一株高产纤维素酶的菌株PenicilliumoxalicumWX-209及产酶方法转让专利
申请号 : CN201310350621.8
文献号 : CN103468583B
文献日 : 2015-04-22
发明人 : 单杨 , 夏金兰 , 高奇瑞 , 李培骏 , 张闯 , 聂珍媛 , 李高阳 , 付复华
申请人 : 湖南省农产品加工研究所 , 中南大学
摘要 :
本发明公开了一株高产纤维素酶的菌株Penicillium oxalicum WX-209及产酶方法。所述草酸青霉Penicillium oxalicum WX-209从甘肃文县腐烂核桃皮中筛选到，保藏编号为CCTCC NO：M2013325。本发明发酵制取粗酶液的方法包括斜面培养、超声波预处理底物（麸皮）、发酵、获取酶液等步骤，在超声波功率700～900W超声处理底物40～55分钟，有效提高了该菌株的纤维素酶（以CMCase酶计）活力，较未预处理对照组提高效果显著，在降解纤维素应用上具有很好的前景。
权利要求 :
1.一株高产纤维素酶的草酸青霉菌株Penicillium oxalicum WX-209，保藏编号为CCTCC NO：M 2013325。
2.一种采用权利要求1所述的草酸青霉菌株发酵产高活力纤维素酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)斜面培养：将草酸青霉菌株Penicillium oxalicum WX-209孢子接种至PDA斜面培养基上，35℃培养3～4天，用无菌水洗下孢子，制成孢子悬液备用；
2)底物前处理：取Mandels营养液30ml加入质量百分比5～8％的麸皮，进行超声波处理，超声波参数为：700～900W超声处理40～55分钟；
5 6
3)发酵：经过前处理后的底物高压灭菌20min，冷却后按1×10～1×10 个/mL的接种量接入草酸青霉孢子悬液，32℃～37℃、150～180r/min培养72h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：发酵容器为250mL摇瓶，装液量为30～
80mL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在Mandels营养液基础上补充蛋白胨为速效氮源，浓度为1g/L。
说明书 :
一株高产纤维素酶的菌株Penicillium oxalicum WX-209
及产酶方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一株高产纤维素酶菌株及产酶方法，属菌株发酵产酶技术领域。
背景技术
[0002] 纤维素是地球上数量最大的可再生能源物质,每年全球光合作用的产物高达11 11
1.5×10 ～2.0×10 t，中国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有
20亿t。如何利用这些数量可观的农业生产“下脚料”，开发系列高附加值产品成为当今世界焦点问题。随着生物技术的发展，国内外诸多专家开始尝试利用微生物对纤维素进行发酵降解，微生物产生的纤维素酶可将纤维素酶解为低分子量的己糖或戊糖，用于生产新型饲料、单细胞蛋白等，将缓解人类面临的粮食、能源及环境危机，这一举措即将储量巨大的纤维素变为价值极为可观的资源，对于目前社会经济发展具有重大的战略意义。在另一方面，微生物发酵纤维素过程中产生的纤维素酶可以制成酶制剂，在食品工业中也有着重要而广泛的用途，可用于果蔬加工、油料作物加工、茶叶生产、酒精生产、啤酒生产、食醋酿造、活性物质提取等方面，对上述行业的发展有着巨大的推动作用。
1.5×10 ～2.0×10 t，中国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有
20亿t。如何利用这些数量可观的农业生产“下脚料”，开发系列高附加值产品成为当今世界焦点问题。随着生物技术的发展，国内外诸多专家开始尝试利用微生物对纤维素进行发酵降解，微生物产生的纤维素酶可将纤维素酶解为低分子量的己糖或戊糖，用于生产新型饲料、单细胞蛋白等，将缓解人类面临的粮食、能源及环境危机，这一举措即将储量巨大的纤维素变为价值极为可观的资源，对于目前社会经济发展具有重大的战略意义。在另一方面，微生物发酵纤维素过程中产生的纤维素酶可以制成酶制剂，在食品工业中也有着重要而广泛的用途，可用于果蔬加工、油料作物加工、茶叶生产、酒精生产、啤酒生产、食醋酿造、活性物质提取等方面，对上述行业的发展有着巨大的推动作用。
[0003] 为了获得酶活较高的野生纤维素降解菌，国内外科学工作者自20纪60年代开始做了大量的工作，目前已筛选到很多纤维素降解菌，主要包括细菌、放线菌和丝状真菌等。已报道的对纤维素作用较强的菌株多是木霉属、曲霉属、青霉属。本申请人通过刚果红染色初筛，摇瓶发酵复筛获得高产纤维素酶菌株——草酸青霉Penicillium oxalicum WX-209。
并对其发酵产酶进行了研究。
并对其发酵产酶进行了研究。
