一种具有镇痛作用的可穿膜多肽

摘要

本发明公开了一种具有镇痛作用的可穿膜多肽。该多肽是a）-c）中任一所示的多肽：a）氨基酸序列如序列表中序列1第10-25位氨基酸残基所示的多肽；b）氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽；c）对a）或b）所示的多肽进行如下突变得到的具有1）-3）中至少一种作用的衍生多肽：将序列表中序列1的第10-25位氨基酸残基中除序列1的第12位的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加：1）预防和/或治疗疼痛；2）干扰肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白的磷酸化；3）降低瞬时受体电位香草酸亚型1的功能。该多肽可用于预防和/或治疗疼痛。

权利要求

1.a)或b)所示的多肽：

a)氨基酸序列如序列表中序列1第10-25位氨基酸残基所示的多肽；

b)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽。

2.编码权利要求1所述多肽的核酸分子。

3.含有权利要求2所述核酸分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

4.权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子在制备缓解炎性痛觉敏化的产品中的应用。

5.一种缓解炎性痛觉敏化的产品，其活性成分为权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子。

6.e)或f)所示的应用：

e)权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子在制备干扰肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白的磷酸化的产品中的应用；

f)权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子在制备降低瞬时受体电位香草酸亚型1的功能的产品中的应用。

7.g)或h)所示的产品：

g)以权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子为活性成分制成的干扰肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白的磷酸化的产品；

h)以权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子为活性成分制成的降低瞬时受体电位香草酸亚型1的功能的产品。

说明书

一种具有镇痛作用的可穿膜多肽

技术领域

[0001] 本发明涉及一种具有镇痛作用的可穿膜多肽。

背景技术

[0002] 生理条件下的疼痛可以作为机体对于身体损害的一种预警系统，引起机体的防御性保护反应。但在一些病理条件下可以产生慢性的病理性疼痛，对机体而言却构成一种难以忍受的折磨。因而，疼痛作为一种疾病，已经成为严重影响人们日常工作生活及生存质量的一大危害。随着生活节奏的加快和社会老龄化的到来，各种疼痛疾病尤其慢性炎症性疼痛的发病率约来越高。然而由于慢性病理性痛的病因复杂，分子机制和病理生理过程未被完全了解，故而尚缺乏有效而特异的治疗手段。

[0003] 关于疼痛的发病机制，目前认为主要是由外周敏化和中枢敏化所致。很多因素参与了痛觉敏化的产生和维持，如多种神经营养因子、蛋白激酶和离子通道等，最终导致突触传递效能的增强，敏化的产生。痛觉敏化可以发生于两个水平，即转录后水平的修饰和转录水平的改变，分别介导了早期和长期的痛觉敏化。但迄今为止，尚没有任何一个因素可以完全解释痛觉敏化的形成机制，而是细胞内的各个信使分子之间通过相互作用、相互制约，形成错综复杂的信号传递网络，共同参与痛觉敏化的产生。在这个复杂的网络中，无论是转录后水平的修饰还是转录水平的改变，蛋白质磷酸化均起着核心作用。目前已经发现多种蛋白激酶，如PKA(protein kinase A),PKC(protein kinase C),CaMK(calcium/calmodulin dependent protein kinase),PI3K(phosphatidylinositol3kinase),ERK(extracelluar signal regulated kinase)等，既可以通过磷酸化离子通道、受体等参与早期痛觉敏化的调控，也可以通过调控痛觉传导中关键分子的转录参与长期痛觉敏化的调控。因此，如果确定某些蛋白激酶参与疼痛传导及痛觉调制，进而找到发挥作用的靶蛋白，并且通过确定其磷酸化位点或关键的结构域，即可据此开发一些特异性较强且副作用较小的镇痛药物。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种预防和/或治疗疼痛的多肽及其应用。

