器之间分担任务的流式细胞仪的情况下，在快速连续地检测到足够颗粒时，系统也可能出现瓶颈，从而要求对表示颗粒事件的传入数据进行线索提示(cue)。在到达特定线索提示之后，事件被中止以节省处理时间。这些瓶颈和中止可能会导致错误的分选决定。各数字信号处理器一次能进行单一任务并且需要若干数量的时钟周期以实现各任务。在超过40,000个/秒的事件率对事件进行分类并且对颗粒进行分选所需的复杂计算，可能超过四个并行数字信号处理器所能进行的时钟周期的数量。因此，存在针对用于精确地追踪各个体颗粒和各预期液滴周围的参数、并且执行准确的分选决定的稳健方法和设备的需求。
[0005] 分选所用的常用流式细胞仪是诸如Hoffman等(WO01/29538)所描述的喷射空气流式细胞仪。该喷射空气流式细胞仪使颗粒集中在液流内以进行分析并且利用振荡器干扰该液流以分离出颗粒。干扰该液流导致在对颗粒进行查询和分析的检查区的下游形成液滴。为了对液流内的颗粒进行分选，可以紧挨在包括关注颗粒的形成液滴在断裂点处分离之前对该液流进行充电。液滴保持电荷，并且随着该液滴通过断裂点的下游的电磁场，该液滴指向期望位置。
[0006] 需要使液滴电荷信号与包含要分选的颗粒的液滴的断裂精确地协调。过去，该协调需要凭经验的迭代过程，以首先确定下降驱动频率的周期内的然后确定下降驱动频率的一小部分内的下降延迟。随后，诸如美国专利申请公开2011/0221892(Neckels等)所述等，出现了用于计算下降延迟的自动化系统。这些系统各自具有与同液滴中的颗粒位置影响用于对所述液滴进行充电的正确窗口相关联的以前未认识到的问题有关的特定缺点。过去为静态的该参数是进行准确的分选动作所需的最重要的判断之一。因此，需要用于对颗粒、特别是可能影响喷射空气流式细胞仪的诸如下降延迟等的操作参数的颗粒进行分选的改进方法和系统。
发明内容
[0007] 本发明的特定方面涉及用于对颗粒进行分析、分类和分选的改进系统和方法。这种系统的提供在一个实施例中包括：颗粒输送装置，用于将颗粒输送至检查区；电磁辐射源，用于在所述检查区处查询颗粒；检测系统，用于基于来自被查询颗粒的发射或反射电磁辐射来产生至少一个信号；具有现场10可编程门阵列的处理单元，其与所述检测系统进行通信，所述现场可编程门阵列包括用于根据所述至少一个信号确定事件参数的指令、用于对颗粒分类的指令和用于应用分选逻辑以作出分选决定的指令；以及分离器，用于根据相应的分选决定来对颗粒进行分选。
[0008] 本发明的一个方面提供如下系统，其中该系统具有采用经由安装在台式个人计算机(PC)或笔记本电脑上的PCIe板连接的FPGA形式的获取和分选电子器件。这样，获取和分选电子器件可以与PC的图形用户界面共享共用总线。而上述的喷射空气流式细胞仪包括包含模拟获取和分选电子器件的一架电子器件或者包含多个数字信号处理器的大型主板，本发明的特定方面涉及能够进行具有多个数字信号处理器的系统的高速分选但足够紧凑以集成到标准台式PC上的分选和获取电子器件。可选地，还可以使用具有外部PCIe接口的笔记本电脑。在可选方面中，这里所述的实施例可以涉及采用与现场可编程门阵列上所采用的相同的脉冲检测和辨别特征、但不具有用于形成液滴或进行分选的机构的分析器。
[0009] 本发明的另一方面涉及用于利用基于液滴的方法进行分选的改进的系统和方法。这种方法可以通过生成具有与液滴的预期形成相对应的事件窗口以对颗粒进行分选的事件存储器映射来实现。可以将事件存储器映射编译到FPGA的随机存取存储器(RAM)中，以追踪与表示颗粒的各事件有关的信息以及追踪与各预期液滴有关的事件和参数。在一个方面中，事件存储器映射提供与液滴的形成相关联的事件参数的编译。针对各液滴的事件参数可以包括液滴中的颗粒的数量、液滴中的颗粒的位置、液滴内的颗粒的分类以及与液滴和颗粒有关的其它信息。可以响应于如存储在事件存储器映射中那样的预期液滴和周围液滴的事件参数，根据编译在状态机上的分选逻辑来作出分选决定。
[0010] 本发明的一个方面涉及包括用于基于事件存储器映射中所存储的事件参数来动态修改分选器的操作参数的指令或步骤的改进系统和方法。作为一个非限制性示例，可以针对颗粒位于液滴的尾端附近的个体液滴修改下降延迟。还可以基于相关的事件参数，针对个体预期液滴来修改为了分选而应用于液流的电荷信号的振幅、持续时间或者甚至形状。其它的操作参数可以包括为了形成液滴所产生的下降驱动信号的形状、频率、相位或振幅，对试样或鞘液的压力，甚至分选模式。可以基于累积统计或基于对任一个事件参数的统计采样来修改这些操作参数。作为另一非限制性示例，可以改变试样压力从而增加或减少包含一个以上的颗粒的液滴的数量。
[0011] 本发明的特定方面涉及用于利用基于液滴的方法对颗粒进行分析、分类和分选的改进系统和方法。这种方法的提供包括以下步骤：生成具有事件窗口的事件存储器映射；将包含颗粒的液流输送至检查区，并且利用电磁辐射源在所述检查区处查询所述颗粒，其中被查询颗粒产生发射或反射电磁辐射；检测被查询颗粒的发射或反射电磁辐射并且产生包含表示被查询颗粒的特性的脉冲的至少一个信号；将所述至少一个信号与触发阈值进行比较以判断颗粒事件的发生；使各颗粒事件与所述事件存储器映射中的事件窗口协调；针对各颗粒事件确定测量到的脉冲参数；基于测量到的脉冲参数来对颗 粒分类；针对各事件窗口确定事件参数；基于与各事件窗口相关联的事件参数和颗粒分类来应用分选逻辑以作出分选决定；根据各分选决定来在各事件窗口内对颗粒进行分选；以及收集至少一个群的分选颗粒。
