一种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法转让专利
申请号 : CN201310443433.X
文献号 : CN103468636B
文献日 : 2015-05-06
发明人 : 杨明 , 裘文慧 , 陈静思 , 潘辰苑 , 雷湘杰 , 吴明红
申请人 : 上海大学
摘要 :
本发明提供一种生物工程技术领域的鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法，即，选鲤鱼进行解剖，无菌取头肾并剪碎，经细胞筛过滤得细胞悬液，后经离心洗涤，加入细胞培养液得到新的细胞悬液；用血小球计数板进行计数，再以最适培养条件铺板法培养增殖，最后对得到的原代巨噬细胞多种方法镜检鉴定。本发明直接无菌取鲤鱼头肾，进行铺板法培养以提取巨噬细胞，经鉴定，确实得到了数量多、纯度高的离体鲤鱼原代巨噬细胞，保证了所提取离体细胞的成活率，为进一步开展鲤鱼巨噬细胞毒理试验及其他实验打下基础。
权利要求 :
1.一种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：选择规格均匀、体格健壮的平均体重400-600g的鲤鱼预养2周；
然后，在无菌条件下进行如下过程：
用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后用无菌注射器从尾静脉抽血至鱼腮微白，用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌，再沿鳃盖后缘剪至下颌，打开左侧体壁肌肉，找到红鲤鱼头肾所在位置，用高压灭菌的解剖器具无菌取头肾，并将之置于5 ml的Hank’s平衡盐工作液中重悬，用Hank’s平衡盐工作液清洗头肾组织2-3次至头肾发白，以洗去头肾组织中残留的血液；
将头肾剪碎成约1 mm × 1 mm 块状，经孔径为100 μm 的细胞筛研磨筛选过滤，得
3-5 ml细胞重悬液，1000 rpm离心5 min后，移去上清，继续用Hank’s平衡盐工作液1000 rpm，5 min离心洗涤细胞2次后弃上清，加入3 ml细胞培养液，轻轻吹打，使细胞重悬；
用血小球计数板对细胞悬液进行计数，然后用细胞培养液将细胞悬液浓度稀释至
7 7
4×10cells/ml，24孔板铺进1×10 cells/孔，26℃贴壁培养24h；
用细胞培养液反复洗涤2-3次，洗去未贴壁的细胞后得到分离的鲤鱼原代巨噬细胞；
其中，
Hank’s平衡盐工作液组成为：100 ml HBSS（Hank’s平衡盐溶液），1 ml 1%双抗储液，
100 μl 10U/ml Heparin（肝素钠）储液；
铺板法所用培养基液组成为：95ml Leibovitz’s L-15培养基、5ml 5%FCS（小牛血清）、1ml 0.01 M Hepes缓冲液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）、1ml 1% 双抗储液、100μl 10 U/ml Heparin（肝素钠）储液；并且，培养基液按照上述比例配制后，用1 M NaOH储液调节pH至
7.0-7.4之间，然后用0.22 μm滤头过滤分装；
细胞培养温度为：26℃。
说明书 :
一种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种生物工程技术领域的细胞提取和鉴定方法，具体地说，涉及的是一种鲤鱼局部细胞的提取和鉴定方法。
背景技术
[0002] 鱼类的免疫系统是由非特异性免疫和特异性免疫组成。鱼类的免疫系统亦由免疫组织和器官、免疫细胞和体液免疫因子组成。而免疫细胞有两类：一类是淋巴细胞，主要进
行特异性免疫反应；另一类是吞噬细胞，是非特异性免疫的关键成分，在抵御微生物感染方
面具有重要作用。非特异性免疫系统在鱼类抵抗病原生物入侵时发挥着更为重要的作用。
巨噬细胞是一种白血球，源自单核细胞，主要是以固定或游离细胞的形态对细胞残片和病
原体进行吞噬和消化，再激活淋巴球等免疫细胞，使之对病原体做出反应，阻止其扩散和生
长。所以巨噬细胞在鱼类免疫过程中占有极其重要的作用。鱼类巨噬细胞可从不同组织中
得到，包括血液、免疫器官(如肾脏)和腹膜腔。