[0005] 本发明所提供的预防和/或治疗疼痛的多肽，名称为TAT-S3，为a）-c）中任一所示的多肽：

[0006] a）氨基酸序列如序列表中序列1第10-25位氨基酸残基所示的多肽；

[0007] b）氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽；

[0008] c）对a）或b）所示的多肽进行如下突变得到的具有1）-3）中至少一种作用的衍生多肽：将序列表中序列1的第10-25位氨基酸残基中除序列1的第12位之外的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加；

[0009] 所述1）-3）为：

[0010] 1）预防和/或治疗疼痛；

[0011] 2）干扰肌动蛋白解聚因子/切丝蛋白（ADF/cofilin）的磷酸化；

[0012] 3）降低瞬时受体电位香草酸亚型1的功能。

[0013] 其中，序列表的序列1由25个氨基酸残基组成，序列1的第1-9位氨基酸残基组成具有穿透细胞膜作用的区域，该区域可以被具有相同作用的其它序列替换；序列1的第10-25位氨基酸残基构成可以竞争性抑制细胞内LIMK（LIM motif-containing protein kinase,LIMK）对肌动蛋白解聚因子/切丝蛋白cofilin的第3位丝氨酸（Ser-3）磷酸化的区域，其中，序列1的第12位丝氨酸为LIMK的磷酸化位点（即拮抗内源性Ser-3磷酸化的位点）。

[0014] 其中，b）所示的多肽是对a）所示的多肽进行如下突变得到的具有所述1）-3）中至少一种作用的多肽：在a）所示的多肽的氨基端添加序列1的第1-9位的9个氨基酸残基。在实际应用中，也可以对a）所示的多肽进行如下突变得到具有所述1）-3）中至少一种作用的多肽：保证序列表中序列1的第12位氨基酸残基不变，将序列1的第10-11位氨基酸残基进行一个以上的缺失，将序列1的第13-25位氨基酸残基进行一个以上的添加；或者保证序列表中序列1的第12位氨基酸残基不变，将序列1的第10-11位氨基酸残基进行一个以上的添加，将序列1的第13-25位氨基酸残基进行一个以上的缺失。

[0015] 编码上述任一所述多肽的核酸分子（DNA或RNA）也属于本发明的保护范围。所述核酸分子具体可为上述任一所述多肽的编码基因。含有编码上述任一所述多肽的核酸分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系（非动植物繁殖材料）或重组菌也属于本发明的保护范围。

[0016] 上述任一所述多肽和/或编码所述多肽的核酸分子在制备预防和/或治疗疼痛的产品中的应用以及以上述任一所述多肽和/或编码所述多肽的核酸分子为活性成分的预防和/或治疗疼痛的产品也属于本发明的保护范围。

[0017] 以上述任一所述多肽和/或编码所述多肽的核酸分子为活性成分制成的干扰肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白（cofilin）的磷酸化的产品和/或降低瞬时受体电位香草酸亚型1的功能的产品也属于本发明的保护范围。

[0018] 上文中，所述疼痛可为炎症性疼痛。

[0019] 所述预防和/或治疗疼痛可体现为缓解痛觉敏化。所述缓解痛觉敏化具体可为缓解炎性痛觉敏化，如缓解炎性热痛觉敏化。

[0020] 上述产品具体可为药物。

[0021] 需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂等。

[0022] 本发明的药物可以制成注射液、干粉针剂、片剂或粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

[0023] TAT-S3能够干扰肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白（cofilin）的磷酸化，降低瞬时受体电位香草酸亚型1的功能，能缓解炎性热痛觉敏化，可用于预防和/或治疗疼痛。

附图说明

[0024] 图1为体外激酶实验以及western blot结果

[0025] 图2为TAT-S3及对照肽TAT-S3A的序列。

[0026] 图3为蛛网膜下腔注射TAT-S3peptide对大鼠体内cofilin的磷酸化的影响。

[0027] 图4为蛛网膜下腔注射TAT-S3对TRPV1的功能的影响

[0028] 图5为蛛网膜下腔注射TAT-S3对CFA诱导的大鼠热痛觉敏化程度的影响。

[0029] 图6为蛛网膜下腔注射TAT-S3不影响大鼠炎症对侧的热痛觉敏化程度。

[0030] 图7为TAT-S3A没有镇痛或是促进痛觉敏化的作用。

具体实施方式

[0031] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0032] 下述实施例中采用的数据处理和统计学检验如下：