[0012] 基于液滴的方法的一个方面涉及在分选处理期间对事件存储器映射进行编译的方法和设备。该事件存储器映射可以包括与对应于液滴的各检测脉冲和各预期液滴有关的信息，而与该液滴及其附近液滴是否包含颗粒无关。这样，这里提供的特定方面得到对所有事件和所有液滴的更精确追踪。事件存储器映射内的与事件窗口相关联的事件参数可以如前面所述用于对操作分选参数进行实时调整，或者可以被提供为数学模型中的输入以用于作出分选决定。该数学模型可以包括用于预测与分类有关的概率、与颗粒最终处于哪个液滴中有关的概率、预计纯度或其它相关信息的模型。事件存储器映射提供具有改进解译的逻辑更清晰的工具，以经由结构化的变量追踪实现更准确的分选系统。作为示例，事件存储器映射可以记录针对周围的预期液滴的事件参数，并且应用用于处理当前液滴之前的液滴和当前液滴之后的液滴这两者的分选逻辑。
[0013] 基于液滴的方法的另一方面涉及具有在单一现场可编程门阵列(FPGA)上实现的清晰明确的逻辑以进行更好的解释及更准确的分选动作的方法和设备。单一FPGA可被编程为并行地进行数千个任务。该结构可以提供始终准备好除去下一事件的获取和分选处理器，从而有效地消除由并行数字信号处理器的限制所创建的线索提示的需求。例如，FPGA可以编程有如下指令，其中这些指令用于检测表示液流内的颗粒的有无的脉冲，以及计算该脉冲的测量到的脉冲参数。现场可编程门阵列上的其它指令可以包括用于基于测量到的脉冲参数来对颗粒分类的指令，以及确定与预期脉冲要被分选至的液滴有关的事件参数的指令。现场可编程门阵列还可以包括用于基于与预期液滴相关联的事件参数以及基于预期液滴内的所有脉冲的分类来应用分选逻辑 的指令。
[0014] 本发明的目的可以是提供用于进行更准确的分选动作的设备和方法。具体地，这里提供的方法和系统的一个广义目的提供在能够无需线索提示的情况下处理检测到的各事件、以基于处理能力来防止中止事件的设备和方法。
[0015] 这里提供的另一广义目的可以是与事件是否与各液滴相关联无关地追踪各事件及追踪各液滴周围的参数。
[0016] 本发明的又一目的是提供用于动态地修改与分选有关的操作参数以提高分选精度的系统和设备。
[0017] 本发明的广义目的是提供用于分选颗粒的设备和满足上述需求的用于分选颗粒的方法。自然，在整个说明书中提供了本发明的其它目的。
附图说明
[0018] 图1示出根据本发明的特定方面的具有安装在PCIe板上的获取和分选电子器件的流式细胞仪。
[0019] 图2示出图1中的流式细胞仪的特定方面的俯视图。
[0020] 图3示出根据本发明的特定方面的微流控芯片的实施例。
[0021] 图4示出根据本发明的特定方面的包括获取和分选电子器件的流式细胞仪的实施例的示意图。
[0022] 图5示出表示通过检查区的颗粒的示例脉冲。
[0023] 图6示出根据本发明的特定方面的测量到的脉冲参数的单变量标绘图。
[0024] 图7示出根据本发明的特定方面的双变量标绘图。
具体实施方式
[0025] 这里所述的实施例涉及诸如利用流式细胞术等对颗粒的分析和分选。可以将以下所提供的多个创造性的概念相结合或者应用于除流式细胞仪以外的 分选系统。
[0026] 颗粒分选系统
[0027] 现在首先参考图1，将颗粒分选系统10的示例作为喷射空气流式细胞仪来进行说明。颗粒分选系统10可以包括采用有时被称为分选头的喷射空气流式细胞仪分选头50的形式的颗粒输送装置12，其中该颗粒输送装置12用于将颗粒14输送至检测系统22，然后输送至分离器34。
[0028] 颗粒14可以是流体内的诸如细菌等的单细胞组织或个体细胞，诸如各种血细胞、精子或从组织衍生的核等。根据应用，可以利用所选择的各种染剂、探测器或标记对颗粒14染色以辨别颗粒或颗粒特征。一些染剂或标记将仅结合至特定结构，而诸如DNA/RNA染料等的其它染剂或标记可以以化学计量的方式结合至核DNA或RNA。颗粒14可以被响应于激发源而发出荧光的荧光染料染色。作为一个非限制性示例，可以利用以化学计量方式结合至X染色剂和Y染色体的Hoechst33342对精子染色。美国专利5,135,759(Johnson等)和美国专利7,758,811(Durack等)描述了用于对精子染色的方法，并且各自通过引用被包含于此。在有方向的精子中，可以确定Hoechst33342的相对量从而提供用于将携带X染色体的精子与携带Y染色体的精子区分开的方式。另外，设想特定实施例利用顺次的DNA序列特定染料和性别特定染料进行工作。
[0029] 分选头50可以提供用于将颗粒14输送至检测系统22、更具体为输送至检查区16的部件。这里，考虑使用诸如流体通道等的其它颗粒输送装置12。分选头50可以包括用于形成液流64的喷嘴组件62。液流64可以是同轴液流64，其中该同轴液流64具有：被称为芯流的内流66，其包含试样54；以及外部流70，其包括鞘液56。试样54可以包括关注的细胞或颗粒，以及用于将细胞保存在活的有机体内的生物流体、以及其它增容剂或成分。试样54可以经由试样入口88连接至喷嘴组件62而进入具有上游端82和下游端84的喷嘴体80内。注射针90可以与试样入口88流体连通以将喷嘴体80内的中央的试样54的内流 66向着下游端84输送。可以经由喷嘴体80的上游端82处的鞘入口86来供给鞘液
56。鞘液56可以形成用于使试样54的内流66向着喷嘴体80的下游端84在流体力学上会聚的外部流70。
[0030] 除了液流64的形成以外，喷嘴组件62可以用于使试样54中的颗粒14定向。与定向前端124相结合的喷嘴体80的内部几何形状可以向诸如非球形颗粒等的颗粒施加趋于使这些颗粒取相似方位的力。Buchanan等的美国专利6,263,745和美国专利6,784,768中描述了用于使颗粒定向的内部喷嘴体几何形状的示例，其中各专利通过引用包含于此。还考虑将本发明的教导与诸如传统喷射空气流式细胞仪等的被配置成无定向部件的流式细胞仪或其它装置、或者浸没透镜流式细胞仪、或者诸如美国专利6,819,411所述的具有径向收集或径向照明部件的装置一起使用。
