微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的制备方法及其应用，具体是以微藻生产二十二碳六烯酸，即DHA的下脚藻粕为原材料，经粉碎、酶解、离心、水浴加热、抽真空、超滤、冷冻干燥，获得微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂。生产出来的皮肤外用粉剂具有抗菌止痒、消炎消肿的功效，适用于神经性皮炎、接触性皮炎、慢性湿疹、虫咬性皮炎及瘙痒性皮肤病的局部治疗。本发明的生产工艺无毒无害无污染，优异、稳定可靠，把藻粕下脚料废物变成医药产品，大大增加了废物的利用率，具有显著的社会和经济效益。

权利要求

1.一种微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的制备方法，其特征在于：以微藻生产二十二碳六烯酸，即DHA 的下脚藻粕为原材料，先将藻粕粉碎成粉末无颗粒，然后加入磷酸盐缓冲液，边加边搅拌均匀后，加入食品级蛋白酶并在37℃酶解混合物，酶解时间为3-6小时；离心取上清液，恒温间接加热，抽真空后，超滤，冷冻干燥获得微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂；所述的磷酸盐缓冲液为PBS，pH 值为7.2-7.8；加入藻粕粉末的重量与PBS 的体积比是1 ：6-10；所述的食品级蛋白酶是胃蛋白酶和胰蛋白酶即酶切位点包括赖氨酸和精氨酸的酶类，此双酶协同作用，按1:1 比例加入到微藻粕液体混合物中，各酶与微藻粕的重量比例是1%-3 %。

2.根据权利要求1 所述的微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的制备方法，其特征在于：

所述微藻为天然或发酵的菌体微藻。

3.根据权利要求1 所述的微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的制备方法，其特征在于：

所述离心转速限制在4500-8000 rpm，时间控制在10-20 min ；所述的恒温间接加热为水浴但不限于水浴，其温度为70℃ ；所述的抽真空其真空度在0.09-0.1 MPa 范围内，时间控制在1-2 小时；所述的超滤是指截留分子量为6000 Da 以下的超滤液体，冷冻干燥获得微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂。

4.一种如权利要求1 所述的制备方法制得的微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂，其特征在于：所述的皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的成分为：生物活性肽、蛋白酶酶解微藻粕的酶解物中的其中一种或多种物质。

说明书

微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，更具体涉及了一种微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 皮肤瘙痒、红肿、发炎是常见的皮肤病，也是一种多发病之一，严重影响人们的健康，通常分为神经性皮炎、接触性皮炎、慢性湿疹、虫咬性皮炎及瘙痒性皮肤病等。患者通常感到瘙痒、疼痛、麻木、灼热等而忍不住去搔抓或摩擦，会导致皮肤疤痕，严重者会导致皮肤癌。因此，一种特效的皮肤抗菌止痒消炎消肿的无毒无害无副作用的药物是众患者迫切所求，而微藻粕蛋白质降解后的生物肽中就有此优良功能的活性成分。微藻如裂殖壶菌藻（Schizochytriumsp.）、吾肯氏壶藻（Ulkenia amoeboida）、寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）等是用来提取DHA（二十二碳六烯酸），其残余物藻粕中不但含有微量残余DHA、磷脂，而且含有一定量的蛋白质、多肽、寡肽、氨基酸以及多糖类等，是一种食品源的医药提取用原材料，已经被证实其无毒无害无副作用。其中DHA是二十二碳六烯酸，俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸，属于Omega-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员。从榨油下脚料藻粕中通过蛋白酶降解的方法获取医药用物质，是把废物变成宝贝，是一项卓越的资源再利用，不但有重要的医药用途，而且还对环境起到一定的保护作用。用微藻粕酶解肽来治疗皮肤病的应用，迄今尚无文献报道。因此，研制一种利用微藻粕肽制备皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的方法及其应用具有十分重要的意义。