行特异性免疫反应；另一类是吞噬细胞，是非特异性免疫的关键成分，在抵御微生物感染方
面具有重要作用。非特异性免疫系统在鱼类抵抗病原生物入侵时发挥着更为重要的作用。
巨噬细胞是一种白血球，源自单核细胞，主要是以固定或游离细胞的形态对细胞残片和病
原体进行吞噬和消化，再激活淋巴球等免疫细胞，使之对病原体做出反应，阻止其扩散和生
长。所以巨噬细胞在鱼类免疫过程中占有极其重要的作用。鱼类巨噬细胞可从不同组织中
得到，包括血液、免疫器官(如肾脏)和腹膜腔。
[0003] 鲤鱼属鲤科(Cyprinidae)，是一种原产亚洲的淡水鱼，在全国各地均有分布，是我国主要的养殖鱼种之一。鲤鱼具有很大的食用和观赏价值，深受我国广大消费者喜爱。所
以作为我们生活中很常见的鱼种之一，鲤鱼和人类联系紧密，所以可以通过探索鲤鱼自身
受环境影响程度进而来评估环境对人类的影响，而鲤鱼对环境刺激的反应源自于自身免疫
系统的应激行为，所以作为鱼体中非特异性免疫的重要组成部分，巨噬细胞的变化可以更
直观的体现应激过程，从而评估环境对其的影响程度。所以提取鲤鱼原代巨噬细胞对进行
环境激素毒理实验具有十分重要的意义。
以作为我们生活中很常见的鱼种之一，鲤鱼和人类联系紧密，所以可以通过探索鲤鱼自身
受环境影响程度进而来评估环境对人类的影响，而鲤鱼对环境刺激的反应源自于自身免疫
系统的应激行为，所以作为鱼体中非特异性免疫的重要组成部分，巨噬细胞的变化可以更
直观的体现应激过程，从而评估环境对其的影响程度。所以提取鲤鱼原代巨噬细胞对进行
环境激素毒理实验具有十分重要的意义。
[0004] 所以本发明中提供的这种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法能够很好的保证离体巨噬细胞的数量和纯度，从而能够保证满足以鲤鱼巨噬细胞为实验对象的环境激素毒
理实验及其他实验的需要。
理实验及其他实验的需要。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法，即无菌剪取鲤鱼头肾，剪碎经筛网过滤，直接铺板过夜，洗去未贴壁的细胞，得到鲤鱼原代巨噬细胞。同时，
利用多种方法经行镜检鉴定。本发明能保证所提取原代巨噬细胞的成活率和可靠性，为进
一步开展鲤鱼巨噬细胞毒理实验打下基础。
利用多种方法经行镜检鉴定。本发明能保证所提取原代巨噬细胞的成活率和可靠性，为进
一步开展鲤鱼巨噬细胞毒理实验打下基础。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 首先配制Hank’s平衡盐工作液及培养基液。
[0008] Hank’s平衡盐工作液组成为：100 ml HBSS（Hank’s平衡盐溶液），1 ml 1%双抗储液，100 μl 10U/ml Heparin（肝素钠）储液。
[0009] 铺板法所用最适培养基液组成为：95ml Leibovitz’s L-15培养基、5ml 5%FCS（小牛血清）、1ml 0.01 M Hepes缓冲液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）、1ml 1% 双抗储液、100μl 10
U/ml Heparin（肝素钠）储液；用1 M NaOH储液调节pH至7.0-7.4之间，然后用0.22 μm
滤头过滤分装。
U/ml Heparin（肝素钠）储液；用1 M NaOH储液调节pH至7.0-7.4之间，然后用0.22 μm
滤头过滤分装。
[0010] 其步骤如下：
[0011] a.细胞的提取：选择规格均匀、体格健壮的平均体重400-600g的鲤鱼预养2周，饲养条件为，水温25 ± 1°C，光照周期为光照:黑暗=14 h:10 h，每天两次喂食丰年虾。
解剖鲤鱼，从尾静脉抽血至鱼腮微白，用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌，找到红鲤鱼
头肾所在位置，用灭菌解剖器具无菌取头肾并置于Hank’s平衡盐工作液中重悬，用Hank’s
平衡盐工作液清洗2-3次至头肾发白，将头肾剪碎成约1 mm × 1 mm 块状，经孔径为100
μm 细胞筛过滤得细胞悬液，用Hank’s平衡盐工作液1000 rpm，5 min离心洗涤细胞2次