[0031] 为了进行分离颗粒的功能，喷嘴组件62还可以包括振荡器72，其中该振荡器72用于使液流64在检查区16的下游侧分离成液滴74。振荡器72可以包括响应于下降驱动信号78来可预测地干扰液流64的压电晶体。在图1中，下降驱动信号78通过与承载下降驱动信号78的振荡器72的电连接来表示。下降驱动信号的波形形状、相位、振幅和频率可能会直接影响液滴的形状和大小以及随体的存在。在分选期间，可以响应于各种操作参数或事件参数来修改下降驱动信号78的振幅、形状、相位或频率。
[0032] 图1提供包括内流66和外部流70的液流64的放大图。以表示包含可以是精子细胞150的颗粒14的预期液滴100(a～g)的区段来示出液流64。内流66、外部流70、预期液滴100或颗粒14中的任一个的尺寸可以是不按比例示出的。各预期液滴100中所包括的液流的长度依赖于下降驱动信号78的频率。同样，内流66和外部流70的宽度分别可以由将试样54和鞘液供给至喷嘴体80的压力来确定。大致在检查区16处例示出包含颗粒输送装置12所输送以供检查的颗粒14的预期液滴100d。还例示出包含单一颗粒的三个其它预期液滴100a、100b、 100g，而例示出包含两个颗粒的一个预期液滴100e，并且将其它两个预期液滴100c、100f例示为空。
[0033] 一旦将诸如染色颗粒等的颗粒14输送至检查区16，就可以利用电磁辐射源18来查询颗粒14。电磁辐射源18可以是弧光灯或激光。作为一个非限制性示例，电磁辐射源18可以是以指定波长发射辐射52的光子的脉冲激光。脉冲激光的波长可以基于关注颗粒特征来选择，并且可以被选择为与辨别该特征所使用的任何染剂或标记的激发波长一致。作为非限制性示例，可以利用从Newport Spectra-Physics取得的脉冲型Vanguard Laser来查询UV可激发染剂族，并且该族可以具有355nm的发射波长并且可以以175mW进行工作。
[0034] 检查区16处的颗粒14可以响应于激光查询而产生以发射(荧光)或反射(散射)电磁辐射20的形式的二次电磁辐射。发射或散射电磁辐射20的特性可以提供与颗粒14的特征有关的信息。可以在多个方向和/或以多个指定波长对发射或散射电磁辐射20的强度进行定量，以提供与查询颗粒有关的大量信息。
[0035] 图1示出包括有时称为至少一个检测器的第一检测器128的检测系统22，其中该第一检测器被配置为检测来自检查区16中的颗粒14的发射或反射电磁辐射20。检测系统22可以包括在相对于检查区16的一个或多个方向配置的任意数量的检测器。第一检测器128和任何其它检测器向处理单元24通信信号以辨别颗粒及确定分选动作。作为非限制性示例，第一检测器128可被配置成沿着前方向、或者沿着光子从电磁辐射源18向着检查区16传播的相同方向。第一检测器128可以是包括用于遮挡特定波长以下的任何电磁辐射的滤波器的前向荧光检测器。可以沿着包括后方向、前方向和/或侧方向的多个方向来配置多个检测器。各方向可以包括集光透镜、反射元件、或者与分光器相组合的物镜、分色镜、滤波器和用于检测从任何特定方向收集到的各种波长的强度的其它光学元件的光学结构。还可以采用用于检测消光或光散射的光学结构。
[0036] 简要参考图2，从俯视图示出检测器系统22的示例。第一检测器128可以与可被视为前方向或处于0°的电磁辐射源18所发射的辐射52的光子对准。在一个实施例中，第一检测器128可以是用于产生定量地表示入射到第一检测器128上的发射或反射电磁辐射20的电信号的光电倍增管(PMT)。从Hamamtsu公司取得示例性的光电倍增管。
[0037] 可以使位于第一方向上的物镜152会聚以沿着第一方向收集发射或反射电磁辐射20。还考虑与上述系统一起使用的其它的集光透镜或元件。可以选择与物镜152成直线的滤波器154以滤除电磁辐射源18所发射的辐射52的光子。还可以采用包括分色镜、低通滤波器、高通滤波器、带通滤波器和薄膜滤波器的其它光学元件来引导发射或反射的电磁辐射20。作为一个示例，滤波器129可以滤除波长小于420nm的光，从而使得第一检测器128能够产生与入射到第一检测器128上的荧光的量成比例的电输出。可选地，滤波器154可以包括用于收集特定波长的光的带通滤波器。
[0038] 第二检测器130可以沿着第二方向配置。作为示例，第二检测器130可以沿着相对于辐射52的光子传播成90°的侧方向(大致垂直于用于收集侧向荧光的第一检测器)配置。第二检测器130可以包括：物镜156，用于在第二方向会聚入射到PMT上的电磁辐射；以及滤波器158，用于遮挡特定波长的电磁辐射。第一检测器128和第二检测器130可以沿着任意方向配置，并且哪个检测器被称为第一检测器、哪个检测器被称为第二检测器可以是任意的。
[0039] 仍参考图2，在液流64的内流66中可以看见颗粒14。颗粒14被示出具有宽的扁平侧和较窄侧。这些非球形颗粒的示例可以是红细胞或精子细胞。根据关注的特性，当这些颗粒14进入检查区16时，可以将这些颗粒14大体定向为朝向这两个检测器的其中一个均匀地呈现扁平面并且朝向另一个检测器均匀地呈现窄边。
[0040] 返回图1，利用用于调整各检测器128中的增益的PMT控制器140来控制各 检测器128。各检测器所产生的信号在被传递至处理单元24之前可以在检测器前置放大器142处进行放大。根据关注的颗粒特性，可以采用包括但不限于光电二极管或雪崩光电二极管的除PMT以外的传感器。
[0041] 在特定实施例中，处理单元24可以是包括响应于检测器128、130所产生的信号来使分选头50和分离器34工作所需的所有获取和分选电子器件40的个人台式计算机。在另一实施例中，处理单元24可以包括具有到总线的外部PCIe接口的笔记本电脑。示例性的台式PC可以运行诸如Windows XP或最近的Windows操作系统的32位操作系统，并且可以包括双核处理器并且具有至少256MB的RAM。获取和分选电子器件40可以在具有可编程处理器的PCIe板44上实现。可编程处理器可以是从XILINX,San Jose,California US取得的诸如Spartan3A等的现场可编程门阵列26。还可以使用包括数千个可配置逻辑块的其它现场可编程门阵列。期望现场可编程门阵列26可以具有可以与主时钟异步工作的可配置逻辑块。还期望现场可编程门阵列可以具有有分布式RAM存储器和没有分布式RAM存储器的可配置逻辑块。