[0033] 实验结果采用GraphPad Prism5.01版软件分析,以平均值±标准误（Mean±SEM）表示。图1、3、5所示柱状图中两组比较使用非配对t检验（unpaired t Test）。
行为学实验以及钙成像实验结果采用双因素方差分析（two-way ANOVA），并用Bonferroni posttests进行检验。以p<0.05作为在统计学上有显著性差异的标准。Western blot结果采用Quantity One（Bio-Rad）图像分析软件进行光密度测量。

[0034] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0035] 下述实施例中的大鼠均为健康雄性SD大鼠，初始体重160-180g。

[0036] 下述实施例中的TAT-S3溶液、TAT-S3A溶液均用无菌生理盐水作为溶剂配制。

[0037] 实施例1、TAT-S3的功能实验

[0038] 1、TAT-S3peptide的设计

[0039] LIMK(LIM motif-containing protein kinase,LIMK)蛋白激酶家族是一种丝氨酸蛋白激酶，仅包含LIMK1和LIMK2两个成员。两成员的基础结构特征相同，均包含N端的两个连续的LIM结构域和一个PDZ结构域，以及C端的蛋白激酶结构域，在PDZ结构域以及蛋白激酶结构域中间还有一段丝氨酸/脯氨酸富集区。自LIMK1和LIMK2发现以来，人们对其在神经系统中的功能研究多集中在对神经元发育的调控，发现LIMK可以通过磷酸化cofilin调控生长锥的形态和运动以及神经突起的延伸，参与各种刺激诱导的神经元导向生长。有许多证据提示LIMK可能参与痛觉敏化的调控：LIMK1的mRNA在神经系统有着很高水平的表达，特别是在痛觉信号传导中的两个关键部位DRG（dorsal root ganglion,DRG）和脊髓，LIMK2的mRNA在神经系统也有分布；LIMK1基因敲除的小鼠表现出树突棘形态的异常以及突触功能的受损，而LIMK1和LIMK2双基因敲除的小鼠则表现为突触功能更为严重的受损，抑制齿状回cofilin的磷酸化也可以干预晚期长时程增强（late phase long term potentiation,L-LTP）;用凝血酶刺激可以引起血小板内LIMK1的激活，而凝血酶受体PAR（protease-activated receptor,PAR）则可以通过多种机制参与痛觉敏化的调控;用NGF刺激PC12细胞可以引起LIMK1的快速激活以及LIMK2活性的缓慢上升，而NGF恰恰是炎症痛中发挥重要作用的一种致炎因子；细胞骨架可能通过锚定在它们上面的蛋白激酶参与慢性痛的调控。

[0040] LIMK只有一种经典的作用底物，即肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白cofilin。LIMK可以通过磷酸化cofilin第三位丝氨酸调控肌动蛋白骨架的聚合状态，从而广泛参与到细胞的运动、形态发生、分裂、分化、凋亡、神经突起生长以及肿瘤发生等过程中。

[0041] 本课题组的研究表明，在完全弗氏佐剂（CFA）诱导的炎症痛中，LIMK能够通过磷酸化其经典底物cofilin，调控肌动蛋白骨架的聚合状态，从而调节TRPV1——感受伤害性刺激的重要分子整合器的功能，继而参与炎性热痛觉敏化的发生乃至维持。在此基础上，本发明设计并合成了一段可以干扰LIMK对cofilin的Ser-3磷酸化的可穿膜融合肽TAT-S3。

[0042] 其中，如下实验证实LIMK是通过磷酸化cofilin参与炎性热痛觉敏化的的调控。

[0043] 局部炎症是疼痛发生最常见的原因。目前国际上常用的慢性炎症痛动物模型有Butler所创的单发性佐剂关节炎大鼠模型和足底注射CFA所致的大鼠炎症痛模型，它们均是以弗氏佐剂作为致炎剂，后者疼痛指标的检测相对简单、稳定，因而较前者更为常用。

