本发明是一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，包括如下步骤：1）外植体消毒处理；2）芽诱导和芽增殖，包括：①取铁线莲“多变海神”当年生的幼嫩茎节和顶芽；②依次用自来水冲洗1h，无菌水冲洗4次；③用灭菌滤纸吸干外植体表面水分，切除叶柄和两端受伤部位。优点：应用组织培养方法，能较好地保持母本的观赏价值，有效地提高铁线莲“多变海神”的繁殖系数；与扦插繁殖相比，生长周期大幅缩短，组织培养法的繁殖系数为扦插繁殖的50~60倍；品种优质、产量可观和便于实地推广。
1.一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，其特征是该方法包括如下步骤：
所述的步骤1）外植体消毒处理，具体包括：①取铁线莲“多变海神”当年生的顶芽；
②依次用自来水冲洗1 h，毛笔来回刷洗20次，于超净工作台上用质量浓度为75%乙醇灭菌20 s，无菌水冲洗2次，之后用质量浓度为0.1%氯化汞灭菌7 min，立即用无菌水冲洗
所述的步骤2）芽诱导和芽增殖，具体包括：①诱导培养
冲洗后将外植体置于培养皿中，用剪刀、镊子切除叶柄、两端受伤部位后，将芽接种于已灭菌的诱导培养基1/2 MS+生长调节物质NAA 0.5mg/L+生长调节物质TDZ 1.0 mg/L +蔗糖20~30 g/L +琼脂7 g/L，pH值为5.8，培养4周，培养温度25℃，光照16 h/d，照度
将诱导的丛生芽分成单芽，继而将单芽接入1/2 MS + 生长调节物质6-BA 1.0 mg/L + 生长调节物质KT 0.5mg/L + 生长调节物质NAA 0.5 mg/L +蔗糖20~30 g/L +琼脂7 g/L的培养基，pH值为5.8，培养4周，温度、光照条件同①诱导培养；
将增殖培养基中叶色浓绿、长度为1~2 cm的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养4星期，光照条件同①诱导培养；
将壮苗培养后长势旺盛的芽接入生根培养基1/2 MS+生长调节物质IBA 0.3 mg/L中，培养40天；温度、光照条件同①诱导培养；
将生根的铁线莲“多变海神”植株的培养瓶瓶盖打开，室温下炼苗6 d后，取出试管苗，洗净，移栽到准备好的由珍珠岩、蛭石、泥炭组成的营养钵中，珍珠岩、蛭石和泥炭间的重量比为1:1:1，保持湿度85%~95%，温度、光照条件同①诱导培养，成活率达95%；
所述的MS基本培养基是由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分所组成；
所述的大量元素为：硝酸钾KNO3，1900 mg·L ,硝酸铵NH4NO3，1650 mg·L ,磷酸二-1 -1氢钾 KH2PO4，170 mg·L ,硫酸镁MgSO4·7 H2O，370 mg·L ,氯化钙CaCl2·4 H2O，440 -1mg·L ；
所述的微量元素为：碘化钾KI，0.83 mg·L ,硼酸H3BO3，6.2 mg·L ，硫酸锰MnSO4·4 -1 -1 -1H2O, 22.3 mg·L ，硫酸锌ZnSO4·7 H2O，8.6 mg·L ，钼酸钠Na2MoO4·2 H2O，0.25 mg·L ,-1 -1硫酸铜CuSO4·5 H2O，0.025 mg·L ,氯化钴CoCl2·6 H2O，0.025 mg·L ；
所述的铁盐为：乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA，37.3 mg·L ,硫酸亚铁FeSO4·7 H2O，-1
所述的有机成分为：肌醇C6H12O6·2H2O，100 mg·L ,甘氨酸 NH2CH2COOH，2 mg·L ,-1 -1盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl，0.1 mg·L ,盐酸吡哆醇C8H11O3N·HCl ，0.5 mg·L ,烟酸-1NC5H4COOH，0.5 mg·L ；
所述的1/2 MS基本培养基的成分为：大量元素是MS基本培养基的一半，其余成分微量元素、铁盐、有机成分与MS基本培养基相同；
所述的生长调节物质6-BA为6-苄基腺嘌呤；NAA为萘乙酸；KT为激动素；IBA为吲哚丁酸, TDZ为噻二唑苯基脲。
一种铁线莲栽培品种多变海神的组织培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及的是一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法（“多变海神” 英文商品名为：Clematis ‘Proteus’），属于植物组织培养技术领域。
背景技术
[0002] 铁线莲属(Clematis L.)隶属于毛茛科(Ranunculaceae)毛茛亚科(Subfam. Ranunculoideae)银莲花族(Trib. Anemoneae)铁线莲亚族(Subtrib. Clematidinae)，常为多年生木质藤本。世界约有355种，我国有147种，其中93种为我国特有种，特有率为63.3%。