[0042] 与放大单元112相结合，处理单元24包括能够替换包括模拟电子器件的大支架TM的一些流式细胞仪的数字升级。具体地，来自模拟MoFlo (Beckman Coulter，以前可从Cytomation取得)流式细胞仪的支架可以被放大单元112和台式计算机替换，其中该台式计算机包括具有这里所述的现场可编程门阵列26(FPGA)的PCIe板44。PCIe板44应被理解为包括具有PCIe接口46的板或卡。
[0043] 获取和分选电子器件40或PCIe板44可以经由台式计算机内的共用总线48相连接以将所获取信号的单变量直方图、双变量标绘图及其它图形表示显示在图形用户界面94(GUI)所用的显示器上。诸如监视器、触摸屏监视器、键盘或鼠标等的输入装置可以与GUI94相关联以控制分选头50或分离器34的各方面。
[0044] 如以下将更详细说明地，具有FPGA26的PCIe板44可以进行工作以通过获 取第一检测器128或第二检测器130所产生的信号并且在PCIe板44上执行指令来识别这些信号中的脉冲23(参见图5)的发生。检测到的各脉冲23可以表示在检查区16内存在颗粒14并且可以定义事件或颗粒事件。通常，现场可编程门阵列包含数千个可编程、可互连逻辑块。本发明的实施例包括用于跨编程互连的路径进行并行操作以进行以下功能中的一个或多个的FPGA：检测脉冲，计算测量到的脉冲参数，使测量到的脉冲参数平移；对颗粒进行分类；编译事件参数；以及作出分选决定。可以将编程架构存储在个体可配置块中、或者包括具有RAM的可配置块和不具有RAM的可配置块的可配置块的组合中。写入的指令可以包括在这些可配置块和可配置块的组合中，并且该指令可以包括位图查找表(LUT)状态机和其它编程架构。在一个方面中，存储在FPGA上的写入的指令可以是为了构件事件存储器映射而提供的，其中该事件存储器映射针对各液滴追踪事件参数、以及追踪各液滴内的各事件的参数。
[0045] FPGA26可以产生多个控制信号116以控制分选头50。控制信号116可以控制用户在GUI94处设置的控制操作参数，或者可以基于检测到的事件参数来动态地调整参数。控制信号116可以包括：下降驱动信号78，用于对振荡器72进行控制；以及电荷信号92，用于基于分选决定来对液流64的电荷进行控制。在图1中，电荷信号92通过用于将电荷信号92从处理单元24传送至放大单元112的电连接和用于从放大单元112将电荷信号92在喷嘴组件62内传送至电荷连接126的电连接来代表。从放大单元112传送至电荷连接126的电荷信号92与鞘液56进行通信。附加控制信号116可以包括由从FPGA26到放大单元
112和从放大单元112到闪光灯122的电连接表示的频闪信号120。
[0046] 一旦针对特定颗粒14确定了分选决定，则紧挨在液滴74从液流64断裂从而包成颗粒14之前，可以利用适当电荷对液流64进行充电。可以使液滴74经受分离器34所产生的电磁场以基于期望特性来从物理上分离颗粒14。在空气喷射流式细胞仪的情况下，分离器34可以包括偏转板114。偏转板114可以包 括用于产生在液滴74通过时作用于液滴74的电磁场的高极性电压。偏转板114可以被充电直至±3,000伏以使液滴74以高速偏转至收集容器126内。
[0047] 简要参考图3，以微流控芯片58的形式示出可选的颗粒输送装置12'和分离器34'。颗粒输送装置12'可以包括用于使包含颗粒14的试样54进入流体室54'以穿过检查区16'的试样入口88'。试样54可以与内部通道壁绝缘以及/或者与经由鞘入口86'引入的鞘液56在流体力学上会聚。在检查区16'进行检查之后，利用如针对图2所述的测量系统那样的测量系统，可以利用分离器34'使流体室54'内的颗粒14机械地指向第一流路
57或第二流路59，以改变流体压力或使流体流转向。例示的分离器34'包括在被按压时可以使颗粒转向至第二流路59内的隔膜。还可以使用诸如变换器和开关等的其它机械或电机械开关部件来使颗粒流转向。
[0048] 现场可编程门阵列上的PCIe板处理
[0049] 图4提供诸如图1所示的系统等的颗粒分选系统10的图示。颗粒分选系统10可以包括检测系统22，其中该检测系统22与处理单元24进行通信，用于检测并处理颗粒14在检查区16处所产生的信号。处理单元24可以包括获取和分选电子器件40和图形用户界面(GUI)94，用于进行颗粒分类、作出液滴分选决定、显示数据以及修改颗粒输送装置12的操作参数。
[0050] 图4提供了专注于处理单元24、特别是采用包括FPGA26的PCIe板44的形式的获取和分选电子器件40。从物理上，FPGA26可以包括数千个可配置逻辑块、输入/输出块、块RAM和主块208。为了图4的目的，RAM206可以表示在物理上位于FPGA26内的一个位置处的块RAM以及整个FPGA26内的分布式RAM这两者。分布式RAM可以包括触发器、移位寄存器和用于调用所存储的变量的其它软件和硬件架构。可配置逻辑块可以利用用于进行多个逻辑功能或计算的写入指令来进行单独编程，并且可配置逻辑块可以单独或作为块的集合进行任务。如图4所示，省略了输入/输出块，并且一些可配置逻 辑块根据它们进行的功能而被分组和进行特征表现。
[0051] 检测系统22可以提供来自第一检测器128和第二检测器130的信号，其中这些信号可以由检测器前置放大器142进行缓冲和/或放大并且由模数转换器102(ADC)进行采样，从而以105MSPS的采样率从该信号中进行16位获取。从Analog Devices Inc.可获得示例性的ADC转换器。一旦数字化，则这些信号可以通过特定指令由FPGA26进行处理，其中这些特定指令用于检测有时被称为事件或颗粒事件的脉冲23的有无，针对各事件计算测量到的脉冲参数，基于测量到的脉冲参数来对颗粒分类，确定与预期液滴有关的事件参数，并且基于这些事件参数和颗粒分类来向液滴应用分选逻辑。
