嗜水气单胞菌适体及其筛选方法与应用转让专利
申请号 : CN201310363869.8
文献号 : CN103468685B
文献日 : 2016-04-27
发明人 : 李元跃 , 王雷 , 段博文 , 陈融斌 , 黎中宝
申请人 : 集美大学
摘要 :
本发明涉及嗜水气单胞菌适体及其筛选方法与应用。提供嗜水气单胞菌适体以及所述嗜水气单胞菌适体的筛选方法与应用。所述嗜水气单胞菌适体的筛选方法的具体步骤包括：构建并合成待筛选的嗜水气单胞菌适体ssDNA文库，并设计合成相应的引物；取适量所述ssDNA文库与嗜水气单胞菌进行结合；分离获得与嗜水气单胞菌结合的ssDNA，以该ssDNA为模板进行PCT扩增，扩增产物再次进行SELEX筛选直至获得相应适体。本发明采用SELEX技术筛选出致病性嗜水气单胞菌的高亲和力寡核苷酸适体，所述适体可广泛应用于嗜水气单胞菌的检测与分析。
权利要求 :
1.嗜水气单胞菌适体，其特征在于，其序列为：GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGTGTGTTGGTGGGTGTGTGTTTGGGTTCTTGGGTTTCGACATGAGGCCCGGATC。
2.如权利要求1所述嗜水气单胞菌适体在检测嗜水气单胞菌中的应用，所述应用为非疾病诊断目的的应用。
说明书 :
嗜水气单胞菌适体及其筛选方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及水产养殖中常见的致病病原菌——嗜水气单胞菌，特别涉及嗜水气单胞菌适体及其筛选方法与应用。
背景技术
[0002] 嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）在自然界分布广泛，是多种水生动物的原发性致病菌，可产生多种致病因子，对水产动物，畜禽和人类均有致病性，可引起多种动物的败血症和人类腹泻，给人类健康带来了威胁，同时也给养殖业造成较大的经济损失（1.张翠娟，于宙亮，赵宝华，何宏轩．嗜水气单胞菌研究进展[J].中国兽医杂志，2008,42（7）：46-50.）。因此，对于作为水源污染指示菌的嗜水气单胞菌污染，其检测力度仍需进一步加强。
目前嗜水气单胞菌的检测一直是个棘手的问题，传统的化学病理检测过程繁琐，耗费时间；
酶联免疫、多重PCR技术则成本过高（2.王利．鱼类嗜水气单胞菌的几种检测方法[J]．内陆水产，2006（,2）：22-23．）。因此，开发一种操作简便，成本低廉，快速方便的嗜水气单胞菌检测方法，成为本领域技术人员迫切需要解决的技术难题。
目前嗜水气单胞菌的检测一直是个棘手的问题，传统的化学病理检测过程繁琐，耗费时间；
酶联免疫、多重PCR技术则成本过高（2.王利．鱼类嗜水气单胞菌的几种检测方法[J]．内陆水产，2006（,2）：22-23．）。因此，开发一种操作简便，成本低廉，快速方便的嗜水气单胞菌检测方法，成为本领域技术人员迫切需要解决的技术难题。
[0003] SELEX( Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)即指数富集配体系统进化技术，是1990年由美国的Tuerk和Gold创建的一种体外合成筛选寡核苷酸适体的化学组合技术（3.孟庆玲，陈创夫．SELEX技术及其应用前景[J]．塔里木大学学报，2008，20(3):44-48． 4.廖世奇，刘巍，王黎．SELEX技术应用研究进展[J]．甘肃医药，2009，(02)：96-97．）。由于适体具有特异性高、库容量大、合成时间短（5.王聪艳，孙伟，李建国，等．SELEX技术应用研究进展[J]．生物技术通报 ，2006，(S1)：232-236．）等优点， SELEX技术现在广泛应用在疾病防控、药物筛选、临床诊断等不同的技术领域，随着技术的不断创新与发展，逐渐产生了一些新的SELEX筛选方法，如导向SELEX技术、复合靶分子SELEX技术、基因组SELEX技术等新的研究手段（6.孟庆玲，陈创夫．SELEX技术及其应用前景[J]．塔里木大学学报，2008，20(3):44-48．）。
发明内容
[0004] 本发明的第一目的在于提供嗜水气单胞菌适体。
[0005] 本发明的第二目的在于提供所述嗜水气单胞菌适体的筛选方法。
[0006] 本发明的第三目的在于提供所述嗜水气单胞菌适体在检测述嗜水气单胞菌中的应用。
