一种抑菌抗病毒卫生巾

摘要

本发明涉及女性用品领域，具体地，涉及一种抑菌抗病毒卫生巾。本发明提供一种抑菌抗病毒卫生巾，所述卫生巾的表面接枝有干扰素-α。接枝IFN-α的卫生巾具有抑菌抗病毒、生物安全性高的特征，能有效地减少因卫生巾的使用不当而引起的妇科疾病的发病率。

权利要求

1.一种抑菌抗病毒卫生巾，其特征在于，所述卫生巾的表面接枝有干扰素-α；所述2

卫生巾的表层材料是聚丙烯或聚乙烯；所述干扰素-α的浓度为5-100ng/cm；所述干扰素-α是通过光化学固定技术接枝在卫生巾表面的；

具体接枝方法如下：

S1.将所述干扰素-α与N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀亚酰胺反应形成光活性干扰素-α，S11.往反应容器中加入N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀亚酰胺的DMF/PBS溶液，加入干扰素-α后再加入DMF/PBS溶液，其中干扰素-α与DMF/PBS溶液总体积的比例为1μg:1mL；

S12.在3~5℃及闭光条件下，冰浴搅拌24~48h；

S13.将产物在3~5℃下冷冻离心；

S2.在紫外线的照射下，将光活性干扰素-α接枝在卫生巾表面，其中，步骤S11所述N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀亚酰胺的DMF/PBS溶液中，N-(4-叠氮-3 -3苯甲酸基)琥珀亚酰胺的浓度为6×10 mg/mL~8×10 mg/mL；

步骤S13所述冷冻离心的条件设定为：离心1h，暂停0.5h，循环6次，转速4000rp/min。

2.根据权利要求1所述的抑菌抗病毒卫生巾，其特征在于，所述卫生巾为ABC品牌护垫或护舒宝品牌卫生巾。

3.根据权利要求2所述的抑菌抗病毒卫生巾，其特征在于，当所述卫生巾为ABC品牌护2

垫时，所述干扰素-α的浓度为5-10ng/cm；当所述卫生巾为护舒宝品牌卫生巾时，所述干2

扰素-α的浓度为50-100 ng/cm。

说明书

一种抑菌抗病毒卫生巾

技术领域

[0001] 本发明涉及女性用品领域，具体地，涉及一种抑菌抗病毒卫生巾。

背景技术

[0002] 一、卫生巾的现状。

[0003] 卫生巾是妇女经期使用品，是一种高吸水性聚合物（SAPS），由于其具有良好的吸收性、不渗透性、柔软、舒适、卫生、使用简单、携带方便等优点，已取代传统的卫生纸，被广大妇女接受而成为必备的生理卫生用品。

[0004] 通过调查发现，月经期间，细菌可逆行进入阴道，不注意经期卫生，滥用不洁卫生纸，致使外阴受不洁卫生纸和月经棉塞污染，病菌乘机滋生进犯。不少妇女受到妇科疾病的困扰。使用不合格的卫生巾，有38%的人患有严重的妇科疾病，73%的女性会在经期感到局部皮肤瘙痒、烧灼、灼痛，80%左右的女性用上不洁的卫生巾后，还会在经期出现高烧、头痛、2
腹痛等症状。普通卫生巾连续使用2小时后，表层细菌总数可达107个/cm。

[0005] 市场上的各种抗菌剂，均会在一定程度上破坏细胞结构，损伤细胞，安全性不高、毒性及对皮肤和阴道粘膜的刺激都较大，缺乏稳定性。

[0006] 二、重组人干扰素α

[0007] 干扰素（interferon，IFN）是一种具有抗病毒作用、抗增殖和免疫调节功能的细胞因子。它在宿主天然免疫防御中起着重要的作用。根据受体复合物的不同，可将干扰素分为I、II、III型。I型干扰素包括13种IFN-α亚型，IFN-β、IFN-δ、IFN-κ、IFN-ω、IFN-τ；II型干扰素包括IFN-γ；III型干扰素包括IFN-λ或称IL-28/29。干扰素经诱导产生后，通过与不同受体结合激发不同的信号转导通路，进而刺激下游效应蛋白的产生，通过这些效应蛋白途径最终发挥抗病毒作用。因此，干扰素目前在临床中主要用于治疗乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）感染，以及其他一系列病症，如恶性肿瘤和多发性硬化症等。

