基于20个多重插入缺失遗传标记的法医学复合检测试剂盒

摘要

本发明属于法医遗传学领域，具体涉及基于20个多重插入缺失遗传标记的法医学复合检测试剂盒。本发明要解决的技术问题是实现利用多重插入缺失遗传标记对人类生物学检材进行法医学亲缘关系鉴定和个人识别。本发明的技术方案是基于20个多重插入缺失遗传标记的法医学复合检测试剂盒，包括分离包装的复合扩增引物混合物、等位基因分型标准物混合物；所述复合扩增引物混合物，包含了20个多重插入缺失遗传标记的共计41条扩增引物；所述的等位基因分型标准物混合物由20个多重插入缺失遗传标记的等位基因分型标准物构成，包括63个荧光素标记DNA片段。本发明试剂盒为法医学上的亲权鉴定及个人识别提供了一种新的技术手段。

权利要求

1.基于20个多重插入缺失遗传标记的法医学复合检测试剂盒，其特征在于：包括分离包装的复合扩增引物混合物、等位基因分型标准物混合物；所述复合扩增引物混合物，包含了20个多重插入缺失遗传标记的共计41条扩增引物；所述的等位基因分型标准物混合物由20个多重插入缺失遗传标记的等位基因分型标准物构成，包括63个荧光素标记DNA片段，对应20个多重插入缺失遗传标记的所有已知63个等位基因；

所述的41条扩增引物的核苷酸序列如下所示：

表1 41条扩增引物核苷酸序列

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述等位基因分型标准物的核苷酸序列如下所示：表2 等位基因分型标准物

。

说明书

基于20个多重插入缺失遗传标记的法医学复合检测试剂

盒

技术领域

[0001] 本发明属于法医遗传学应用领域，具体涉及基于20个多重插入缺失遗传标记的法医学复合检测试剂盒。

背景技术

[0002] 法医遗传学通过对生物性检材进行DNA遗传标记的检测来实现亲子鉴定和个人识别。插入缺失多态性遗传标记(insertion/delection polymorphism，Indels)是由人类基因组单点突变产生，即基因组中特定碱基位置一定数量的核苷酸插入或缺失，造成DNA片段长度变化形成的多态性遗传标记。它在人类基因组中分布广泛，其分布密度仅次于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)。Indels和SNPs同属二等位基因多态性遗传标记，并且同样具有遗传稳定、突变率低、扩增片段小的特点，在帮助解决法医学亲子鉴定及个体识别中的突变疑难案例及腐败疑难检材的检测方面具有独特的优势。另一方面，插入缺失多态性遗传标记与短串联重复序列（short tandem repeats，STRs)一样，为DNA长度多态性，可采用与其相同的检测技术，因此与目前法医实验室通用的荧光标记检测技术完全共平台，易于在法医实验室中推广应用。由于插入缺失多态性遗传标记在法医物证学中有独特优势，因而成为该领域的研究热点，目前国外已有二个商业化试剂盒DIPplex kit30和38-Indel multiplex assay得以开发运用，它们分别能检测30和38个插入缺失多态性遗传标记。

[0003] 然而，由于Indels和SNPs一样，是二等位基因，在识别力上存在局限性。二等位基因遗传标记的信息量与具有多等位基因的STR遗传标记差距较大，至少需要50-60个单基因座才能达到13-15个常用STR的累计个人识别率和非父排除率。而大量二等位基因遗传标记的复合扩增，不仅增加了检测成本，且大大增加了复合检测和数据分析的难度。并且二等位基因无法提示混合样本中多个来源个体的存在，无法用于混合样本的分析。

[0004] 人类基因组中存在少数紧密相邻的Indel标记，若能将这些含有两个以上紧密相邻的Indel基因座人为地设计为一个多重插入缺失遗传标记，这种遗传标记将可能具有两个以上的等位基因，从而成为独特的多等位基因Indel遗传标记，其个体识别力及非父排除率能相应得以提高。由于多重插入缺失扩增产物中等位基因数量增加，则可以用相对少数的遗传标记获得较高的效能，达到效能提高而成本降低的目的。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是克服单个Indel二等位基因遗传标记识别力不足的缺点，筛选由多个紧密相邻的二等位基因Indel多态性构成的具有多个等位基因的多重插入缺失遗传标记，运用这种相对较少的新遗传标记建立一个高效能的检测体系，为法医疑难亲缘关系鉴定和个人识别提供一种新工具。