[0007] 所述嗜水气单胞菌适体的核酸序列如序列表中1-22号中的序列所示。
[0008] 所述嗜水气单胞菌适体的筛选方法是将指数富集配体系统进化技术（即SELEX 筛选）应用于嗜水气单胞菌适体的筛选，所述SELEX 筛选的具体步骤包括：
[0009] 1）构建并合成待筛选的嗜水气单胞菌适体ssDNA文库，并设计合成相应的引物；
[0010] 2）取适量所述ssDNA文库与嗜水气单胞菌进行结合；
[0011] 3）分离获得与嗜水气单胞菌结合的ssDNA，以该ssDNA为模板进行PCT扩增，扩增产物再次进行SELEX 筛选直至获得相应适体。
[0012] 在步骤1）中，所述ssDNA文库可为：：5′-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-N35-TT CGA CAT GAG GCC CGG ATC-3′。
[0013] 所述引物可为：
[0014] 引物Ⅰ：5′-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3′；
[0015] 引物Ⅱ：5′-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3′；
[0016] 引物Ⅲ：5′-地高辛-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3′；
[0017] 引物Ⅳ：5′-生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3′。
[0018] 在步骤3）中，所述SELEX 筛选共进行12轮。
[0019] 本发明采用SELEX技术筛选出致病性嗜水气单胞菌的高亲和力寡核苷酸适体，所述适体为嗜水气单胞菌的快速检测技术的开发以及在水产病害控制方面的应用提供参考，可广泛应用于嗜水气单胞菌的检测与分析。
附图说明
[0020] 图1为 PCR产物3%琼脂糖凝胶电泳图。在图1中，M为50bp DNA marker，1、3、5、7、9、11、12分别表示第1、3、5、7、9、11、12轮的PCR产物。
[0021] 图2为适体与嗜水气单胞菌结合的吸光度。在图2中，横坐标为筛选轮数，纵坐标为A450nm时的吸光度。
[0022] 图3-图5为本发明所筛选的核酸适体二级结构图。图3中的结构最小自由能为-7.60千卡/摩，图4中的结构最小自由能为1.83千卡/摩，图5中的结构最小自由能为-3.11千卡/摩。
具体实施方式
[0023] 一、 ssDNA文库及引物的合成
[0024] 参照文献（7、刘丰伟，兰小鹏．体外筛选铜绿假单胞菌适体的研究及初步应用[D]．福州福建医科大学，2007．）中公开的方法，用于SELEX筛选的随机ssDNA文库和引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0025] 所用文库为：5′-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-N35-TT CGA CAT GAG GCC CGG ATC-3′。
[0026] 所用引物分别为：
[0027] 引物Ⅰ：5′-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3′；
[0028] 引物Ⅱ：5′-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3′；
[0029] 引物Ⅲ：5′-地高辛-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3′；
[0030] 引物Ⅳ：5′-生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3′。
[0031] 上述引物在合成后用分子生物学中常用的TE缓冲液（pH8.0）稀释至浓度为10μmol，-20℃保存备用。
[0032] 二、实验试剂及缓冲液制备
[0033] Dynabeads链酶亲和素磁珠M-280试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、50bp DNA Ladder Marker、牛血清白蛋白（BSA）均购自厦门鹭隆生物技术有限公司，PCR胶回收纯化试剂盒购自omega公司，抗地高辛碱性磷酸酶购自Roche公司，对硝基苯磷酸二钠为Amresco公司产品。缓冲液参照参考文献(刘丰伟，兰小鹏．体外筛选铜绿假单胞菌适体的研究及初步应用[D]．福州福建医科大学，2007．)配制。