[0008] 干扰素局部使用可使病变局部及其相邻的正常组织细胞产生抗病毒蛋白（2’-5’寡腺苷酸合成酶，蛋白激酶，磷酸二腺酶等），阻断病毒的复制；同时干扰素可提高自然杀伤细胞（NK细胞）对病毒的杀伤活性，增强单核巨噬细胞的吞噬功能，增强T细胞的杀伤作用和天然杀伤细胞的功能，从而达到抗病毒的作用。此外，干扰素的激素样作用还可调节体内雌二醇和孕酮的水平，使宫颈分泌物减少，改善阴道内环境，也有利于阻断病毒的复制。将抗病毒药物以外用的方式应用于妇科，无耐药性，使用方便，无明显副反应，是近年药物治疗慢性宫颈炎比较满意的药物。

[0009] 重组人干扰素α（recombinant human interferon,rh-IFN-α）是病毒感染和恶性肿瘤的重要治疗药物，临床用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎、生殖器疣及疱疹等病毒性疾病，毛细胞白血病、粒细胞白血病等。

[0010] 三、光化学固定技术。

[0011] 光化学固定法是指利用紫外或可见光（200-800nm）将具有特定功能的分子或组分偶联到材料表面的方法，其原理是利用带有双官能团（一般来说，其一为热活性基团，另一为光活性基团）的光偶联剂将生物活性化合物分子偶联到材料表面来达到改性表面的目]的 。其途径通常分为两类：（1）将目的分子与光偶联剂上的热活性基团进行化学反应，形成带有光活性基团的衍生物，然后进行光化学反应使目的分子共价偶联到高分子材料表面；
（2）首先用光偶联剂对高分子材料表面进行光化学处理，然后再通过光偶联剂上的热活性基团与目的分子发生反应。

[0012] 光化学固定法可以提高高分子材料的表面性能而完全不影响材料的本体性质。光化学固定接枝技术能大大地降低目的涂层试剂在医用高分子材料表面产生的无序交联，这样的改性表面比用其他表面涂层方法所得的表面有更显著的特定活性。

[0013] 光化学固定法比自由基、等离子等表面接枝反应有更多的优点：它在一分钟内进行极快的反应；可以通过真正的“一步”过程形成稳定的碳、碳键；同时容易在普通的加工条件下使用（不使用真空或控温仪器等复杂装置）；适用于几乎所有的高聚物表面；能成功地固定各种类型的可溶的合成高分子和生物高分子；可以再“掩蔽曝光”条件下进行特定位点的接枝和多次涂层。

[0014] 从上个世纪90年代初开始，国内外研究者对光化学固定法的研究已经有了很大发展。光化学固定法能将被接枝物质（如多肽、酶、生长因子、蛋白质等）接枝在生物医用高分子材料表面，制备出具有各种活性、各种用途的的生物医用材料。研究表明，光化学固定后生物医用材料等的各种活性比游离的、空白的生物医用材料明显增强。

[0015] 四、生物材料。

[0016] 生物材料也称为生物医学材料，是指以医疗为目的，用于与生物组织接触以形成功能的无生命的材料，如骨，它是一种具有良好的机械性能的，蛋白质和矿物质组合的纳米复合材料。目前，生物材料主要包括医用高分子材料、生物陶瓷、医用金属材料等。其中高分子材料主要应用在人体器官、医疗器械和药物剂型三个方面：人工器官包括内脏和体外装置；医疗器械应用在一般医疗及看护工具、麻醉即手术室用具、检查及检查室用具；药物剂型主要应用在药物的助剂和聚合物药物的合成，主要方法是将高分子药物，以惰性水溶性聚合物作分子载体，把具有药性的高分子化合物，通过共价键或离子键与载体的测基连接，制成聚合物药物。