[0052] 根据试样流体的颗粒大小和压力，颗粒14可能需要约1.3秒来穿过检查区16，由此通过ADC102得到200次数据获取。另外，根据下降驱动频率，预期液滴还可以具有约1500次获取的等同量。一旦通过ADC102获取产生了诸如16位参数等的、表示来自PMT的原始荧光值的数字信号，则可以利用阈值比较器将该数字信号与阈值104进行比较以确定脉冲23或颗粒事件。阈值104可以包括用于确定脉冲的开始、或用于确定脉冲23的上升沿的发生的第一阈值。可以采用第二阈值来确定下降沿或脉冲23的末端。第一阈值和第二阈值可以是相同值，或者第一阈值可以是比第二阈值高的值。原始荧光值和与峰有关的信息可以存储在FPGA26内的RAM上，并且由并行的可配置逻辑块的组再次调用以进行其它处理、以及确定与个体颗粒14以及液滴100相关联的状态位。
[0053] 简要参考图5，将表示颗粒事件的脉冲23示出为随时间经过的以mV为单位的检测器信号。电压可以表示第一检测器128或第二检测器130的放大输出并且可以包含根据这些信号可以确定的测量脉冲参数。例示出脉冲峰值108作为该峰信号值。有时被称为脉冲宽度的脉冲持续时间144可以表示信号保持在阈值104以上的事件，但还可以被表示为在阈值104以上的获取的次数。
[0054] 返回图4，FPGA26包括用于基于获取到的信号来确定测量脉冲参数106的具有写入指令的一组可配置逻辑块。在超过阈值104的时间段内，一组可配置逻辑块可以执行写入指令，以进行将后续的各获取值与来自第一检测器(前向检测器)的前一最高值进行比较以确定前向脉冲峰132的功能。同样，另一组可配置逻辑块可以执行写入指令，以进行将后续的各获取值与来自第二检测器(侧向检测器)的前一最高值进行比较以确定侧向脉冲峰138的功能。可以根据关注颗粒来采用具有各种滤波器的附加检测器，以对来自各方向和/或以各波长的附加峰值进行编译。
[0055] 测量脉冲参数106组内的又一组可配置逻辑块可以包括用于对后续的各获取值相加以确定脉冲面积的指令。图4示出根据来自第一检测器128的前向信号所确定的前向脉冲面积134。脉冲持续时间144可以根据任意检测器来计算，并且可以代表在阈值104以上的获取的次数。前向峰值132、侧向峰值138、前向面积134和脉冲持续时间144各自是在FPGA26上可以计算出的测量脉冲参数的非限制性示例。基于获取到的检测器信号在FPGA26上可以计算出的其它值可以包括扩展窗口面积、缩减窗口面积、偏移峰、上升斜率、下降斜率、其比率及其组合。
[0056] 基于FPGA26架构，可以并行地计算测量到的脉冲参数106。一旦脉冲23或颗粒事件结束，则测量到的脉冲参数106立即可用于进一步处理，并且读取可配置逻辑门以根据新事件进行与获取有关的运算操作。
[0057] 可以利用一系列可配置逻辑门在FPGA26上操作针对前一脉冲获取到的数据。该操作可以包括数据旋转用元件210以提高用户区分数据的能力。在一个非限制性实施例中，数据操作可以包括对漂移或其它因素的补偿。
[0058] 还可以利用FPGA26上的写入指令来处理操作数据以对颗粒分类。可配置逻辑块可以包括用于将旋转数据或未旋转数据与一个或多个位图查找表300(LUT)进行比较的写入指令。LUT(300)可以存储在RAM206中或者可以分布 在可配置逻辑块之间。在例示示例中，第一LUT300a可以包括前向峰荧光值和侧向峰荧光值以判断颗粒是否定向。第二LUT300b可以获取来自第一LUT300a的输入以及前向峰值和前向面积，从而辨别其它颗粒特征。在精子的情况下，第一LUT300a可以将定向精子与非定向精子区分开，并且第二LUT300b可以基于DNA含量的差异来将携带X染色体的精子与携带Y染色体的精子区分开。可以包括可配置逻辑块或一系列可配置逻辑块的、特征表现为状态机的分类元件212可以获取来自LUT300的输出并且向各事件分配一个以上的分类。
[0059] 基于位图LUT300，各事件可被分类成几个类别。在脉冲持续事件超过阈值的事件中，该事件可被分类为多颗粒事件。在精子的情况下，根据所述的前向检测器和侧向检测器，这些事件可被分类为活精子、死精子、定向精子、非定向精子、携带X染色体的镜子、携带Y染色体的精子、其它类型的精子及其组合。然而，还可以在FPGA26上实现其它结构。任意数量的检测器可以配置有用于检测如前面所述的指定波长的发射或反射电磁辐射20的任意数量的滤波器。同样，任意数量的LUT300可被配置为将多个细胞或颗粒特性区分开。
[0060] 可以在FPGA26上实现一组状态机以确定各液滴的事件参数118并且在FPGA26的RAM206中构造事件存储器映射96。可以利用来自下降驱动信号生成器76的输入在事件存储器映射96中创建事件窗口98。下降驱动信号生成器76可以从主时钟208接收时钟信号，并且按期望频率产生用户定义的波形作为输出。该下降驱动信号可以经由数字至模拟转换器214(DAC)然后提供至用于将液流64干扰成液滴74的振荡器72。DAC214能够以50MSPS对16位数字数据进行采样以产生模拟信号。DAC214可以将模拟信号提供至分选头以对附加分选操作进行控制、诸如使偏转板114工作并且对液流64进行充电等。作为向着事件存储器映射96的输入，下降驱动信号生成器76可以提供液滴的预 期前端和液滴74的尾端的精确表示。可以利用事件存储器映射96使包括颗粒分类212的事件参数118与特定事件窗口98(a～g)相关联，从而可以对应于预期液滴100(a～g)(参见图1)。