[0003] 其萼片花瓣状，色彩丰富，形态多变，茎蔓生，利用叶柄攀援，生长适应性强，园艺用途广泛，观赏价值高，在垂直绿化中具有重要地位，享有“攀援植物皇后”之美称。在日本和西方园林中，铁线莲已占有十分重要的地位，大部分植物园、公园和家庭花园都能见到它们绚丽多彩的身影。此外，该属植物中的许多种如女萎(Clematis apiifolia）、威灵仙(C. chinensis)等作为药用植物使用已久。
[0004] 其种子较难发芽，多用扦插繁殖。采取组织培养法进行铁线莲“多变海神”（英文商品名为：Clematis ‘Proteus’） 的快速繁殖，建立丛生芽生根的无性繁殖体系, 有利于增大繁殖系数，对于铁线莲“多变海神”走向园艺应用具有较强的生产应用价值。
发明内容
[0005] 本发明提出的是一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，其目的是克服铁线莲“多变海神”现有繁殖技术所存在的缺陷，提高其繁殖系数以适应其引种推广及园林应用的需求。
[0006] 本发明的技术解决方案：一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，包括如下步骤：
[0007] 1）外植体消毒处理；
[0008] 2）芽诱导和芽增殖。
[0009] 所述的步骤1）外植体消毒处理 ，具体包括：
[0010] ①取铁线莲“多变海神”当年生的幼嫩茎节和顶芽；
[0011] ②依次用自来水冲洗1 h，毛笔来回刷洗20次，于超净工作台上用质量浓度为75%乙醇灭菌20 s，无菌水冲洗2次，之后用质量浓度为0.1%氯化汞灭菌7 min，立即用无菌水冲洗4次；
[0012] ③用灭菌滤纸吸干外植体表面水分，切除叶柄和两端受伤部位；实验统计的污染率分别为54%、36%，褐化率为44%、35%。
[0013] 所述的步骤2）芽诱导和芽增殖，具体包括：
[0014] ①诱导培养
[0015] 冲洗后将外植体置于培养皿中，用剪刀、镊子切除叶柄、两端受伤部位后，将芽接种于已灭菌的诱导培养基1/2 MS+生长调节物质NAA 0.5mg/L+生长调节物质TDZ 1.0 mg/L +质量浓度为3%的蔗糖20~30 g/L +质量浓度为0.7%的琼脂7g/L，pH值为5.8，培养4周，培养温度25℃，光照16 h/d，照度2400 1x；
[0016] ②不定芽增殖培养
[0017] 将诱导的丛生芽分成单芽，继而将单芽接入1/2 MS + 生长调节物质6-BA 1.0 mg/L + 生长调节物质KT 0.5mg/L + 生长调节物质NAA 0.5 mg/L +质量浓度为3%的蔗糖20~30 g/L +质量浓度为0.7%的琼脂7g/L，的培养基，pH值为5.8，培养4周，温度、光照条件同①丛生芽诱导；
[0018] ③壮苗培养
[0019] 将增殖培养基中叶色浓绿、长度为1~2 cm的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养4星期，光照条件同①丛生芽诱导；
[0020] ④生根培养
[0021] 将壮苗培养后长势旺盛的芽接入生根培养基1/2 MS+生长调节物质IBA 0.3 mg/L中，培养40天。温度、光照条件同①丛生芽诱导；
[0022] ⑤炼苗和移栽
[0023] 将生根的铁线莲“多变海神”植株的培养瓶瓶盖打开，室温下炼苗6 d后，取出试管苗，洗净，移栽到准备好的珍珠岩、蛭石、泥炭珍珠岩，其重量比为珍珠岩：蛭石：泥炭=1:1:1的营养钵中，保持湿度85%~95%，温度、光照条件同②丛生芽诱导，成活率达95%。
[0024] 本发明的优点：应用组织培养方法，能较好地保持母本的观赏价值，有效地提高铁线莲“多变海神”的繁殖系数。与扦插繁殖相比，生长周期大幅缩短，组织培养法的繁殖系数为扦插繁殖的50~60倍。品种优质、产量可观和便于实地推广。
具体实施方式
实施例
[0025] 一种铁线莲栽培品种“多变海神”的组织培养方法，其培养步骤如下：
[0026] 步骤一、外植体消毒处理
[0027] 选取当年生幼嫩茎节和顶芽，依次冲洗1.5 h，于超净工作台上用质量浓度为75%乙醇灭菌20 s，用无菌水冲洗2次，之后用质量浓度为0.1%升汞灭菌7 min，立即用无菌水冲洗3-4次。
[0028] 步骤二、芽诱导和芽增殖
[0029] ①诱导培养
[0030] 冲洗后将外植体置于培养皿中，用剪刀、镊子切除叶柄、两端受伤部位后，将芽接种于已灭菌的诱导培养基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 1.0 mg/L上5周，质量浓度为3%的蔗糖20~30 g/L +质量浓度为0.7%的琼脂7g/L，的培养基，pH 5.7，培养温度25℃；光照条件：光照/黑暗，其中光照16 h/d，光照度为2400 1x。
[0031] ②不定芽增殖培养
[0032] 将诱导培养基中诱导出的丛生芽分成单芽，接入1/2 MS+生长调节物质6-BA 1.0 mg/L+生长调节物质KT 0.5 mg/L+生长调节物质NAA 0.5 mg/L增殖培养基中培养4周光