发明内容

[0017] 近年来，妇科疾病的发病率普遍增高，通过调查发现，这可能是由于月经期间，细菌可逆行进入阴道，不注意经期卫生，滥用不洁卫生纸，致使外阴受不洁卫生纸和月经棉塞污染，病菌乘机滋生进犯。卫生巾是妇女经期使用的生理卫生产品，具有良好的吸收性，被广大妇女所接受。本发明的目的在于克服现有卫生巾容易被细菌病毒污染的缺陷，提供一种抑菌抗病毒卫生巾。

[0018] 为了达到上述目的，本发明提供一种抑菌抗病毒卫生巾，其中所述卫生巾的表面接枝有干扰素-α（即IFN-α，特别为IFN-α2b）。接枝IFN-α的卫生巾具有抑菌抗病毒、生物安全性高的特征，能有效地减少因卫生巾的使用不当而引起的妇科疾病的发病率。

[0019] 本发明首次将具有抗病毒作用的干扰素-α接枝在卫生巾表层材料上，得到一种新型生物材料。在使用卫生巾的同时，干扰素-α也发挥了作用，与其他干扰素膏剂或凝胶剂等相比，它是通过皮肤角质层接触，可减少药物进入血液循环，从而避免增加血药浓度带来的副作用。由于干扰素-α的抗病毒作用，大大地提升了卫生巾的安全性。

[0020] 上述干扰素-α可以通过各种现有的方式接枝到卫生巾表面。由于光化学固定技术是本发明发现的较为成熟的实验方法，所以，所述干扰素-α优选地是通过光化学固定技术接枝在卫生巾表面的。本发明主要从检验这种新型生物材料的抑菌和抗病毒能力为出发点。本发明首次将干扰素利用光化学固定技术固定在卫生巾表面制备成新型生物材料。

[0021] 如上所述，可以通过多种途径完成光化学固定。优选地，先将所述干扰素-α形成光活性干扰素-α，然后在紫外线的照射下，将光活性干扰素-α接枝在卫生巾表面。

[0022] 光活性干扰素-α是指带有光活性基团的干扰素-α，优选采用干扰素-α与N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀亚酰胺反应形成光活性干扰素-α。

[0023] 在一个优选的实施方式中，所述光活性干扰素-α的制备步骤如下：

[0024] （1）往反应容器中加入N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀亚酰胺的DMF/PBS溶液，加入干扰素-α后再加入DMF/PBS溶液，其中干扰素-α与DMF/PBS溶液总体积的比例为1μg:1mL；

[0025] （2）在3~5℃及闭光条件下，冰浴搅拌24~48h；

[0026] （3）将产物在3~5℃下冷冻离心。

[0027] 优选地，所述N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀亚酰胺的DMF/PBS溶液中，N-琥珀亚酰-3 -3 -3胺的浓度为6×10 mg/mL~8×10 mg/mL，更优选为7.68x10 mg/mL。

[0028] 优选地，所述冷冻离心的设定为：离心1h，暂停0.5h，循环6次，转速4000rp/min。

[0029] 本发明的进一步实验发现，干扰素-α在生物材料表面的浓度对其抑菌抗病毒作用有一定影响。对于某些卫生巾品牌，需要控制适当的干扰素-α浓度才能达到良好的抗2
菌效果。因此所述干扰素-α的浓度优选为5-100ng/cm。在该浓度下，几乎所有接枝后的卫生巾都能达到较好的抑菌效果。