[0061] 可以根据测量到的脉冲参数106、颗粒分类212、阈值104和下降驱动信号生成器76来确定附加事件参数118。例如，可以利用事件窗口98中的超过阈值104的次数来确定预期液滴100中的颗粒数。同样，参考下降驱动信号生成器76，超过阈值104的时刻可以提供颗粒14在各液滴74中的位置的指示。所确定的各事件参数118可以由一组可配置逻辑块并行确定并且作为状态位存储在RAM206中。然后，可以将这些状态位编译到事件存储器映射96中，或者可以进一步处理以求出事件存储器映射96用的变量或其它状态位。
[0062] 状态记录302可以由状态机基于事件存储器映射96中的信息来进行编译。可以将状态记录302应用于具有用以作出分选决定32的写入指令的几组状态机。这些指令还可被称为分选逻辑32并且用来得出分选决定36。状态记录302可以针对关注液滴内的各事件包括相关事件参数118。另外，状态记录302可以包括针对关注液滴以及前一液滴和下一液滴的相关事件参数118。图4示出用于基于具有当前液滴的事件来进行分选决定的第一组状态机218。作为一个示例，第一组状态机218能够对与多达六个颗粒有关的具有分类和其它相关信息的状态记录302进行处理。第一组状态机218可以基于当前液滴来提供关于与分选试样的期望纯度和预期纯度有关的统计决定的指令。第二组状态机220可以提供与液滴内的颗粒的位置以及前一液滴的状况和下一液滴的状况有关的写入指令。一旦从分选逻辑32得到分选决定36，则可以将该分选决定36应用于考虑到以前所应用的电荷的一系列分选序列状态机222，从而产生为了应用于当前分选电荷信号92的表示正确的电压振幅的信号。作为其中一个非限制性示例，在连续液滴针对同一分选路径进行充电的示例中，各颗粒可能需要比前一电压大20%的电压。
[0063] 最后，可以向表示电荷信号92的信号应用下降延迟224。然后，可以将电荷信号92经由DAC214传递至放大单元112，然后传递至用于对鞘液56进行充电以进行期望分选的分选头50。
[0064] 除了电荷信号92和振荡器72以外，FPGA26可以包括用于控制闪光灯122和偏转板114a、114b的写入指令。可以基于下降驱动信号生成器76、利用在FPGA26内的一系列互连可配置逻辑块上的写入指令来生成频闪信号120。例如，以利用10%的占空周期根据下降驱动信号生成频闪信号。
[0065] FPGA26还可以包括用于产生表示偏转板是应关闭还是打开的信号的一组高电压状态机226。可以将该信号传递通过DAC214，然后通过放大单元112以向各偏转板114a、114b提供高电压。
[0066] 经由与具有FPGA26的PCIe板共享共用总线48的计算机38上的GUI94，可以将针对下降延迟、下降驱动信号生成器、闪光灯、高电压的设置、对LUT300的修改以及分选逻辑应用于FPGA26。共用总线48可以经由PCIe接口46连接PCIe板44。PCIe接口46可以以180兆字节/秒的速率提供数据传送。经由PCIe接口46流向GUI94的数据可以包括根据测量到的脉冲参数和其它变量生成的事件速率、中止速率、总分选颗粒、旋转或未旋转的标绘图。
[0067] 图6示出诸如利用GUI94的监视器或触摸屏可以显示那样的、一个轴表示前向峰荧光并且另一轴表示侧向峰荧光的双变量标绘图146。在本发明的一些方面中，在经由PCIe接口46与图形用户界面进行通信之前，可以利用存储在FPGA26上的指令使双变量数据旋转。该旋转可以通过响应于当前双变量标绘图146的用户输入来实现。
[0068] 图7示出可以形成与分选处理相关联的图形显示的一部分的单变量直方图148。作为非限制性示例，该单变量直方图可以例示具有特定峰强度或面积的颗粒的计数。单变量直方图148可以向用户提供与变化的系数有关的视觉反馈。用户可以调整操作参数，或者可以利用GUI94将指令存储在FPGA或计 算机上用于调整操作参数、以实现期望的变化系数。
[0069] 事件存储器映射
[0070] 在操作中，大致如图1所述的颗粒分选系统10可以提供包含多个颗粒14的液流64。各颗粒14表示在检查区16中产生发射或反射电磁辐射20的脉冲23的事件。脉冲23可以由检测系统22检测到并且由处理单元24转换成数字信号。
[0071] 在处理单元24处，可以在FPGA26的RAM206中生成事件存储器映射96。可以根据来自下降驱动信号生成器78的输入将事件存储器映射96划分成事件窗口98(a～g)，以提供液滴之间的时刻的精确表示。事件窗口98能够存储与一个颗粒和六个颗粒之间有关的信息。在一个实施例中，事件窗口98(a～g)可以包括与在单一液滴内所预期的多达12个颗粒有关的信息。除了下降驱动信号以外，必须确定下降延迟以确保事件窗口98(a～g)(图4)与预期液滴100(a～9)(图1)精确相对应。在下降延迟动态地改变的实施例中，可以将用户定义的校准后的下降延迟称为初始下降延迟。
[0072] 在预期液滴100内，各脉冲23可以表示颗粒14。可以针对前面所述的测量到的脉冲参数106对各脉冲23进行处理，并且各脉冲23可以使一个或多个状态位与各颗粒相关联。第一状态位可以与脉冲23超过阈值104时所确定的事件的存在相关。可以确定附加状态位，诸如颗粒的分类、是否超过表示一个以上的颗粒粘在一起的脉冲持续时间阈值、以及与颗粒有关的其它信息。可以将根据测量到的脉冲参数106所确定的分类存储在事件存储器映射96中的针对分类颗粒的相关事件窗口98中。可以按可以是8位字、16位字、32位字、64位字或128位字的状态位的形式对分类进行分选。可选地，其它参数和测量脉冲参数106可以并行地独立确定，然后编译在事件存储器映射96中。这样，可以通过对可配置逻辑门的相关或独立组进行的异步操作来充分利用现场可编程门阵列26的容量，由此提供用于追踪与各单独事件相关联的参数以及与各液滴相关联的参数的高效稳健的方法。