后弃上清，加入细胞培养液，吹打使细胞重悬。用血小球计数板进行计数，并用细胞培养液
稀释，以铺板法培养鲤鱼巨噬细胞的最适培养条件铺板法贴壁培养增殖，最适条件为：细胞
7 7
悬液稀释到4×10cells/ml浓度，24孔板铺进1×10 cells/孔，26℃条件下贴壁培养24h，
用培养基反复洗涤2-3次洗去未贴壁的细胞后得到分离的原代巨噬细胞。（图1）
解剖鲤鱼，从尾静脉抽血至鱼腮微白，用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌，找到红鲤鱼
头肾所在位置，用灭菌解剖器具无菌取头肾并置于Hank’s平衡盐工作液中重悬，用Hank’s
平衡盐工作液清洗2-3次至头肾发白，将头肾剪碎成约1 mm × 1 mm 块状，经孔径为100
μm 细胞筛过滤得细胞悬液，用Hank’s平衡盐工作液1000 rpm，5 min离心洗涤细胞2次
后弃上清，加入细胞培养液，吹打使细胞重悬。用血小球计数板进行计数，并用细胞培养液
稀释，以铺板法培养鲤鱼巨噬细胞的最适培养条件铺板法贴壁培养增殖，最适条件为：细胞
7 7
悬液稀释到4×10cells/ml浓度，24孔板铺进1×10 cells/孔，26℃条件下贴壁培养24h，
用培养基反复洗涤2-3次洗去未贴壁的细胞后得到分离的原代巨噬细胞。（图1）
[0012] b.细胞的鉴定：对得到的原代巨噬细胞镜检鉴定，分别用台盼蓝染色法、瑞氏-姬姆萨染色法和非特异酯酶染色法进行鉴定。
[0013] 本发明的优点是：提取鲤鱼原代巨噬细胞所需时间短，细胞数量多，纯度和成活率高，操作简单可行。鲤鱼原代巨噬细胞成功提取为分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细
胞工程等领域的深入研究奠定了基础。
胞工程等领域的深入研究奠定了基础。
附图说明
[0014] 图1为细胞铺板数为1×107 cells时巨噬细胞贴壁24h后贴板密度。
[0015] 图2为巨噬细胞不同铺板密度下20℃和26℃培养存活细胞个数。
[0016] 图3为巨噬细胞不同铺板密度连续培养3天细胞死亡率。
[0017] 图4为台盼蓝染色法鉴定红鲤鱼巨噬细胞。
[0018] 图5为瑞氏-姬姆萨染色法鉴定红鲤鱼巨噬细胞。
[0019] 图6为α-NBE染色法鉴定红鲤鱼巨噬细胞。
具体实施方式
[0020] 下面结合实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术为前提下进行实施。实施例
[0021] 选择规格均匀、体格健壮的平均体重400-600g的鲤鱼预养2周，饲养条件为，水温25 ± 1°C，光照周期为光照:黑暗=14 h:10 h，每天两次喂食丰年虾。实验前按组成为
100 ml HBSS（Hank’s平衡盐溶液），1 ml 1%双抗储液，100 μl 10U/ml Heparin（肝素钠）
液配制Hank’s平衡盐工作液；按组成为：95ml Leibovitz’s L-15培养基、5ml 5%FCS（小
牛血清）、1ml 0.01 M Hepes缓冲液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）、1ml 1% 双抗储液、100μl 10
U/ml 肝素纳配制铺板法中所用的最适培养基液，并用1 M NaOH储液调节pH至7.0-7.4之
间，然后用0.22 μm滤头过滤分装。然后用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后用无菌注射器从
尾静脉抽血至鱼腮微白，用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌，再沿鳃盖后缘剪至下颌，
打开左侧体壁肌肉，找到红鲤鱼头肾所在位置，用高压灭菌的解剖器具无菌取头肾，并将之
置于5 ml的Hank’s平衡盐工作液中重悬，用Hank’s平衡盐工作液清洗头肾组织2-3次
至头肾发白，以洗去头肾组织中残留的血液。将头肾剪碎成约1 mm × 1 mm 块状，经孔径
为100 μm 的细胞筛研磨筛选过滤，得3-5 ml细胞重悬液，1000 rpm离心5 min后，移去