[0030] 所述卫生巾可以是任何种类的卫生巾，其表层材料主要是聚丙烯或者聚乙烯。优选地，所述卫生巾为ABC品牌护垫或护舒宝品牌卫生巾。当所述卫生巾为ABC品牌护垫时，2
所述干扰素-α的浓度优选为5-10ng/cm；当所述卫生巾为护舒宝品牌卫生巾时，所述干
2
扰素-α的浓度优选为50-100 ng/cm。

[0031] 对于本发明形成的新型生物材料，我们先通过电镜扫描观察干扰素接枝在卫生巾表层的三维空间状况，会发现在材料表层上会有白色颗粒物质附着，确定为干扰素颗粒。因为通过光化学固定技术接枝在材料表面的干扰素IFN-α含量相对较少，只有50ng，所以在材料表层并没有大规模出现。同时在处理接枝后的材料时，我们采用PBS溶液冲洗材料，也清除了附着在材料上的杂质和其他物质。

[0032] 在这种新型生物材料抑菌实验的检测中，我们采用淋球菌为实验对象，并通过贴膜扩散法验证抑菌能力的方法。这是因为淋球菌(n.gonorrhoeae)是一种人体寄生菌，常存在与阴道炎的脓性分泌物的白细胞中，是导致妇科疾病的细菌之一。贴膜实验主要是通过将细菌污染与抗菌制品（新型生物材料）表面，使细菌与抗菌制品表面充分接触，以测定其抑菌效果。从实验结果会发现，对比空白组并随着时间的增加，接枝干扰素的材料周围菌落相对较少，证明具有一定的抑菌能力。在以往的报道中，并没有报道出干扰素IFN-α2b具有抑菌能力，但是本实验结论却证实了这一点。关于干扰素IFN-α2b通过光化学固定在卫生巾后的抑菌机理由推测如下：干扰素IFN-α2b分子通过一定途径进入细菌内，和微生物内的核糖亚单元分子片断相互作用，破坏了细菌体内从DNA到RNA的转录，阻碍mRNA的密码子的相互作用，导致细菌繁殖终止，达到抑菌目的。

[0033] IFN具有广谱抗病毒、免疫调节等作用，IFN结合到细胞表面受体依靠促发和诱导多种抗病毒蛋白而发挥抗病毒作用，其中PKR、2’，5’-寡腺苷酸合成酶(2’，5’-OAS)、MxA、MxB等最为重要。MxA蛋白是I型干扰素诱导产生的分布于细胞质中的蛋白质，具有广谱的抗病毒活性，对正黏病毒、副黏病毒等有敏感的抗病毒作用，而2’，5’-OAS则是选择性地降解病毒mRNA而发挥抑制病毒的复制。另外Fulvia Terenzi等人报道了P56蛋白也是由干扰素诱导产生的抗病毒蛋白。为此我们通过检验IFN诱导产生的P56蛋白、MxA蛋白和2’，5’-OAS这三种抗病毒蛋白，间接地检测这种新型生物材料的抗病毒作用。

[0034] 本发明已完成P56蛋白的检验，从免疫印迹的结果可以看出，两组材料的空白组P56蛋白含量都相对较少，而添加了IFN-α2b处理后的蛋白含量则相对较多，并且固定组的蛋白含量比游离组的含量更多。我们从这组免疫印迹的结果中，不难推断，把光活性IFN-α接枝在材料表面，作用于HeLa细胞，会诱导细胞产生P56蛋白，并且这种蛋白的含量比游离组处理的含量更多。在接下来的实验中，会陆续检验所提取的蛋白，从而间接验证这种新型生物材料的抗病毒作用。