[0034] 三、菌种：嗜水气单胞菌AS1.1801购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0035] 四、SELEX筛选
[0036] 取一定量随机ssDNA文库（首轮筛选用量为600pmol，随后每轮减少用量），加入600μL选择缓冲液稀释ssDNA，于95℃变性5min，冷却10min。加入30μL的嗜水气单胞菌菌悬液8
（菌的数量约为1.5×10个），混匀置摇床室温结合30min，15000r/min，4℃下离心10min。之后弃上清液，加入600μL选择缓冲液重悬，如此重复洗涤3次，洗去未与嗜水气单胞菌结合的ssDNA，结合了ssDNA的嗜水气单胞菌沉淀用100μL ddH2O重悬，96℃加热5min，离心后取上清为模板，用引物Ⅰ、Ⅳ进行PCR扩增，获得标记生物素的双链DNA（dsDNA），利用M-280磁珠通过生物素－链亲和素之间的相互作用分离ssDNA，作为下一轮筛选的次级库。依照上述方法，对次级库再次进行SELEX筛选，先后进行12轮SELEX筛选。
（菌的数量约为1.5×10个），混匀置摇床室温结合30min，15000r/min，4℃下离心10min。之后弃上清液，加入600μL选择缓冲液重悬，如此重复洗涤3次，洗去未与嗜水气单胞菌结合的ssDNA，结合了ssDNA的嗜水气单胞菌沉淀用100μL ddH2O重悬，96℃加热5min，离心后取上清为模板，用引物Ⅰ、Ⅳ进行PCR扩增，获得标记生物素的双链DNA（dsDNA），利用M-280磁珠通过生物素－链亲和素之间的相互作用分离ssDNA，作为下一轮筛选的次级库。依照上述方法，对次级库再次进行SELEX筛选，先后进行12轮SELEX筛选。
[0037] 五、各轮适体与嗜水气单胞菌结合率的测定以及适体的序列测定与分析
[0038] 将第1、3、5、7、9、11、12轮SELEX筛选的产物（即该轮的洗脱上清），用引物Ⅲ和引物Ⅳ进行PCR扩增，各轮均扩增320μL。PCR扩增体系为：2× Taq PCR MasterMix 10ul，上游引物(10um)、下游引物(10um)各0.4ul，模板1ul，用去离子水补足到20ul。PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃-70℃退火30s，72℃延伸20s，24个循环；72℃延伸3min。
[0039] 将PCR扩增产物用胶回收纯化试剂盒进行纯化，纯化产物利用3%的琼脂糖电泳检测，可以看出电泳条带越来越致密，同时弥散现象越来越少，条带随着筛选次数的增加越来越整齐且亮度有所增加。说明随着筛选次数的增加，特异性适体得到了富集，其同源性可能比较高
[0040] 纯化后的PCR产物用链霉亲和素磁珠将纯化的dsDNA解链成ssDNA，此ssDNA即带有地高辛标记，测定其含量。再按ssDNA∶嗜水气单胞菌=300pmol∶1.5×108的比例，将两者在500μL选择缓冲液中结合30min，离心后加入100μL 1∶15000稀释的抗地高辛抗体标记的碱性磷酸酶反应10min，离心弃上清并用500μL选择缓冲液悬浮嗜水气单胞菌，重复洗涤3次，洗去未与嗜水气单胞菌上ssDNA-地高辛结合的抗地高辛抗体标记的碱性磷酸酶，然后加入
100μL对硝基苯磷酸盐溶液显色，显色好后加入100μL 2mol/L NaOH 终止反应，用酶标仪于
405 nm测定吸光度值，实验结果参见图1。该亲和力测定结果表明，随着筛选轮数的增加，适体与菌液的亲和力逐渐增大，在第九轮时达到最大，之后亲和力变化不大、趋于平缓，说明适体达到了饱和。
100μL对硝基苯磷酸盐溶液显色，显色好后加入100μL 2mol/L NaOH 终止反应，用酶标仪于
405 nm测定吸光度值，实验结果参见图1。该亲和力测定结果表明，随着筛选轮数的增加，适体与菌液的亲和力逐渐增大，在第九轮时达到最大，之后亲和力变化不大、趋于平缓，说明适体达到了饱和。