发明内容

[0003] 本发明目的是提供一种可以有效治疗神经性皮炎、接触性皮炎、慢性湿疹、虫咬性皮炎、瘙痒性皮肤病以及外阴瘙痒的微藻肽皮肤抗菌止痒消肿的制备方法及其应用。

[0004] 为实现此目的，本发明采用如下技术方案：

[0005] 一种微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的制备方法，其特征在于：以微藻生产二十二碳六烯酸，即DHA的下脚藻粕为原材料。先将藻粕粉碎成粉末无颗粒，然后加入磷酸盐缓冲液，边加边搅拌均匀后，加入食品级蛋白酶并在一定条件下酶解混合物，离心取上清液，恒温间接加热，抽真空后，超滤，冷冻干燥获得微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂。

[0006] 其中，所述的微藻包括但不限于天然或发酵的菌体微藻，如裂殖壶菌藻（Schizochytriumsp.）、吾肯氏壶藻（Ulkenia amoeboida）、寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）等。

[0007] 所述的磷酸盐缓冲液为PBS，pH值为7.2-7.8之间；加入藻粕粉末的重量与PBS的体积比是1：6-10.。

[0008] 所述的食品级蛋白酶主要是胃蛋白酶和胰蛋白酶即酶切位点包括赖氨酸和精氨酸的酶类，此双酶协同作用，按1：1比例加入到藻粕液体混合物中，各酶与藻粕的重量比例是1 %-3 %，酶解时间在3-6小时之间。

[0009] 所述离心转速限制在4500-8000 rpm，时间控制在10-20 min；所述的恒温间接加热为水浴但不限于水浴，其温度为70℃；所述的抽真空其真空度在0.09-0.1 MPa范围内，时间控制在1.5-2小时；所述的超滤是指截留分子量为6000 Da以下的超滤液体，冷冻干燥获得微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂。

[0010] 所述的微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的主要成分是酶降解蛋白质所获得的生物活性肽，并包含有活性肽混合物的任何一种或超过一种物质，所构成的微藻肽具有皮肤抗菌止痒消炎消肿作用，其包含物也具有抗菌止痒消肿的功效。

[0011] 一种微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的应用，不但能够杀死皮肤表面的细菌，还能够消除由中性粒细胞引发的炎症反应，对神经末梢有抑制作用，同时对皮肤表面细胞具有修复作用。因此，所述皮肤抗菌止痒消炎消肿剂主要用于制备治疗神经性皮炎、接触性皮炎、慢性湿疹、虫咬性皮炎、瘙痒性皮肤病以及外阴瘙痒的局部治疗药物或消毒用品或化妆品。

[0012] 本发明的显著优点是：

[0013] 本发明的皮肤抗菌止痒消炎消肿剂，具有疗效快、效果好、药效稳定、使用方便等优点。

[0014] 本发明的原材料微藻粕来自微藻菌类，微藻菌类属于国家批准的强制添加的食品营养补充剂DHA的食品原料来源，制备方法技术含量较高，应用现代高科技设备，提高微藻原料的利用率，在生产过程中也无任何有毒有害的化学试剂的使用，绿色环保，其制备出的产品无毒无害无副作用，优于现有市场上销售的皮肤病药膏，应用于治疗皮肤病方面，抗菌止痒效果显著，也有一定的消炎消肿作用，应用前景非常广阔，具有显著的社会和经济效益。

附图说明

[0015] 图1是本发明的微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂抑制金黄色葡萄球菌的作用效果。

[0016] 图2 是患者被蚊子叮咬后，使用微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的前后对比效果图。

具体实施方式

[0017] 下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施举例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0018] 一、下列实施例所列举的所有微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的制备方法，都具有本发明涉及的方法而不限于所列举方法，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。

[0019] 实施例1

[0020] （1）微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂的制备

[0021] 裂殖壶菌藻DHA（二十二碳六烯酸）油下脚藻粕，粉碎成粉末无颗粒状，称取1 kg，置于酶解罐中，加入8 L pH为7.2 的PBS，搅拌均匀后，加入10 g胃蛋白酶和10 g胰蛋白酶，在37 ℃水解3 h，冷却至室温后，离心转数为4500 rpm，离心10 min分出上清液和沉淀，取上清液；在70℃温度和真空度为0.09 MPa条件下，抽真空1 h，灭酶并脱除腥味；采用截留分子量6000Da的超滤膜超滤，取超滤液体，冷冻干燥，即得微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂。