[0006] 本发明的技术方案是提供一种基于20个多重插入缺失遗传标记的法医学复合检测试剂盒，包括分离包装的复合扩增引物混合物、等位基因分型标准物混合物；所述复合扩增引物混合物，包含了20个多重插入缺失遗传标记的共计41条扩增引物；所述的等位基因分型标准物混合物由20个多重插入缺失遗传标记的等位基因分型标准物构成，包括63个荧光素标记DNA片段，对应20个多重插入缺失遗传标记的所有已知63个等位基因。

[0007] 进一步的，所述的41条扩增引物的核苷酸序列如表3所示：

[0008] 表3 41条扩增引物核苷酸序列

[0009]

[0010]

[0011] 进一步的，所述等位基因分型标准物的核苷酸序列如表4所示：

[0012] 表4等位基因分型标准物

[0013]

[0014]

[0015]

[0016]

[0017]

[0018]

[0019]

[0020] 如表3所示，在本发明中，每个多重插入缺失遗传标记包含2～3个紧密相邻的Indel基因座，即多个紧密相邻的Indel基因座被视为一个遗传标记，并根据其在染色体上的位置而命名。本发明试剂盒中的总共20个多重插入缺失遗传标记包含了共计43个二等位基因Indel基因座。先前的Indel研究，一个Indel基因座运用一对引物进行扩增检测，43个Indel基因座即需要86条引物。而本发明把2～3个相邻的Indel基因座设计在同一个扩增产物中，作为一个遗传标记，即可利用一对引物实现对2～3个Indel基因座的检测。此外，在遗传标记D4q22.1，因其下游引物3’端结合区有个SNP点突变，本发明创新地针对该点突变的两个不同等位基因设计了二条分别互补的下游引物，以确保扩增产物的平衡，这样，该遗传标记即具有3条扩增引物。因此，本发明试剂盒中包含的20个多重插入缺失遗传标记，仅运用41条扩增引物即实现了对43个Indel基因座的检测，大大降低了复合扩增的难度和检测的成本。

[0021] 如前所述，每个Indel基因座只有二个等位基因。而由多个Indel基因座构成的多重插入缺失遗传标记其等位基因数量增加到了3～4个，成为多等位基因Indel遗传标记，大大增加了单个遗传标记的识别力及其他相关信息量。在上表2中，试剂盒包含的20个多重插入缺失遗传标记中，17个遗传标记具有三等位基因，3个遗传标记具有四等位基因，因而20个遗传标记总共具有63个等位基因。表中每条序列前面的数字表示对应等位基因的命名，0是最小的等位基因，1表示比命名为0的等位基因大一个bp的等位基因，3表示比命名为0的等位基因大三个bp的等位基因，以此类推。

[0022] 本发明试剂盒还包括扩增反应混合液和分子量内标。其中扩增混合液包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、DNA聚合酶。

[0023] 本发明的有益效果：本发明筛选到20个多重插入缺失遗传标记，与通常的单个Indel基因座二等位基因不同，这些新遗传标记均具有三个以上等位基因，其中17个遗传标记有三个等位基因，3个遗传标记为四等位基因，突破了单个Indel基因座二等位基因的局限，只需采用相对较少的遗传标记既可达到较高的识别力。该20个多重插入缺失遗传标记，经连锁分析，各遗传标记之间不存在连锁不平衡，从而使系统各遗传标记之间具有独立效能，各法医学指标可以累积相乘。经过群体调查实验证明本试剂盒复合检测体系累积个人识别率达到0.999999999998，累积非父排除率为0.9989。由于本试剂盒检测的20个多重插入缺失遗传标记，每个标记均具有三个以上等位基因，所以可用于混合样本的检测；其扩增产物长度为83～170bp，对法医学降解检材的检测具有优势。本发明所采用的检测技术，利用法医遗传实验室通用的毛细管电泳平台，能实现一次性快速、准确地获得生物检材的20个多重插入缺失遗传标记的分型，确定检材的基因分型，且易于在法医学实验室推广应用。基于以上几点，本发明试剂盒降低了成本、节省人力、运用相对较少的多重插入缺失遗传标记，达到较高的识别力，为法医学上的亲权鉴定、个人识别及腐败检材的检测提供了一种新的技术手段，在法医学领域具有良好的应用前景。