[0041] 再用引物Ⅰ和引物Ⅱ将第12轮的PCR产物大量扩增，纯化后送于英骏生物技术有限公司克隆、克隆之后随机取24个克隆子测序，获得22条符合要求的适体序列。按照随机序列碱基的数目分为A群、B群两个群。A群（见表1）包括13条适体序列，与预期长度一致，B群（见表2）包含9条序列，均短于预期长度。测序结果见表1。用Macaw 2.05软件包分析22个适体的同源序列，获得4个保守序列：GTTTTX（见于A1-1、A1-8、A1-13、A1-17、A1-20、A1-21、A1-26、A1-30号适体）；GTGGGT（见于A1-1、A1-7、A1-12、A1-15、A1-22、A1-29）；GTTTX（见于A1-1、A1-5、A1-7、A1-10、A1-13、A1-14、A1-15、A1-18、A1-21、A1-22、A1-29）；XTTTT（见于A1-14、A1-
26、A1-27）。有的适体中同一保守序列出现多次，如A1-18中三次出现GTTTG；有的适体中则出现多个保守序列，但没有发现存在于所有适体中的保守序列。
26、A1-27）。有的适体中同一保守序列出现多次，如A1-18中三次出现GTTTG；有的适体中则出现多个保守序列，但没有发现存在于所有适体中的保守序列。
[0042]适体 序列表中的编号 核酸序列
A1-3 1 TGGTGGTCTGCTAGCGGTTTATGTTTTTGTCTGGT
A1-4 2 AGGATGGATTAGTGGGATTGGTGGTTAGGGGGGG
A1-5 3 GACCTCGTCTTCGGTGTGATCGTTTCTTGTTGTTG
A1-7 4 GGTGTGTTGGTGGGTGTGTGTTTGGGTTCTTGGGT
A1-14 5 TGCGGCTGTGTGGGTGGTTTGGGTTTGTTGCTTTT
A1-15 6 GCGGTGGGTGGTAGGTTTGTGTTTGTTAATGGGTG
A1-17 7 GTTGTCTCTGGTGTTTTGGATTGATGGCCTTGCTG
A1-18 8 GGTGTCTGGTTTGTTGTGGTTGTTTGTGGTTTGTG
A1-20 9 GCGGTTATGTGAAATTATGGCATGGTTTTGTGGTG
A1-26 10 GGTCCATTGGCTGTGTTTTCTAGGTGTTATGTTTT
A1-27 11 GGTCGTTAGACGGGGCTAGTAATATATTTCCTTTT
A1-29 12 CTGTCGTGTGTTTGGGTGTGGGTCGTGTGGTTGGT
A1-31 13 GTATAGATGTACTGCTGTGCATATCCTATGCAACT
A1-3 1 TGGTGGTCTGCTAGCGGTTTATGTTTTTGTCTGGT
A1-4 2 AGGATGGATTAGTGGGATTGGTGGTTAGGGGGGG
A1-5 3 GACCTCGTCTTCGGTGTGATCGTTTCTTGTTGTTG
A1-7 4 GGTGTGTTGGTGGGTGTGTGTTTGGGTTCTTGGGT
A1-14 5 TGCGGCTGTGTGGGTGGTTTGGGTTTGTTGCTTTT
A1-15 6 GCGGTGGGTGGTAGGTTTGTGTTTGTTAATGGGTG
A1-17 7 GTTGTCTCTGGTGTTTTGGATTGATGGCCTTGCTG
A1-18 8 GGTGTCTGGTTTGTTGTGGTTGTTTGTGGTTTGTG
A1-20 9 GCGGTTATGTGAAATTATGGCATGGTTTTGTGGTG
A1-26 10 GGTCCATTGGCTGTGTTTTCTAGGTGTTATGTTTT
A1-27 11 GGTCGTTAGACGGGGCTAGTAATATATTTCCTTTT
A1-29 12 CTGTCGTGTGTTTGGGTGTGGGTCGTGTGGTTGGT
A1-31 13 GTATAGATGTACTGCTGTGCATATCCTATGCAACT
[0043] 表1 A群嗜水气单胞菌适体
[0044]适体 序列表中的编号 核酸序列
A1-1 14 GGTGGTGGGTGTTTTGTCGGTTTGGTGTTTGGT
A1-8 15 TGGCGGTGTTTTTGGGTGGGGTTATAGG
A1-10 16 CTGGCTGTTCGTTTAGAATGAACCGGTCATG
A1-12 17 GTTGTGGTGGGGTCGGAGGTTGTCTGGT
A1-13 18 TGGTGTTTGGTTGTTTTGTTTGG
A1-21 19 TTTGTGGCGGGGTTTGCTTGGTTTTGTGGTGG