[0044] 慢性痛可产生痛觉超敏，主要表现为两种症状：自发痛和诱发痛。诱发痛可分为两种：热痛觉敏化和机械痛敏或称触诱发痛。本申请选用足底注射CFA所致的大鼠炎症痛模型，注射后大鼠足底局部出现红肿热痛现象，其它状态均良好。分别取正常大鼠（Naive）及足底注射CFA后0.5h，1h，2h，6h和1d的大鼠的给药同侧L4-L6DRG，提取总蛋白后进行体外激酶活性实验、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及western blot实验。

[0045] 结果如图1显示，炎症同侧DRG中LIMK1的激酶活性正常状态下相对较低，在CFA注射后迅速增加，在1h达到高峰，并在此后回落，但从2h至1d仍然维持在一个相对较高的水平。Western blot的结果表明，在整个过程中，LIMK1的蛋白表达水平是基本不变的（图1中a）。

[0046] LIMK2则在CFA注射后0.5h即达到活性高峰，并于此后迅速回落。在整个炎症过程中，LIMK2的蛋白表达水平也是基本保持不变的（图1中b）。

[0047] 如前文所述，LIMK在CFA诱导的炎症痛过程中发生了激活，因此我们推测LIMK的最经典的底物cofilin的第三位丝氨酸的磷酸化程度可能发生相应的变化。Western blot的结果显示，cofilin的磷酸化水平在CFA注射后0.5h即迅速增加，并于1h达到高峰，此后一直到1d仍然保持在较高的水平（图1中c），其变化规律与LIMK1和LIMK2的激酶活性变化相符合，这提示LIMK是通过磷酸化其经典底物cofilin来调控炎性热痛觉敏化过程的。

[0048] 为了进一步在体研究cofilin第三位丝氨酸的磷酸化对于LIMK在炎性热痛觉敏化过程中的作用的影响，针对Ser-3位点设计并构建了可干扰其磷酸化的可穿膜融合肽——TAT-S3（TAT-S3peptide），将TAT-S3的Ser-3被丙氨酸所取代，得到对照肽TAT-S3A（TAT-S3A peptide））。

[0049] 2、TAT-S3的制备

[0050] TAT-S3的序列是序列表中的序列1，对照肽TAT-S3A的序列是序列表中的序列2（如图2所示）。

[0051] TAT-S3和TAT-S3A均采用固相多肽合成法（Fmoc法）由羧基端向氨基端方向合成。合成的多肽采用高效液相色谱进行纯化得到纯度为≥98%的TAT-S3和TAT-S3A。纯化的TAT-S3和TAT-S3A经质谱鉴定，TAT-S3的氨基酸序列如序列表中序列1所示；TAT-S3A的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

[0052] 3、TAT-S3的功能

[0053] 3.1TAT-S3干扰cofilin的磷酸化

[0054] 在大鼠蛛网膜下腔插管后5d鞘内给予TAT-S3或TAT-S3A半小时后，左侧足底注射100μl25%CFA1h后提取L4、L5DRG总蛋白，进行Western Blot实验检测肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白（cofilin）的磷酸化水平，结果如图3显示，鞘内给予TAT-S3后能够很好的降低cofilin在CFA诱导的炎症痛中的磷酸化水平（**p=0.0048，n=6（每组6只SD大鼠）），而对于cofilin的总蛋白量却没有影响。由此可见，在体内，构建的可穿膜融合肽TAT-S3能够很好的干扰cofilin的磷酸化。图3中，p-cofilin为磷酸化的cofilin，cofilin为cofilin的总蛋白量。