[0004] 纤维素在植物细胞壁中含量较高，但植物细胞细胞壁构造复杂，纤维素分子链外层包裹着大量的半纤维素及数量可观的木质素，使细胞壁具有很强的刚性和韧性，同时多种成分构成的复合物也使得单一酶无法有效降解底物；而且纤维素是由D-葡萄糖以β-1,4糖苷键组成的大分子多糖，通常分子量为50000～2500000，相当于300～15000个葡萄糖基，其分子内和分子间形成大量氢键，使结构更加稳固，导致微生物难以利用，生物降解速率低。通常，通过蒸汽爆破等物理方式对底物进行处理可以破坏细胞壁的宏观结构，但是普通机械处理耗能高，效率低，效果并不显著。而超声波则可以直接作用于细胞壁的微观结构，其原理是由于溶剂中含有气体及微小杂质，在溶剂中发射超声波时，就会在溶剂和样品之间形成声波空化作用，导致溶液内大量微小气泡形成、增长、爆破和压缩，对样品产生破坏作用。超声波空化时产生的巨大作用力会破坏细胞壁结构，使纤维素暴露并断裂成易于利用的小分子，提高纤维素的降解速率。本发明通过超声波处理麸皮纤维素，使其暴露并断裂成菌种生长易于利用的小分子，从而提高菌种的生长及产纤维素酶效率。通过已有的报道，预处理手段大多是用于提高生物质降解制备还原糖，对于降解产物提高微生物产酶的报道却鲜有报道。
[0005] 本发明关注于筛选高产纤维素酶的菌株，以及通过预处理提高其产酶效率。本发明以筛选得到的草酸青霉Penicillium oxalicum WX-209为发酵菌株，以价格低廉的麸皮作为发酵底物，以简单可操作的超声波处理作为预处理手段获得纤维素酶活较高的粗酶液。因此，本发明对于废弃纤维素生物质的高效利用及产高附加值工业产品具有一定的应用价值。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一株高产纤维素酶的草酸青霉Penicillium oxalicum WX-209，其保藏编号为CCTCC NO：M 2013325，并提供一种通过超声波预处理底物提高酶活力的产酶方法。
[0007] 本发明的技术方案：从甘肃文县境内腐烂核桃皮中分离得到一株高产纤维素酶的草酸青霉Penicillium oxalicum WX-209，已于2013年7月9日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2013325，命名为Penicillium oxalicum WX-209。草酸青霉Penicillium oxalicum WX-209的形态特征：
[0008] PDA平板上35℃培养1天为白色菌丝，培养2天形成外白色中间绿色产孢区的菌落，培养3天后菌落直径为17-19mm，菌落墨绿色，外缘白色(图1)；显微观察，菌丝交织，具横隔；帚状枝为对称双轮形；分生孢子椭圆形，半透明。
[0009] 本发明所提供的Penicillium oxalicum WX-209可用于制备纤维素酶制剂，具有较高的产CMCase酶活力。草酸青霉Penicillium oxalicum WX-209能够在麸皮为唯一碳源的液体培养基上生长产酶，发酵工艺简单可行，生长产酶迅速，废弃物麸皮利用充分等特点。
[0010] 采用所述的草酸青霉菌株发酵产高活力酶的方法，包括以下步骤：
[0011] 1)斜面培养：将草酸青霉菌株Penicillium oxalicum WX-209孢子接种至PDA斜面培养基上，35℃培养3～4天，用无菌水洗下孢子，制成孢子悬液备用；
[0012] 2)底物前处理：取Mandels营养液30ml加入质量百分比为5～8％的麸皮，进行超声波处理，超声波参数为：700～900W超声处理40～55分钟；
[0013] 3)发酵：经过前处理后的底物高压灭菌20min，冷却后按1×105～1×106个/mL的接种量接入草酸青霉孢子悬液，32℃～37℃、150～180r/min培养72h。
[0014] 发酵容器为250mL摇瓶，装液量为30～80mL。
[0015] 本发明方法处理后粗酶液获取及酶活测定：将培养液进行抽滤或10000r/min离心10min，分离得到的上清发酵液即为粗酶液，采用DNS法测定CMCase酶活力。
[0016] CMCase酶活力测定：取适当缓冲液稀释的酶液0.5mL加入1.5mL 1.0％(W/V)的CMC-Na溶液(此溶液由pH＝4.8，浓度0.05M柠檬酸缓冲液配置)于25mL具塞试管中，50℃反应30min后加入2mL DNS终止反应，沸水浴5min，流水冷却，用蒸馏水补充水分至刻度，540nm处测定吸光值。空白对照为在加入酶液前，先加入2mL的DNS终止反应，其他步骤相同。酶活定义：1mL粗酶液在1min分解底物产生1μmol葡萄糖为一个酶活单位(U)。
[0017] 超声波预处理底物步骤中，所使用的仪器为宁波新芝生物科技有限公司制造的JY92-Ⅱ，超升功率700～900W超声处理40～55分钟效果最佳。
[0018] 本发明具有以下优势：
[0019] 1)成本低：整个发酵过程条件温和，对设备要求不高而且耗能低，同时使用小麦麸皮作为发酵底物，充分利用了农业生产中的边角料，既压缩了纤维素酶的生产成本，又变废为宝，充分利用了资源；