A1-22 20 GGGGTGGGTGGGTGTGTGTTTGGTTGGTTTG
A1-30 21 GGGTTGGTTTGGGGGGGGCTGTTTTG
A1-28 22 GGGTGGGTTGGTTGGTGGTTGTTTTTGTG
A1-1 14 GGTGGTGGGTGTTTTGTCGGTTTGGTGTTTGGT
A1-8 15 TGGCGGTGTTTTTGGGTGGGGTTATAGG
A1-10 16 CTGGCTGTTCGTTTAGAATGAACCGGTCATG
A1-12 17 GTTGTGGTGGGGTCGGAGGTTGTCTGGT
A1-13 18 TGGTGTTTGGTTGTTTTGTTTGG
A1-21 19 TTTGTGGCGGGGTTTGCTTGGTTTTGTGGTGG
A1-22 20 GGGGTGGGTGGGTGTGTGTTTGGTTGGTTTG
A1-30 21 GGGTTGGTTTGGGGGGGGCTGTTTTG
A1-28 22 GGGTGGGTTGGTTGGTGGTTGTTTTTGTG
[0045] 表2 B群嗜水气单胞菌适体
[0046] 用DNAMAN软件对所测得的22条序列进行二级结构分析，根据结构可将其分为三类：
[0047] 第一类：5′端的固定序列区碱基与3′端的第6个碱基起形成茎环结构，中间随机区形成茎环结构，3′端的5个固定碱基形成一个小的口袋结构（图3）。这种结构的适体有A1-3、A1-5、A1-7、A1-13、A1-14、A1-20、A1-22共七条；
[0048] 第二类：5′端的第3个至21个碱基形成茎环结构，3′端固定序列区碱基与中间随机区碱基形成茎环并凸起，然后再由5′端、3′端固定序列区碱基和中间随机区形成一个口袋结构（图4），这种结构的适体有A1-1、A1-4、A1-12、A1-15、A1-17、A1-18、A1-21、A1-27、A1-28、A1-29、A1-30 、A1-31 共十二条；
[0049] 第三类：5′端、3′端固定序列区部分碱基分别与随机区形成茎环结构，然后由5′端、3′端固定序列区碱基和中间随机区再形成一个大的口袋结构（图5）。这种结构的适体有A1-8、A1-10、A1-26三条。
[0050] 申请人人工合成的ssDNA文库全长78bp,中间35bp为随机核苷酸，由于每个位点有A、G、C、T四种可能，这样的话中间35个序列就有435个可能组合，即其库容量达到了1016之多，虽然实际实验中可能只到1014 左右，但这也满足了筛选目的寡核苷酸的需要（8、李卫滨，兰小鹏，杨湘越，等．SELEX技术在筛选环孢霉素A适体中的运用[J]．福州总医院学报 , 2007,(03)：171-173）。在前两轮筛选的过程中，申请人添加的文库量比较多，这样的目的是尽可能的获得比较多的与嗜水气单胞菌特异性结合的适体。但随着筛选轮数的增加，次级文库的量就要相应的减少，这是因为文库的浓度越来越大的缘故。为了增加适体的特异性，申请人相应增加了洗脱次数，同时文库与菌液结合的时间也相从前几轮的30min减少到后来的20min。PCR条件的优化对适体的筛选也十分重要，每一轮筛选，申请人都要先做一个梯度PCR，在得到最适退火温度的前提下再做PCR扩增，这样有效的避免了非特异性扩增等问题。
[0051] 申请人实验用的是链霉亲和素磁珠来富集次级文库，它操作简单、不需要离心，只要在磁场的作用下即可达到分离的效果，同时它得到的次级文库比较稳定，纯度更高，不易出现不对称PCR中的非特异性扩增的问题。通过12轮筛选、克隆测序得到的22条适体中，有13条适体与预期长度一直一致。
[0052] 利用DNAMAN软件对其二级结构分析，从结果中可以看出，这些序列的二级结构都是由茎环和口袋（勺状）结构组成，这说明了茎环和口袋结构可能是适体与嗜水气单胞菌结合的结构基础，茎可能起着稳定结构的作用，环可能是其结合部位。有些二级结构中含有勺状的口袋，这些口袋也可能起着同环一样的作用，即可能是与受体结合的结合部位。在这些茎结构中，其碱基主要是G-C为主，由于G-C的结构能大于A-T，这一点也说明茎可能起着稳定作用。
[0053] 本发明初步建立了SELEX法筛选嗜水气单胞菌适体的方法，同时获得了具有特异性的嗜水气单胞菌的适体，并对适体群的二级结构初步进行了研究，得到其二级结构的一些结构组成，这为以后研究嗜水气单胞菌的分子结构打下了一定的基础，同时也为嗜水气单胞菌的检测提供了一种新的方法。