附图说明

[0024] 图1为本发明对编号95F生物检材的毛细管电泳检测结果。图中的横坐标数值为扩增片段长度，其中图中峰上方是遗传标记的命名，峰下方的阿拉伯数字为对应遗传标记等位基因的命名。纵坐标数值表示荧光信号强度，从图中可以观察到该检材的所有20个多重插入缺失遗传标记的分型结果，证明本发明多重插入缺失复合检测试剂盒可以一次性对实现生物学样本总共20个多重插入缺失遗传标记的检测。

[0025] 以下结合附图通过具体实施方式对本发明进行详细说明。

具体实施方式

[0026] 本发明中基于20个多重插入缺失遗传标记的法医学复合检测试剂盒是通过从NCBI数据库筛选出理想的多重插入缺失遗传标记，然后运用复合扩增技术获得样本在这些遗传标记的等位基因，并利用毛细管电泳技术检测所得到的等位基因片段，最终建立20个多重插入缺失遗传标记复合扩增体系。

[0027] 本发明基于多重插入缺失遗传标记的法医学复合检测试剂盒是经NCBI数据库筛选得到预期的遗传标记。筛选标准为：1)多重插入缺失遗传标记中包含的单个Indel基因座其最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)＞0.1；2)在内含子内；3)多重插入缺失遗传标记内的二个Indel基因座之间的最大物理距离＜100bp；4)同一遗传标记内最小等位基因与最大等位基因片段差＜20bp；5)同一条染色体每个多重插入缺失遗传标记之间的物理距离＞5Mb。

[0028] 根据建立的上述标准本发明共筛选出20个理想的多重插入缺失遗传标记，并建立复合检测体系。所涉及的20个多重插入缺失遗传标记信息如表5。

[0029] 表5 20个多重插入缺失遗传标记信息

[0030]

[0031] 该试剂盒的工作原理是运用提取到的个体DNA与20个多重插入缺失遗传标记的引物混合物及扩增反应混合液，在单管内同时获得个体所有20个多重插入缺失遗传标记的扩增产物，最后进行毛细管电泳，并利用等位基因分型标准物混合物分析待测样本的扩增产物，确定个体的分型结果。

[0032] 本发明试剂盒在对上述筛选到的多重插入缺失遗传标记的检测中运用了复合扩增技术。复合扩增技术可以在一个反应体系中一次性的扩增多个目的DNA片段，具有方便、快捷、节约样本和成本的优点，适应法医学鉴定的实际需要。设计引物时，考虑了以下因素：1)相同颜色荧光标记的相邻多重插入缺失遗传标记之间扩增片段长度应有差异，这样可将不同的扩增片段有效分离(在本试剂盒中，相同荧光标记的相邻二个遗传标记之间，其等位基因之间的距离＞4bp)；2)扩增产物片段短（80～170bp），利于降解检材的检测；3）引物长度适宜，在18～26bp之间；4）退火温度接近，均为60±1℃。设计出的所有20个多重插入缺失遗传标记复合扩增引物序列参见表6。

[0033] 表6 41条扩增引物核苷酸序列

[0034]

[0035]

[0036] 本发明试剂盒中引入等位基因分型标准物混合物是为了准确地分析样本基因型，本发明中提供的等位基因分型标准物包括了所有20个多重插入缺失遗传标记的等位基因分型标准物，共有63个荧光素标记DNA片段，对应20个多重插入缺失遗传标记的所有已知63个等位基因，见表7。

[0037] 表7等位基因分型标准物

[0038]

[0039]

[0040]

[0041]

[0042]

[0043]

[0044]

[0045] 在上表中，每条序列前面的数字表示各多重插入缺失遗传标记等位基因命名，0是对应该遗传标记中最小等位基因，1表示比命名为0的等位基因大一个bp的等位基因,3表示比命名为0等位基因大三个bp的等位基因，以此类推。

[0046] 本发明试剂盒的最终扩增产物检测运用毛细管电泳技术。毛细管电泳已在法医遗传学实验室广泛应用，各扩增片段能够运用荧光标记毛细管电泳技术有效分离，因此本发明建立的基于多重插入缺失遗传标记的法医学复合检测试剂盒可以直接应用于设有毛细管电泳技术的生物实验室，具有普适性，易于推广应用。