[0035] 综上，本文所制备的新型生物材料，即通过光化学固定技术将IFN-α接枝在卫生巾表层的材料，不仅具有抑菌也具有抗病毒作用。这种新型生物材料的抑菌作用不同与市场的抗菌药物，它能够减少过度使用抗菌药物而导致的三种危害，即：抗菌药物的滥用导致大量耐药菌的产生，使难治性感染越来越多，病菌感染的机会越来越大，治疗感染性疾病的费用也越来越高，对人类的健康构成了严重威胁；抗菌药物的广泛使用，导致人类自身对细菌免疫力的下降；抗菌药物品种繁多，应用面广，由其引起的不良反应。这种新型生物材料也具备抗病毒的作用，这为一些患有妇科疾病的妇女，在使用卫生巾的时，为她们提供了治疗的机会。并且这种抑菌和抗病毒的卫生巾，在使用期间，由于干扰素的存在，也大大地减少了细菌或病毒伺机感染人体的机会，对妇女月经期间提供了很好的安全保障。

附图说明

[0036] 图1为光活性干扰素α的合成原理图。

[0037] 图2为光活性干扰素α的紫外光谱图。

[0038] 图3为光活性干扰素α的拉曼图谱图。

[0039] 图4为光固定生物材料的制备过程图。

[0040] 图5A、图5B为光固定生物材料的电镜扫描图。

[0041] 图6为贴膜法过程图。

[0042] 图7A、图7B为光活性IFN-α的抑菌能力检测图。

[0043] 图8为P56蛋白免疫印迹结果。

具体实施方式

[0044] 以下实施例中使用的材料、试剂与仪器如下所示：

[0045] 一、材料；ABC品牌护垫、护舒宝品牌卫生巾。

[0046] 二、细胞株：人子宫颈癌细胞(HeLa细胞系)、人肝星状细胞(HSC细胞系)、人卵巢癌细胞系(OVCAR细胞系)是从中山大学医学院动物中心购买，经本实验室传代培养并保存。

[0047] 三、主要试剂：重组人干扰素α1b 购自中山大学第三附属医院；淋球菌、TB培养基、新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；培养基低糖DMEM、胰酶均为 GIBCO2BRI公司产品；24 孔组织培养聚苯乙烯基板为BIOFIL 公司产品；P56抗体为SAB公司产品。

[0048] 四、仪器：Nikon 显微镜，日本Olympus公司光学倒置显微镜，Sigma32184 高速冷冻离心机，Thermo CO2 培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，HV-85高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。

[0049] 实施例1：光活性干扰素-α的制备及检测

[0050] 光活性干扰素α的合成原理如图1所示。具体过程如下：首先按体积比4:1配制-320mL的DMF/PBS溶液（量筒称取后加入烧杯内），同时配制7.68x10 mg/mL的N-(4-叠氮苯-3
甲酸基)琥珀亚酰胺的DMF/PBS溶液。取高压灭菌的棕色瓶，加入1mL的7.68x10 mg/mL的N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀亚酰胺的DMF/PBS的溶液，加入5微克的IFN-α，加入4 mL的DMF/PBS溶液，反应总体积为5mL。在棕色广口瓶内加入一个磁力搅拌子，放到装冰水混合物的烧杯内，棕色瓶可用锡纸包裹（封口胶），控制温度在4℃，将搅拌机放在泡沫箱内，在闭光条件下，冰浴搅拌48h。结束后，超滤药物：将合成的药物转入5mL的超滤离心管内，4℃冷冻离心机，离1h，停0.5h，循环6次，4000rp/min。

[0051] 对制备好的光活性干扰素α进行紫外光谱检测和拉曼图谱检测。其结果如图2和图3所示。

[0052] 从图2的紫外光谱中可以看出N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀亚酰胺的紫外吸收峰在271nm处，干扰素-α的紫外吸收峰为210nm，而合成后的光活性干扰素-α的吸收峰为221nm处，其特征峰向桥联剂的长波方向移动，说明N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀亚酰胺与干扰素-α反应后产生一种新物质，我们推断，这种新物质，即为光活性的干扰素-α。