[0022] （2）抗菌实验

[0023] 采用金黄色葡萄球菌进行抗菌实验。即先将菌斜面接种活化，置于37℃培养箱中培养24h，次日观察斜面长出纯金黄色葡萄球菌；对于已经活化的金黄色葡萄球菌取少量置于100ml液体培养基(配制500ml体系中，牛肉膏2.5g，蛋白胨7.5g和NaCl 2.5g)中进行摇床（37℃，150r/min）培养12h，可看到培养液由澄清变成浑浊。

[0024] 将微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂制成浓度为0.1 mg/ml的液体，取100 ml，加入到有固体培养基(配制500 ml体系中，牛肉膏2.5 g，蛋白胨7.5 g，NaCl 2.5 g和琼脂7.5 g)的培养皿中，涂均匀，同时，以不加微藻肽的空白作为对照；最后再加入80 ul已经被稀释40000倍的菌悬液，在培养皿平板上涂均匀，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养，观察
24 h后菌体生长情况。

[0025] 培养24 h结果如图1所示，其中（a）为实验组 24小时培养的结果，金黄色葡萄球菌生长被抑制；（b）为对照组在24小时后长出大量金黄色葡萄球菌。实验结果表明，微藻肽对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用。

[0026] （3）人体皮肤刺激性试验

[0027] 选择皮肤健康的成人，以前臂内侧区域为受试部位，一侧为试验区，另一侧为对照2
区，取四层医用纱布剪成1 cm，涂上微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂制成的皮肤消炎消肿止痒膏约0.05 g，贴在前臂内侧并盖上聚丙烯塑料薄膜，用医用胶布固定，试验期间适用者不食用辛辣食物、刺激性食物，实验部位不沾水。

[0028] 24小时揭开观察，实验部位均显阴性，即无红斑、丘疹、水肿或其他过敏现象发生，试验连续一周时间，均无红斑、丘疹、水肿或其他过敏现象发生，证明对皮肤无刺激性，且无毒无害无副作用。

[0029] 实施例2

[0030] 吾肯氏壶藻DHA（二十二碳六烯酸）油下脚藻粕，粉碎成粉末无颗粒状，称取1 kg，置于酶解罐中，加入10 L pH为7.4 的PBS，搅拌均匀后，加入20 g胃蛋白酶和20 g胰蛋白酶，在37 ℃水解6 h，冷却至室温后，离心转数为4500 rpm，离心10 min分出上清液和沉淀，取上清液；在70℃温度和真空度为0.09 MPa条件下，抽真空1.5 h，灭酶并脱除腥味；采用截留分子量5000Da的超滤膜超滤，取超滤液体，冷冻干燥，即得微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂。

[0031] 该微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂进行人体皮肤刺激性试验，无红斑、丘疹、水肿或其他过敏现象发生，证明对皮肤无刺激性，且无毒无害无副作用。

[0032] 实施例3

[0033] 寇氏隐甲藻DHA（二十二碳六烯酸）油下脚藻粕，粉碎成粉末无颗粒状，称取1 kg，置于酶解罐中，加入6 L pH为7.4 的PBS，搅拌均匀后，加入10 g胃蛋白酶和10 g胰蛋白酶，在37 ℃水解5 h，冷却至室温后，离心转数为6000 rpm，离心20 min分出上清液和沉淀，取上清液；在70℃温度和真空度为0.10 MPa条件下，抽真空2 h，灭酶并脱除腥味；采用截留分子量4000Da的超滤膜超滤，取超滤液体，冷冻干燥，即得微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂。

[0034] 该微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂进行人体皮肤刺激性试验，无红斑、丘疹、水肿或其他过敏现象发生，证明对皮肤无刺激性，且无毒无害无副作用。