[0055] 其中，使用到的实验方法如下：

[0056] A、组织总蛋白的提取

[0057] 1)动物断头，迅速分离两侧L4、L5DRG，-80℃保存；

[0058] 2)单侧DRG加入200μl上述组织裂解液，组织匀浆器(PelletMotor,Rontes)研磨，研磨充分后分别补加200μl裂解液，4℃混悬1h；

[0059] 3)4℃12,000g×5min离心，分离组织碎片，取上清即为总蛋白提取物。

[0060] B、体外激酶活性实验（Kinase Assay）

[0061] 1)提取DRG总蛋白。

[0062] 2)珠子(protein A-Sepharose CL-4,Amersham Pharmacia,CAT#17-5280)每管30μl，用PBS洗3次，与LIMK1或LIMK2抗体共同孵育，抗体终浓度为1:50，4℃孵育3h以上。

[0063] 3)通过BCA方法定量（Pierce Biotechnology,Rockford,IL,USA），每个样品取400-500μg蛋白，珠子和抗体的混合液等体积加入到每个样品中，终体积用裂解液补至
400μl，4℃孵育过夜。

[0064] 4)用0.1%Triton X-100/1×TBS洗珠子4次，每次1ml。用激酶反应缓冲液(无DTT、纯化的底物蛋白及同位素)洗珠子2次，每次1ml。

[0065] 5)收集珠子，用25-30μl激酶反应缓冲液（Tris-HCl(pH7.6)20mM，MgCl220mM，γ-32DTT0.1mM，[ P]ATP10μCi/50μl，纯化的底物蛋白）重悬珠子，30℃水浴30min。

[0066] 6)加入6×上样缓冲液煮样品5min，冰浴5min后离心上样。

[0067] 7)SDS-PAGE(10%)电泳。

[0068] 8)电泳后染胶，脱色，干胶过夜。

[0069] 9)暗室压片，-80℃冰箱放置合适的时间，放射自显影。

[0070] C蛋白质免疫印迹分析（Western Blot）

[0071] 1)先配分离胶溶液(10%或12%)10ml，加入两玻璃板之间，用蒸馏水冲净未聚合的聚丙烯酰胺。配制浓缩胶液(5%)4ml，注入分离胶上端。

[0072] 2)胶凝后，拔去梳子，冲洗点样孔，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，上槽液浸过凝胶。

[0073] 3)按次序上样。

[0074] 4)恒压电泳(80V)，当样品到达分离胶与浓缩胶分界线时，将电压换成120V，至染料到达凝胶底部。

[0075] 5)将凝胶放入转膜液中，室温洗胶20min。

[0076] 6)剪一 张与 凝胶大 小相 等的NC(nitrocellulose,NC)膜 (Pall Gelman Laboratory,USA)和六张3MM滤纸(Whatman,UK)，4℃浸泡于转膜缓冲液中待用。转膜缓冲液置4℃预冷。

[0077] 7)将三张滤纸、NC膜、凝胶和另外三张滤纸按正极向负极依次叠放在转移盘上，驱除气泡。于室温恒流转膜(150mA)1.5-2h。

[0078] 8)封闭：将NC膜放入封闭液中，置于摇床室温下1h。

[0079] 9)加入一抗(封闭液稀释)（cofilin抗体（1:100,sc-33779;Santa Cruz Biotechnology） 或 p-cofilin 抗 体（1:2000,sc-12912-R/sc-21867-R;Santa Cruz Biotechnology）或GAPDH抗体（1:2000,CW0100;CoWin Biotech Co.,Ltd.），4℃孵育过夜。其中，GAPDH蛋白的表达量为内参。