[0053] 在图3的拉曼图谱中，N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀亚酰胺的叠氮基的伸缩峰在2055处，合成后光活性干扰素-α在2138附近出现该特征峰；另外对比干扰素-α和光活性干扰素-α，两种药物在1300和1460处具有相同的特征峰，其中1460处存在羧基特征峰，从这组数据中，也同样说明光活性干扰素-α药物合成。

[0054] 实施例2：光固定化材料的制备与检测

[0055] 如图4所示，将实施例1制备的光活性干扰素-α，在紫外线的照射下，接枝在干燥的生物材料（卫生巾）表面，这个过程中要注意避光。然后取样用PBS洗涤，通过电镜扫描图检测干扰素接枝在生物材料表面的情况，结果如图5A和图5B所示。

[0056] 在图5A的电镜扫描图中，图a是空白ABC护垫材料，放大后的图c可以直观发现这种材料表面相对光滑；接枝光活性药物后，图b与图d中能够显示出材料表面出现了纳米级的白色小颗粒，并且从图像中显示了吸附在材料表面的状况。同样，图5B的电镜扫描图中，图a与图c是空白组护舒宝卫生巾材料，其三维立体结构相对杂乱，但是材料表面额是很光滑无附着物。但是通过观察图b与图d，仍然能够发现其表面的白色颗粒附着物。

[0057] 由于光活性药物用紫外接枝在材料表面后，需要用PBS冲洗数次才能够进行实验观察，所以排除了药物只是轻贴在材料表面的情况。

[0058] 综上所述，我们通过电镜扫描图，成功的检验了光活性干扰素已接枝在材料表面，为接下来的实验，提供了必要的保证。以下实施例均使用实施例2得到的接枝有干扰素的生物材料。

[0059] 实施例3：光固定干扰素-α材料抑菌能力的检测（贴膜扩散法）

[0060] 贴膜扩散法的过程如图6所示。具体如下：对所有实验用品进行高温高压灭菌处理，用接种环挑取经TM培养基平板纯化后的淋球菌（约半环）置入无菌生理盐水（2mL），用麦氏比浊管进行对比，稀释为约105CFU/ml左右的菌悬液，用棉拭子均匀涂布于培养基表面，培养16h后，使用无菌镊子将六个浓度的材料接枝面朝下放置TM培养基表层，相当于模拟体内有菌环境。作用10h后，将粘附有淋球菌的各组材料转移至新的TM培养基，接枝面朝上，并在材料表面涂抹一层培养基，重新培养15h及24h后，拍照观察各组材料表面菌落情况，其结果如图7A、7B所示。

[0061] 在图7A、图7B的a、c两幅图中，上面的材料为空白组、下面的材料为涂有干扰素2
的游离组实验；而b、d两幅图中，上面的材料为接枝低浓度（5-10ng/cm）的光活性干扰素
2
的固定组，下面的材料为接枝高浓度（50-100 ng/cm）的光活性干扰素的固定组。

[0062] 根据实验结果可以发现，15h处理后无论是采用是ABC护垫材料的空白组和游离组，或是采用护舒宝卫生巾材料空白组和游离组的周围，都有白色浑浊聚集物，也就是有菌落产生。随着时间的增加，24h后，其菌落开始生长蔓延。

[0063] 而接枝光活性干扰素的材料周围，情况会相对缓和一些。但是对比ABC护垫和护舒宝卫生巾两组材料，仍然是有区别。ABC护垫在接枝低浓度的光活性干扰素后，材料周围菌落产生不明显；而护舒宝卫生巾在接枝低浓度的光活性干扰素，其周围仍然有菌落产生，但是接枝了高浓度的光活性干扰素后，其材料周围菌落则较少。造成这种现象的原因可能是由于两组卫生巾材料不同，因此光活性药物接枝后会产生不同的反应。

[0064] 这组实验的原理在于干扰素具有抑制菌类生长的作用。通过这个实验，我们推断，接枝了光活性的干扰素的材料相对于空白组，会有较好的抑菌能力，其干扰素抑菌活性没有消失。