[0035] 实施例4

[0036] 裂殖壶菌藻DHA（二十二碳六烯酸）油下脚藻粕，粉碎成粉末无颗粒状，称取1 kg，置于酶解罐中，加入6 L pH为7.6 的PBS，搅拌均匀后，加入30 g胃蛋白酶和30 g胰蛋白酶，在37 ℃水解6 h，冷却至室温后，离心转数为7000 rpm，离心1 min分出上清液和沉淀，取上清液；在70℃温度和真空度为0.10 MPa条件下，抽真空1.5 h，灭酶并脱除腥味；采用截留分子量3000Da的超滤膜超滤，取超滤液体，冷冻干燥，即得微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂。

[0037] 该微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂进行人体皮肤刺激性试验，无红斑、丘疹、水肿或其他过敏现象发生，证明对皮肤无刺激性，且无毒无害无副作用。

[0038] 实施例5

[0039] 吾肯氏壶藻DHA（二十二碳六烯酸）油下脚藻粕，粉碎成粉末无颗粒状，称取1 kg，置于酶解罐中，加入6 L pH为7.8 的PBS，搅拌均匀后，加入10 g胃蛋白酶和10 g胰蛋白酶，在37 ℃水解6 h，冷却至室温后，离心转数为8000 rpm，离心15 min分出上清液和沉淀，取上清液；在70℃温度和真空度为0.10 MPa条件下，抽真空1.5 h，灭酶并脱除腥味；采用截留分子量2800Da的超滤膜超滤，取超滤液体，冷冻干燥，即得微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂。

[0040] 该微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂进行人体皮肤刺激性试验，无红斑、丘疹、水肿或其他过敏现象发生，证明对皮肤无刺激性，且无毒无害无副作用。

[0041] 二、下列实施例所列举的所有微藻粕皮肤抗菌止痒消炎消肿剂，都具有本发明涉及的药物功能而不限于所列举功能。

[0042] 实施例6 ：神经性皮炎

[0043] 黑龙江省哈尔滨市孙先生，年龄44岁，银屑病，久治不愈，背部手背分布，奇痒难耐，使用医生所开市售药膏，无显著疗效，改用本发明的微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂，配制成10 ug/ml，装入喷剂瓶，喷涂后立即止痒，每天喷涂3次，一周后，手背部分有减少，好转，即止痒效果明显，消炎消肿效果需要一段时间连续给药方能见疗效。

[0044] 实施例7：蚊虫叮咬性皮炎

[0045] 福州市台江区王女士，年龄54岁，杂货店业主，在店里经常被蚊子叮咬，奇痒难耐，使用本发明的微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂，配制成1 mg/ml，装入喷剂瓶，喷涂后立即止痒，一天后，红肿泡紧缩（如图2）。即止痒效果特别明显，消炎消肿效果需要一天时间见疗效，5天后痊愈。

[0046] 实施例8 ：湿疹性皮炎

[0047] 黑龙江省伊春市曹先生，年龄48岁，不明原因左手背部红肿、泡状、奇痒，医生诊断为丘疹皮炎，使用医生所开市售药膏，无显著疗效，改用本发明的微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂，配制成1 mg/ml，装入喷剂瓶，喷涂后立即止痒，连续喷涂3天，泡明显皱缩，4天后痊愈。

[0048] 实施例9：接触性皮炎

[0049] 黑龙江省伊春市尹先生，年龄50岁，系裤腰带接触皮肤导致腰部皮肤红肿、泡状、触痒，涂抹本发明的微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂，涂上后，接触即不痒了，半天后红肿消失，泡紧缩，破皮处结硬壳，3天痊愈。

[0050] 实施例10：瘙痒性皮炎

[0051] 黑龙江省伊春市朱女士，年龄46岁，外阴部瘙痒，涂抹本发明的微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂，立即止痒，当天痊愈。

[0052] 实施例11：蚊虫叮咬性皮炎

[0053] 黑龙江省伊春市姜先生，年龄54岁，钓鱼爱好者，经常被蚊子叮咬，奇痒，使用本发明的微藻肽皮肤抗菌止痒消炎消肿剂，制备过程中采用超滤3000Da的超滤膜，获得含6000Da产物的包含物，配制成0.1 mg/ml，装入喷剂瓶，喷涂后立即止痒，一天后，红肿部位消失，即止痒效果特别明显，消炎消肿效果需要一天时间见疗效。