[0080] 10)室温下用TBST漂洗NC膜3次，每次5min。

[0081] 11)加入HRP标记的二抗(中杉公司，进口分装)，室温孵育1h。

[0082] 12)室温下用TBST漂洗NC膜4次，前两次5min，后两次10min。

[0083] 化学发光液A、B液等量混合(Santa Cruz,Biotechnology,CA,USA.sc-2048)孵育1-2min，暗室曝光。

[0084] 3.2蛛网膜下腔注射TAT-S3能够减弱DRG神经元上TRPV1的功能

[0085] LIMK是通过磷酸化其经典底物cofilin，调控肌动蛋白骨架的聚合状态，从而调节TRPV1的功能，继而参与炎性热痛觉敏化的发生乃至维持。那么，干扰cofilin的磷酸化是否会影响TRPV1的功能呢？我们在大鼠蛛网膜下腔插管后5d鞘内给予30　g TAT-S3或是TAT-S3A，0.5h后足底给予25%CFA，给予CFA1h时急性分离L4、L5DRG神经元，贴壁1-1.5h后Fura-2AM孵育40min-1h，恢复之后进行钙成像检测。结果如图4，相对于对照肽TAT-S3A，DRG神经元经TAT-S3处理对辣椒素（Cap）的反应性明显降低。这说明TAT-S3干扰cofilin的磷酸化可明显降低TRPV1的功能。***p<0.0001,n=44-48（每组44-48个神经元）,双因素方差分析（two-way ANOVA），并用Bonferroni posttests进行检验。

[0086] 其中，该实验中实验方法如下：

[0087] A主要试剂和溶液的配置

[0088] DMEM培养液:DMEM固体培养基(Gibco-BRL,USA)13.48g溶于800ml ddH2O中，用3.7g NaHCO3调pH值至7.2-7.4，定容至1L。0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。

[0089] 0.25%胰酶:称取0.625g胰酶(Sigma)溶于200ml DMEM培养液中，定容至250ml，0.22μm微孔小滤器过滤除菌。

[0090] 3mg/ml胶原酶:称取0.75g胶原酶(Sigma)溶于200ml DMEM培养液中，定容至250ml，0.22μm微孔小滤器过滤除菌。

[0091] 细胞外液：秤取7.605g NaCl，0.3725g KCl，0.272g KH2PO4，0.094gMgCl2,0.2775g CaCl2,1.8g glucose和2.38g HEPES溶于800ml ddH2O中，用NaOH调pH值至7.2，Sucrose调渗透压至300mOsm，定容至1L。0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。

[0092] 多聚赖氨酸(poly-D-lysine,PDL):0.5mg/ml(Sigma-Aldrich)。

[0093] Fura-2AM:储存浓度1mM(Invitrogen)。

[0094] 辣椒素（Capsaicin）:溶于DMSO,储存浓度100mM(Enzo Life Sciences)。

[0095] PBS：NaCl8g,Na2HPO4·12H2O2.08g,KCl0.2g,KH2PO40.2g溶于800ml ddH2O中，调pH值至7.2-7.4，定容至1L。0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。

[0096] B急性分离DRG神经元

[0097] 实验前12h在钙成像专用培养皿中铺多聚赖氨酸，37℃孵箱过夜。高压所需的器械。12h后吸走多聚赖氨酸(可回收再用)，用高压过的蒸馏水洗涤三次，置入超净台吹干。

[0098] 鞘内插管给药的SD大鼠在CFA造模后按所需时间点给予麻药深麻醉处死，取L4-L6DRG胞体置于1.5ml胶原酶，37℃，100rmp消化50min，吸出胶原酶，加入1ml胰酶，37℃，100rmp消化10min，用500μl FBS终止消化，玻璃滴管吹打10-30次，移入15ml离心管，500rmp离心4min，小心吸去上清，加入合适的接种液(含10%FBS的DMEM)，混匀将细胞接种于铺有多聚赖氨酸的培养皿中，置于37℃孵箱中贴壁1-1.5h，进行钙成像实验。

[0099] C钙成像

[0100] Loading buffer：用细胞外液稀释Fura-2AM至5mM。

[0101] 1)用37预热含细胞外液轻洗细胞两次；

[0102] 2)加入适量37℃预热的loading buffer，室温50min孵育；

[0103] 3)弃去loading buffer，用37℃预热的细胞外液轻洗细胞2次；

[0104] 4)加入细胞外液，室温恢复1h；

[0105] 5)激光共聚焦显微镜下检测；

[0106] 6)观测时程包括：10*10s baseline，给予5μM辣椒素刺激后观察30*10s，给予5μl10%KCl溶液后观察30*10s检测细胞活性。