[0073] 除了个体事件特有的信息以外，与液滴100是否包含颗粒14无关地，事件存储器映射96可以具有与预期液滴100相关联的事件参数118。作为一个示例，脉冲开始的时刻可以与下降驱动信号交叉参考，从而推导出颗粒14在预期液滴100内的位置。这样，可以确定颗粒14的位置的精确判断。这些事件参数118可以由可配置逻辑块组来确定，而这些可配置逻辑块组产生可以存储在事件存储器映射96上的状态位。对于颗粒位置的示例，在颗粒过于接近液滴前端或接近液滴尾端的情况下，可以产生状态位。同样，针对在FPGA26上确定的其它事件参数118中的任何事件参数，可以产生作为8位字、16位字、32位字、64位字或128位字的状态位。
[0074] 作为另一示例，事件参数118可以包括表示预期液滴中的各事件是否具有相同分类的状态位。该状态位可以在纯度模式分选中被利用以得到分选决定。在其它分选模式中，可以将预期液滴内的颗粒的各分类的数量与位图进行比较或者可以采用LUT或其它统计过程。
[0075] 可以将表示事件存储器映射96中的事件参数118的各状态位编译到状态记录302中，其中该状态记录302仅可以包含与作出特定分选决定有关的参数。然后，可以将状态记录302作为输入应用于作为状态机工作的可配置逻辑块组，其中该状态机用于应用分选逻辑32以作出分选决定36。
[0076] 可以将分选决定36自身存储为针对与下一液滴和前一液滴有关的确定的状态位。例如，在后续液滴中需要不同的电荷以实现相同的分选路径。
[0077] 动态分选
[0078] 设置和其它操作参数还可以独立于来自用户在GUI94处的输入而动态地改变。操作参数可以包括表示流式细胞仪的操作的输入参数，其中这些输入参数包括但不限于下降驱动频率、下降驱动振幅、下降驱动波形、下降相位、下降延迟、电荷信号振幅、电荷信号持续时间、试样流速、试样流动压力、鞘流速、鞘流动压力。另外，操作参数可以与诸如但不限于事件发生率、中 止率、分选率、总分选颗粒和分选纯度等的输出参数有关。在一个方面中，事件存储器映射96可以提供用于对颗粒分选系统10进行动态调整的部件。为了周期性地调整与分选相关联的各种参数，可以周期性地对来自事件存储器映射96的数据进行采样。用于改变分选参数的判断可以基于期望吞吐量、期望纯度、系统性能、变化系数或其它参数。例如，可以周期性地调整试样压力和/或鞘压力以提高吞吐量或纯度。可以基于事件存储器映射上的诸如液滴内的事件的位置等的信息，以个体为单位针对特定液滴修改诸如下降延迟等的其它参数。
[0079] 作为非限制性示例，一些细胞、特别是具有尾部的精子细胞在位于期望液滴的尾部边缘时实际上会影响形成液滴的表面张力特性并且改变精确校准后的下降延迟。使向形成液滴施加电荷的时间与下降延迟紧密关联，从而确保各液滴接收正确的电荷。由于针对大多数分选功能、流式细胞仪以20kHz～100kHz的频率形成液滴，因此液滴延迟的极小变化也可能导致向期望液滴施加电荷的错误。即使下降延迟的相位略微偏离，液滴也可能无法接收到想要接收的充足电荷，并且应当为中性的液滴可能接收到小电荷且倾向于维持良好质量/细流。这可能会使与预期保持中性的液滴上的感应电荷有关的形成气流的现象劣化。
[0080] 因此，需要如下装置和方法，其中该装置和方法用于精确地追踪颗粒在预期液滴内的位置，并且在预料到颗粒位置会改变液滴从液流分离的下降延迟的情况下动态地修改该下降延迟。
[0081] 特定实施例可以提供用于确定动态变化的下降延迟的方法和系统并且可以从确定喷射空气流式细胞仪中的初始下降延迟的步骤开始。该初始下降延迟可以在流体细胞术的校准步骤中确定。该初始下降延迟校准可以从用于确定要形成的液滴所需的周期数的粗略校准开始。在该粗略确定之后可以进行表示周期的一小部分的精细确定。这些小部分可以以周期的1/20或1/32为单 位。根据下降驱动频率，可以在FPGA上以小至下降周期的1/1000的增量来表示这些小部分。
[0082] 例如，精子可以根据物种而具有使核的长度延长了2～4倍的尾部。基于液滴的大小，尾部可能延伸穿过形成液滴的端部的可能性增大，并且如此这些尾部可能会影响局部表面张力特性并且改变液滴的预测断裂点。诸如性别分选等的许多应用中所使用的染剂选择性地结合至核DNA。因此，仅基于检测系统所产生的信号，难以区分精子最终是否尾部首先对准。因此，可能期望在精子位于前端的情况下也减少下降延迟。在精子位于液滴的前端右侧的情况下，还可能期望减少前一液滴的下降延迟。
[0083] 作为一个具体示例，在精子的情况中，在液滴的最末1/4中越过事件阈值的情况下，下降延迟可能略微延长。同样，对于位于液滴的最初1/4的精子，下降延迟可能减小。在诸如液滴的最初1/20、或最初1/1000等的小得多的窗口中越过阈值的情况下，还可以修改前向阈值。
[0084] 可以通过用于区分颗粒特性的各种检测系统来检测并分析颗粒从而提供对各液滴的分选决定。除了分选决定以外，还可以以前面论述的方式或者通过其它相似方法来确定各颗粒在液滴内的位置。
[0085] FPGA分选和获取分选
[0086] 染色-在美国专利7,208,265的表3所述的已知用于分选精子的改性TALP缓冲6
剂中，以7.4的pH将精子稀释为每ml约160×l0个精子。将从牛采集的试样在34℃下利用Hoechst33342培养45～60分钟。在培养之后，添加等体积的第二个改性TALP，以使浓
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度减小为约80×l0。第二个改性TALP包括了与第一个改性TALP相同的成分，但添加了4%的蛋黄、40mM的红色食用色素No.40(20g/L)，并且利用HCl使pH下降为5.5。将试样分成两部分。