[0047] 本发明试剂盒具体包括的组分可为：

[0048] 扩增反应混合液：包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、DNA聚合酶。

[0049] 扩增反应混合液可以根据本领域常用的配方或按分子生物学手册进行配制，也可直接使用商业化的产品，直接购自生物公司。

[0050] 引物混合液，其具体信息见表3。

[0051] 等位基因分型标准物混合物：由表4所述的63个荧光素标记DNA片段组成，对应20个多重插入缺失遗传标记的所有已知63个等位基因。

[0052] 分子量内标：LIS500，Golden eye20A，购自北京基点公司。

[0053] 利用本发明所述试剂盒，可以对生物学检材进行分析。具体分析方法包括以下步骤；

[0054] 1)提取待检测样本的DNA，作为扩增模板；

[0055] 2)利用上述扩引物混合物和扩增反应混合液对步骤1提取的DNA进行单管内复合扩增；所述复合扩增PCR的反应的循环参数为：95℃，10min；94℃，30sec，60℃，40sec，72℃，45sec，29循环；然后60℃45min。

[0056] 3）扩增产物、等位基因分型标准物混合物分别与分子量内标、Hi-Di甲酰胺混合后进行毛细管电泳分析，根据电泳结果获得样本的基因型。

[0057] 以下用具体实例进一步具体说明本发明，所使用的主要试剂和仪器如下：

[0058] 1)自动激光荧光毛细管电泳3130遗传分析仪，ABI公司

[0059] 2)9700PCR扩增仪，ABI公司

[0060] 3)台式高速离心机EPPENDORF公司

[0061] 4)紫外分光光度计岛津公司

[0062] 5)移液器EPPENDORF公司

[0063] 6)Hi-Di甲酰胺ABI公司

[0064] 7)分子量内标(Golden eye20A,LIS-500)北京基点公司

[0065] 实施例一本发明试剂盒的制备

[0066] 用于检测的多重插入缺失遗传标记复合检测试剂盒包括分别包装的以下试剂：

[0067] a)扩增引物混合物：由表1所示的扩增引物混合得到，上海生工合成，将合成好的41条扩增引物用1×TE配制为100uM/μL备用，然后按照表8中的比例混合，制成复合扩增引物混合物；

[0068] b)扩增反应混合液2×Taq PCR Master mix（Bs9293）购自上海生工；

[0069] c)等位基因分型标准物混合物：由按表4所示的63条荧光标记DNA片段组成，四色（蓝色、绿色、黑色、和红色）荧光分别为FAM、HEX、TAMRA、和ROX。

[0070] 将上述试剂分别按各自常规要求包装后即制得多重插入缺失遗传标记复合检测试剂盒，用于后继的实验。

[0071] 表8复合扩增引物的浓度

[0072]

[0073]

[0074] 实施例二使用本发明试剂盒检测149个汉族无关个体检材

[0075] 使用上述基于多重插入缺失遗传标记的法医学复合检测试剂盒，进行了149个汉族无关个体检材的检测。具体的检测过程按如下进行：

[0076] a、用Chelex-100法从149个汉族无关个体血样中提取基因组DNA，作为复合扩增模板；

[0077] b、以步骤a中的DNA模板，利用复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液将样本在下述扩增体系中进行复合PCR扩增。

[0078]

[0079] 扩增的热循环参：95℃10min；94℃30sec，60.5℃40sec，72℃50sec（29个循环）；60℃45min。

[0080] c、毛细管电泳

[0081] 扩增产物和等位基因分型标准物混合物均取1μL，分别加入9μL的Hi-Di甲酰胺和0.5μL LIS500分子量内标混匀，95℃下变性3min，迅速冷却，用美国ABI公司的遗传分析仪3130进行电泳检测。

[0082] 电泳 条件：1500V 电压，36cm毛细 管，POP4凝胶，电泳20min；应 用Data Collection3.0软件收集数据，Genemappe V3.2软件进行结果分析。

[0083] 由于检测了149个样本，以95F编号样本为例，参见图1。图1表示可以清晰地分辨该样本各遗传标记的等位基因。

[0084] 所检测的149个无关个体中，共检测到63个不同的扩增片段，说明该20个多重插入缺失试剂盒中共有63个等位基因，远超过等量单Indel基因座的40个等位基因，节约成本同时大大提高了系统效能，其累积个人识别率达到0.9999999999994，累积非父排除率为0.9989。本发明试剂盒能为法医学疑难亲子鉴定和个体识别提供有力的支持。图1为一个个体的典型检测图谱。