[0065] 实施例4：光固定干扰素-α材料抗病毒能力的检测

[0066] 为了验证接枝在材料表面的干扰素仍然具有抗病毒效果，主要采用检验抗病毒蛋白的产生，验证其生物活性。这一组实验选用HeLa细胞为实验材料，通过与接枝干扰素的生物材料作用两天，并与空白组和游离组进行对照，提取P56蛋白。P56蛋白是干扰素诱导细胞产生的一种抗病毒蛋白，通过对其进行免疫印迹检测，可以间接验证其抗病毒效果。

[0067] 具体过程如下：

[0068] 接枝光活性INF-α的材料对不同细胞的生长作用：首先把材料剪成小圆形，大小与24孔PSt板的孔类似，共剪32个。在其中的12个小圆形的材料上避光加入光活性的IFN-α。用锡纸包裹，放入4℃冰箱冷冻干燥。待其干燥后用普通紫外灯照射20min。照射之后去除锡纸，用PBS洗去未接枝上去的IFN-α，共洗10次，每次10min。同时准备长势良好的HeLa细胞4瓶，胰酶消化后血清终止，制成细胞悬液。

[0069] 取出清洗干净的24孔PSt板（板先经过洗涤，泡酸过夜，泡酒精24h，以及无菌水润洗）两块，在各个孔中加入小圆形的卫生巾材料。在加入之前，材料要泡75%酒精10min，并经过无菌水润洗。其中，第一块板的A1至B6孔加入的是空白的卫生巾材料（即材料未加IFN-α），C1至D6每孔加入卫生巾材料后，再加入70ng游离IFN-α。在第二块板的A1至B6孔加入经70ng光活性IFN-α处理过的小圆形卫生巾材料，并依次做好标记。把吹打均匀的细胞悬液平均加入各孔中。培养48h后细胞计数。

[0070] 蛋白质样品提取：同样药物处理2d后，同上述方法从PSt培养板收集细胞转移至1.5ml的塑料离心管中，用预冷PBS缓冲液洗涤2次，置于冰上。按比例每5×106个细胞加入150-200ml的WB裂解液(每1mlWB加入1mlPMSF和5mlDTT混匀后使用)，悬浮置于冰上
30min。充分裂解后，于 4℃下 12000rpm 离心10min。取上清于另一1.5 ml的塑料离心管中放于-20℃保存待测。采用考马斯亮蓝法测定各蛋白质样品的浓度，并计算电泳上样量。
电泳上样前将样品置于沸水中煮5-10min使蛋白变性。

[0071] Western-blot分析：制备好分离胶和浓缩胶，按标记分别上样，放入电泳槽，接通电源电泳分离。电泳完毕将胶取出，利用电传导将蛋白对应的转移到硝酸纤维素膜上。转膜完毕加入封闭液过夜后加入用TBST稀释的一抗溶液，室温下孵育1-2h，用TBST漂洗两次，每次10min；再用TBS漂洗一次，10min。同上述方法二抗孵育，漂洗后加入显色液避光显色。可以看到蛋白质条带。

[0072] 重复上述步骤，再进行HSC细胞系和OVCAR细胞系的细胞接板收板提蛋白工作。

[0073] 从图8的免疫印迹结果可以看出，两组材料的空白组P56蛋白含量都相对较少，而添加了IFN-α处理后的蛋白含量则相对较多，并且固定组的蛋白含量比游离组的含量偏多些。我们从这组免疫印迹的结果中，不难推断，把光活性IFN-α接枝在材料表面，作用于HeLa细胞，会诱导细胞产生P56蛋白，并且这种蛋白的含量比游离组处理的更多。

[0074] 由此推断，把IFN-α接枝在材料上，仍然会产生含量较多的抗病毒蛋白，接枝在材料的干扰素仍然具有抗病毒作用，并且比游离组的抗病毒效果好。