[0020] 2)酶活力较高：本发明所涉及菌株具有较强的纤维素降解能力，通过超声波预处理底物，能够较明显提高纤维素酶活。
[0021] 3)应用前景好：地球上纤维素储量巨大，具有巨大的潜在价值，能否利用纤维素资源对社会经济发展具有重大战略意义，本发明立足于上述问题，对纤维素的利用进行了尝试，获得了理想的结果，具有很好的前景。
附图说明
[0022] 图1为本发明菌株PDA培养3天的菌落图。
具体实施方式
[0023] 以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定，本发明可以按发明内容所述的任一方式实施。
[0024] 实例1：草酸青霉Penicillium oxalicum WX-209的筛选及鉴定方法[0025] a、初筛：从甘肃文县发霉核桃、岳麓山土样、桔园土样、猕猴桃园土样、岳麓山腐烂树枝等18处采集样品。取样品5g加入100mL 2％(W/V)CMC-Na液体富集培养基，于35℃、6 8
170r/min摇床条件下富集培养3天后，取1mL培养液稀释至10-10，取0.2mL稀释液均匀涂布在CMC-Na为碳源的筛选平板培养基上，培养3天后，用刚果红染色的方法筛选出透明圈较大的霉菌菌株共20支，进一步进行划平板纯化菌株，最后转接至PDA斜面培养基上培养保存。
170r/min摇床条件下富集培养3天后，取1mL培养液稀释至10-10，取0.2mL稀释液均匀涂布在CMC-Na为碳源的筛选平板培养基上，培养3天后，用刚果红染色的方法筛选出透明圈较大的霉菌菌株共20支，进一步进行划平板纯化菌株，最后转接至PDA斜面培养基上培养保存。
[0026] b、复筛：配制Mandels营养液，250mL三角瓶装液量50mL，加入质量百分比2％的6
CMC-Na，121℃高压灭菌15min，接种初筛孢子悬液至1×10孢子/mL，恒温摇床中培养72h，温度35℃，自然pH，转速170r/min。发酵液离心后用于检测CMCase酶活力。通过筛选获得CMCase酶活力较高的菌株Penicillium oxalicum WX-209。
CMC-Na，121℃高压灭菌15min，接种初筛孢子悬液至1×10孢子/mL，恒温摇床中培养72h，温度35℃，自然pH，转速170r/min。发酵液离心后用于检测CMCase酶活力。通过筛选获得CMCase酶活力较高的菌株Penicillium oxalicum WX-209。
[0027] c、菌株鉴定：通过ITS序列扩增比对鉴定，表明该序列与Penicillium oxalicum属相似度为99％，证明为草酸青霉的菌株，最终命名为Penicillium oxalicum WX-209。
[0028] 实施例2：
[0029] 将草酸青霉孢子接种到斜面培养基上，35℃生长4天后，用无菌水洗下孢子，制成孢子悬液4℃冷藏备用。
[0030] 称取麸皮2.4g投入到30ml Mandels营养液中，充分浸润。浸润后进行超声波预处理，在超声功率800W条件下超声处理50分钟。处理后，高压灭菌20min，灭菌结束后冷却6
至室温，在无菌条件下接入草酸青霉孢子，使接种孢子浓度达到1×10个/mL。将接种后的摇瓶置于恒温摇床中35℃培养72h，设置转速为170r/min。将培养液抽滤或离心，得到粗酶液，用DNS法检测酶液CMCase酶活力，测得CMCase酶活为7.15U，与未进行超声波预处理组(6.0U)对照活力提高15.2％。
至室温，在无菌条件下接入草酸青霉孢子，使接种孢子浓度达到1×10个/mL。将接种后的摇瓶置于恒温摇床中35℃培养72h，设置转速为170r/min。将培养液抽滤或离心，得到粗酶液，用DNS法检测酶液CMCase酶活力，测得CMCase酶活为7.15U，与未进行超声波预处理组(6.0U)对照活力提高15.2％。
[0031] 实施例3：
[0032] 将草酸青霉孢子接种到斜面培养基上，35℃生长3天后，用无菌水洗下孢子，制成孢子悬液4℃冷藏备用。
[0033] 称取麸皮2.4g投入到30ml Mandels营养液中，充分浸润。浸润后进行超声波预处理，在超声功率800W条件下超声处理55分钟。处理后，高压灭菌20min，灭菌结束后冷却5
至室温，在无菌条件下接入草酸青霉孢子，使接种孢子浓度达到1×10个/mL。将接种后的摇瓶置于恒温摇床中35℃培养72h，设置转速为180r/min。将培养液抽滤或离心，得到粗酶液，用DNS法检测酶液CMCase酶活力，测得CMCase酶活为6.70U，与未进行超声波预处理组(5.94U)对照活力提高12.8％。
至室温，在无菌条件下接入草酸青霉孢子，使接种孢子浓度达到1×10个/mL。将接种后的摇瓶置于恒温摇床中35℃培养72h，设置转速为180r/min。将培养液抽滤或离心，得到粗酶液，用DNS法检测酶液CMCase酶活力，测得CMCase酶活为6.70U，与未进行超声波预处理组(5.94U)对照活力提高12.8％。