[0107] 3.3蛛网膜下腔注射TAT-S3能够缓解大鼠的炎性热痛觉敏化

[0108] 本研究组已有的研究表明，LIMK是通过磷酸化其经典底物cofilin调控肌动蛋白骨架的聚合状态，从而增强TRPV1的功能来参与CFA诱导的炎症痛的发生乃至维持。那么干预LIMK对cofilin的磷酸化是否会影响LIMK介导的炎性热痛觉敏化的发生过程呢？接下来，我们在CFA诱导的炎症痛大鼠模型中选择通过干预cofilin Ser-3的磷酸化进而干扰LIMK对TRPV1的调控的方法来对这一问题进行了研究。具体是采用蛛网膜下腔注射TAT-S3的方法来观察其对大鼠痛行为的影响。

[0109] 将浓度均为1mg/ml的TAT-S3溶液和TAT-S3A溶液分别以如下剂量注射大鼠：10μg、17μg或30μg TAT-S3或TAT-S3A注射入SD大鼠的蛛网膜下腔，之后30min时，向大鼠左侧足底注射100μl25%CFA诱导炎症，并于炎症发生1h,2h,6h,1d时，利用辐射热刺激仪测定大鼠的热刺激缩足潜伏期（paw withdrawal latency,PWL）。其中，蛛网膜下腔注射TAT-S3的大鼠为TAT-S3处理组，蛛网膜下腔注射TAT-S3A的大鼠为TAT-S3A处理组（对照组）。

[0110] 结果如图5，在炎症发生1h和2h时，30μg和17μg的TAT-S3处理组的大鼠（在图5中表示为“TAT-S3”）的热刺激缩足潜伏期明显高于TAT-S3A处理组的大鼠（在图5中表示为“TAT-S3A”，说明TAT-S3可缓解CFA引起的热痛觉敏化并呈现剂量依赖性（给予30μg TAT-S3或TAT-S3A的大鼠，组间差异###p=0.0001，n=7（每组7只SD大鼠）（图5中A）；给予17μg TAT-S3或TAT-S3A的大鼠，组间差异#p=0.0350，n=10-11（每组10-11只SD大鼠）（图5中B）；给予10μg TAT-S3或TAT-S3A的大鼠，组间差异p=0.6684，n=8-9（每组8-9只SD大鼠）（图5中C））。在炎症发生1h和2h时，30μg TAT-S3预处理能显著延长大鼠的热刺激缩足潜伏期（炎症发生1h：TAT-S3预处理的大鼠的PWL为10.77±2.416s；TAT-S3A预处理的大鼠的PWL为4.935±0.5547s；**p<0.01。炎症发生2h：TAT-S3预处理的大鼠的PWL为8.404±1.645s；TAT-S3A预处理的大鼠的PWL为3.956±0.2916s；*p<0.05）。图5中A、B、C的曲线下面积（AUC）也表明TAT-S3可明显缓解CFA引起的热痛觉敏化（图5中D）。而对给予CFA的对侧炎症热痛敏均无明显影响（如图6，A为给予30μg TAT-S3或TAT-S3A的大鼠，B为给予17μg TAT-S3或TAT-S3A的大鼠，C为给予10μg TAT-S3或TAT-S3A的大鼠），说明蛛网膜下腔注射TAT-S3并没有影响大鼠的基础热敏感性（basal heat sensitivity，即基础状态下对伤害性热刺激的反应性）。图5和图6中，baseline表示给药前大鼠的基础热痛敏，baseline没有差异说明两组大鼠没有差异。上述统计均采用双因素方差分析方法来计算两组间的整体差异，并采用Bonferroni posttests对同一时间点上的组间差异进行检验。