上清。继续用Hank’s平衡盐工作液1000 rpm，5 min离心洗涤细胞2次后弃上清，加入3
ml细胞培养液，轻轻吹打，使细胞重悬。此过程要在无菌条件下严格操作。
100 ml HBSS（Hank’s平衡盐溶液），1 ml 1%双抗储液，100 μl 10U/ml Heparin（肝素钠）
液配制Hank’s平衡盐工作液；按组成为：95ml Leibovitz’s L-15培养基、5ml 5%FCS（小
牛血清）、1ml 0.01 M Hepes缓冲液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）、1ml 1% 双抗储液、100μl 10
U/ml 肝素纳配制铺板法中所用的最适培养基液，并用1 M NaOH储液调节pH至7.0-7.4之
间，然后用0.22 μm滤头过滤分装。然后用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后用无菌注射器从
尾静脉抽血至鱼腮微白，用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌，再沿鳃盖后缘剪至下颌，
打开左侧体壁肌肉，找到红鲤鱼头肾所在位置，用高压灭菌的解剖器具无菌取头肾，并将之
置于5 ml的Hank’s平衡盐工作液中重悬，用Hank’s平衡盐工作液清洗头肾组织2-3次
至头肾发白，以洗去头肾组织中残留的血液。将头肾剪碎成约1 mm × 1 mm 块状，经孔径
为100 μm 的细胞筛研磨筛选过滤，得3-5 ml细胞重悬液，1000 rpm离心5 min后，移去
上清。继续用Hank’s平衡盐工作液1000 rpm，5 min离心洗涤细胞2次后弃上清，加入3
ml细胞培养液，轻轻吹打，使细胞重悬。此过程要在无菌条件下严格操作。
[0022] 用血小球计数板对细胞悬液进行计数。计数时，血小球计数板共25个大格，每个大格放大后是4×4的小格，数血小球计数板的四个角以及
中央位置的大格共5个大格，得到5个大格的细胞总数N，然后按下式计算： ，单位为cells/ml。然后用细胞培养液将细胞悬液浓度稀释至
7
4×10cells/ml，以不同铺板数分别在20℃和26℃下对巨噬细胞进行贴壁培养，观察存活
细胞个数(图2)，并统计3d内细胞死亡率(图3)，从而选择最适培养条件，即24孔板铺进
7
1×10 cells/孔，26℃贴壁培养24h。用细胞培养液反复洗涤2-3次，洗去未贴壁的细胞
后得到分离的鲤鱼原代巨噬细胞。
中央位置的大格共5个大格，得到5个大格的细胞总数N，然后按下式计算： ，单位为cells/ml。然后用细胞培养液将细胞悬液浓度稀释至
7
4×10cells/ml，以不同铺板数分别在20℃和26℃下对巨噬细胞进行贴壁培养，观察存活
细胞个数(图2)，并统计3d内细胞死亡率(图3)，从而选择最适培养条件，即24孔板铺进
7
1×10 cells/孔，26℃贴壁培养24h。用细胞培养液反复洗涤2-3次，洗去未贴壁的细胞
后得到分离的鲤鱼原代巨噬细胞。
[0023] 得到的原代巨噬细胞分别用台盼蓝染色法、瑞氏·姬姆萨染色法和非特异酯酶染色法镜检鉴定细胞。可以清晰地看到：原代巨噬细胞经台盼蓝染色后死细胞被染成蓝色，
活细胞没有被染上颜色，发现细胞生长状态良好，贴壁均匀，死亡率低（图4）；经瑞氏-姬
姆萨染色后，细胞核为紫色，而细胞质为蓝色，细胞形态不规则，胞质丰富，含有大小不一
的空泡，细胞核主要为椭圆形，说明该贴壁细胞为单核细胞（图5）；经α-丁酸萘酚酯酶
(α-NBE)染色后细胞胞浆呈现棕红色，胞内有蓝色颗粒，说明该贴壁细胞为单核细胞（图
6）。所提取的鲤鱼原代巨噬细胞生长良好，适合于进行以鲤鱼原代巨噬细胞为实验对象的
环境激素毒理实验及其他实验。
活细胞没有被染上颜色，发现细胞生长状态良好，贴壁均匀，死亡率低（图4）；经瑞氏-姬
姆萨染色后，细胞核为紫色，而细胞质为蓝色，细胞形态不规则，胞质丰富，含有大小不一
的空泡，细胞核主要为椭圆形，说明该贴壁细胞为单核细胞（图5）；经α-丁酸萘酚酯酶
(α-NBE)染色后细胞胞浆呈现棕红色，胞内有蓝色颗粒，说明该贴壁细胞为单核细胞（图
6）。所提取的鲤鱼原代巨噬细胞生长良好，适合于进行以鲤鱼原代巨噬细胞为实验对象的
环境激素毒理实验及其他实验。