[0087] 分选-紧挨在分选之前，经由40μm的尼龙网来过滤各试样。以40psi在MoFlo SX(Beckman Coulter,Inc.,CA USA)上对试样的第一部分进行分选。将 触发率和并发率的组合(统称为有效事件发生率)维持为42,500/秒并且针对携带X染色体的精子进行分选。在对试样的第一部分进行分选之后，利用包括具有编程用以分选精子的FPGA处理器的PCIe板的个人计算机来替换模拟获取和分选电子器件。还利用用于向分选头提供信号的放大单元来替换MoFlo放大器。这些修改需要约1小时。然后，利用新的获取和分选电子器件以40psi的压力和约41,000/秒的事件发生率，在同一分选头上对同一试样的第二部分进行分选。对于这两个分选，分选头对约60%的精子进行了定向，而约10%的精子是死的。
[0088] 结果-以42,500个事件/秒的事件发生率对试样的第一部分有效地进行分选。在这些事件中，每秒6,800个并发或者过近而无法处理，另外每秒2000个由于分选逻辑而中止，从而达到每秒分选出5,100个携带X染色体的精子。以41,000个事件/秒的事件发生率来对试样的第二部分进行分选。在41,000个事件/秒中，3,400个由于分选逻辑而中止，同时消除了并发或者过近而无法处理的事件，从而得到每秒6,300个携带X染色体的精子的分选率。这两个分选是针对收集到的试样以约91%的纯度提供的，而FPGA获取和分选电子器件在相当的事件发生率下在分选率上展现出约23.5%的增加。
[0089] 如通过前述可以容易地理解的那样，本发明的基本概念可以以各种方式来体现。本发明涉及流式细胞仪获取和分选电子器件以及方法的包括但不限于本发明的最佳模式的多种不同实施例。
[0090] 如此，说明书所公开的或者本申请附带的图或表所示的本发明的特定实施例或元件不意图限制，而是本发明一般包含的多种实施例或针对其任何特定元件所包含的等同物的示例。另外，本发明的一个实施例或元件的特定说明可能没有明确描述可能的所有实施例或元件；上述描述和附图隐含地公开了多个替代例。
[0091] 应当理解，设备的各元件或方法的各步骤可以利用设备术语或方法术语 来描述。可以根据需要替换这些术语以使本发明所包含的隐含广阔范围明确化。作为其中一个示例，应当理解，可以将方法的所有步骤作为动作、用于进行该动作的方式、或引发该动作的元件公开。同样，可以将设备的各元件作为物理元件或使该物理元件进行的动作公开。作为其中一个示例，“分选器”的公开应被理解为包含“分选”的行为的公开(无论是否明确论述)，相反，在有效地公开了“分选”的行为的情况下，这种公开应被理解为包含“分选器”以及甚至“用于进行分选的部件”的公开。各元件或步骤的这些替代术语应被理解为明确包括在说明书中。
[0092] 另外，关于所使用的各术语，应当理解，除非其在本申请中的应用与下述解释不一致，否则应当理解为在描述中针对各术语包括应被理解为包括在如《兰登书屋韦伯斯特未删节词典》(第二版)所包含的一般的字典定义，这里通过引用而包含各定义。
[0093] 此外，出于本发明的目的，术语“a”或“an”实体是指一个或多个该实体；例如，“容器”是指一个或多个的容器。如此，这里可以可互换地使用术语“a”或“an”、“一个或多个”以及“至少一个”。
[0094] 与是否明确表示无关地，假定利用术语“约”来修饰这里的所有数值。对于本发明的目的，可以将范围表示为“约”一个特定值～“约”另一特定值。在表示这种范围的情况下，另一实施例包括一个特定值～另一特定值。利用端点陈述的数值范围包括在该范围内所包含的所有数值。1～5的数值范围例如包括数值1、1.5、2、2.75、3、3.80、4,5等。还应当理解，各范围的端点在与另一端点有关以及独立于另一端点方面均很重要。在通过使用先行词“约”来将值表示为近似值的情况下，应当理解，该特定值构成另一实施例。
[0095] 因而，申请人应被理解为要求保护以下内容：i)这里所公开的具有获取和分选电子器件的流式细胞仪；ii)所公开和所描述的相关方法；iii)这些装置和方法各自的相似、等同甚至隐含的变形；iv)实现所示、所公开或所述的各功 能的替代实施例；v)实现隐含示出的各功能从而实现所公开和描述的该功能的替代设计和方法；vi)作为单独和独立发明所示出的各特征、组件和步骤；vii)所公开的各种系统或组件所提高的应用；viii)这些系统或组件所产生的结果产品；ix)基本如以上并且参考任一所附示例所述的方法和设备；以及x)前面公开的各元件的各种组合和排列。
[0096] 本专利申请的背景技术部分提供了本发明属于的研究领域的说明。该部分还可以包括或包含特定美国专利、专利申请、公开或者在叙述本发明所涉及的技术状态有关的信息、问题或关注时使用的要求保护的本发明的主题的释义。这里所引用或包含的任何美国专利、专利申请、公开、陈述或其它信息并不意图被解释、构造或视为认作本发明的现有技术。
[0097] 本申请所陈述的权利要求在存在的情况下通过引用作为本发明的该说明书的一部分而被包含于此，并且本申请人明确有权使用这些权利要求的这些包含内容的全部或一部分作为用以支持权利要求中的任意或全部或其任何元件或组件的附加说明，并且本申请人还明确有权根据需要将这些权利要求的包含内容中的一部分或全部或者其任何元件或组件从本说明书移动至权利要求书或者反之亦然，以定义本申请或任何后续申请或继续、分案或部分继续申请所要求保护的事项，或者符合任何国家或条约的专利法律、法规或规章而获得费用减免所依据的任何权益，或者以符合任何国家或条约的专利法律、法规或规章，并且通过引用所包含的这些内容在本申请的包括任何后续的继续、分割或部分继续申请或者任何再颁或延续的整个未决期间应当有效。
[0098] 本申请所陈述的权利要求在存在的情况下还意图说明本发明的有限数量的优选实施例的边界和界限，并且不应当被解读为本发明的最宽实施例或可以要求保护的本发明的实施例的完整列表。申请人不放弃基于以上作为任何继续、分案或部分继续或类似申请的一部分所述的说明书来发展更多权利要求的权利。