[0111] 然后，又以无菌生理盐水为对照确定了TAT-S3A没有镇痛或是促进痛觉敏化的作用：在SD大鼠左侧足底注射100μl25%CFA诱导炎症之前30min时向蛛网膜下腔注射30μg TAT-S3A（30μl浓度为1mg/ml的TAT-S3A溶液）或者是相同体积的无菌生理盐水，并于炎症发生1h,2h,6h和1d时测定大鼠的PWL。结果表明炎症发生1h,2h,6h和1d时，两种处理大鼠在CFA注射后表现出相同程度的热痛觉敏化（如图7，PWL组间无显著性差异，p=0.5966。其中，注射TAT-S3A的大鼠7只，注射无菌生理盐水的大鼠6只），说明对照肽（TAT-S3A）本身没有镇痛或是促进痛觉敏化的作用。上述统计均采用双因素方差分析方法来计算两组间的整体差异，并采用Bonferroni posttests对同一时间点上的组间差异进行检验。图7中，
30μl normal saline表示向蛛网膜下腔注射30μl无菌生理盐水的处理,30μｇtat-S3A peptide表示向蛛网膜下腔注射30μg TAT-S3A的处理。

[0112] 其中，该实验中实验方法如下：

[0113] 健康雄性SD大鼠，初始体重170-190g，由北京大学医学部实验动物科学部提供。大鼠均置于铺垫锯末的塑料盒内，每笼4-5只饲养。给予自然照明，自由饮水和饮食。

[0114] A炎症痛模型的建立

[0115] 采用大鼠左后侧足底皮下注射CFA作为慢性炎症痛动物模型。大鼠用乙醚麻醉，右侧卧位，用75%酒精将左侧后足底及周围皮肤消毒，然后注入25%CFA0.1ml，分别于注射后第30分钟(min)、炎症发生1、2、6小时(h)和1天(d)进行行为学指标的测定。

[0116] B热诱发痛缩足潜伏期（paw withdrawal latency,PWL）的测定

[0117] 通过辐射热刺激缩足潜伏期(PWL)反映大鼠的炎症热痛觉敏化程度。进行测试前将大鼠置于玻璃板上，盖以透明的有机玻璃罩(18cm×8cm×8cm)，使大鼠适应环境15min，待大鼠的梳理和探究活动基本消失后，开始测试。测试时，将辐射热灯的焦点对准大鼠脚掌中心部位，开启辐射热灯并开始计时，视大鼠出现迅速缩足现象为阳性反应，大鼠出现阳性反应时立即关闭辐射热灯并停止计时。调整辐射热的强度使大鼠基础状态的PWL在10-15秒（sec,s），如果大鼠刺激30s仍未出现阳性反应，关闭辐射热灯，停止计时以避免烫伤。每只大鼠重复测量5次，每次测试间隔15min，去除一个最高值和一个最低值，剩余三个值的平均值为其辐射热缩足潜伏期。

[0118] C蛛网膜下腔插管方法

[0119] SD大鼠经10%水合氯醛(300mg/kg，i.p.)麻醉，背部剪毛，消毒。触及T12、T13脊椎棘突交界(腰髓膨大，腰髓L3-L4水平)和髂棘(腰椎骨L4水平)，分别划横线做标记，测量两线间距离，即为进管长度(对250g大鼠而言，约3.5-4.0cm)。在髂棘水平正中线纵向划开皮肤，用一长约5cm的不锈钢管作为外套管(外径0.9mm，前端打磨成斜面，可容PE-10管通过)，在L4和L5脊椎骨间隙垂直刺入椎管(此时动物的尾巴或后肢会出现轻微抽动)，改变不锈钢管方向指向头端，将PE-10管(提前用75%酒精消毒，无菌生理盐水冲洗)通过外套管送入蛛网膜下腔至腰髓L3-L4水平，拔除钢管，褥式缝合，局部固定PE-10管。颈后皮肤剪小口，使PE-10管经皮下由此穿出，褥式缝合固定，约外露5cm左右，缝合皮肤。术后i.p.注射青霉素1万单位以预防感染。大鼠恢复4d即可给药。