蜂斗菜酚化合物在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用

摘要

本发明属于医药和食品技术领域，提供了式（1）所示的从毛裂蜂斗菜中提取的天然化合物蜂斗菜酚在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用，其显示出显著的抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素细胞黑色素生成的作用，用于防止果蔬褐变、防治原发性和继发性皮肤色素沉着性皮肤病以及用于皮肤美白。

权利要求

1.式(1)所示的蜂斗菜酚化合物作为酪氨酸酶抑制剂在制备用于预防或治疗色素沉着性皮肤病的药物中的应用，

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述色素沉着性皮肤病为所有原发性和继发性色素沉着性皮肤疾病。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药物用于抑制黑色素生成。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其中，所述蜂斗菜酚化合物单独使用或者与其它药学上可接受的药用辅料、药用载体或美白剂混合使用。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述药用载体选自软膏基质、乳化剂、表面活性剂和稳定剂。

6.式(1)所示的蜂斗菜酚化合物作为酪氨酸酶抑制剂在制备用于抑制黑色素生成的化妆品或用于预防褐变的食品添加剂中的应用，

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述蜂斗菜酚化合物单独使用或者与其它化妆品或食品可接受的辅料、载体或美白剂混合使用。

说明书

蜂斗菜酚化合物在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药和食品技术领域，具体涉及蜂斗菜酚（Petasiphenol）化合物的新用途，更具体而言，本发明涉及蜂斗菜酚化合物在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。

背景技术

[0002] 酪氨酸酶（Tyrosinase）是由二价铜离子与酶蛋白结合的金属酶，是生物体合成黑色素的关键酶，可催化含酚基化合物（如酪氨酸、多巴等）氧化成多巴醌，经一系列中间反应后形成黑色素，而黑色素的合成、分布与哺乳动物皮肤、毛发的色素沉积直接相关，与果蔬褐变也有着重要的关系。

[0003] 因此，通过筛选酪氨酸酶抑制剂，抑制酪氨酸酶的活性来控制黑色素的合成，已成为防止果蔬褐变，治疗色素沉着性皮肤病（包括原发性和继发性色素沉着性皮肤疾病，如黄褐斑、雀斑、炎症后色素沉着等），以及美白化妆品研制的重要途径。

[0004] 由于天然植物资源来源广泛、安全性高。近年来，从天然产物中开发酪氨酸酶抑制剂正成为研究热点。已有报道从多种植物中分离得到效果显著的酚类酪氨酸酶抑制剂。

[0005] 在酚类化合物中寻找其他抑制酪氨酸酶活性的化合物，可为防止果蔬褐变，治疗色素沉着性皮肤病（黄褐斑、雀斑、炎症后色素沉着等）药物的开发，以及美白化妆品研制提供多种途径。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供蜂斗菜酚化合物的新用途。

[0007] 蜂斗菜酚的结构式见式（1）：

[0008]

[0009] 本发明提供了式（1）所示的蜂斗菜酚化合物在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。

[0010] 本发明提供了式（1）所示的蜂斗菜酚化合物在制备作为酪氨酸酶抑制剂的药物中的应用。

[0011] 具体地，所述药物用于预防或治疗色素沉着性皮肤病，包括所有原发性和继发性色素沉着性皮肤疾病，如黄褐斑、雀斑、炎症后皮肤色素沉着等。

[0012] 所述药物用于抑制黑色素生成。

[0013] 在上述用途中，所述蜂斗菜酚化合物单独使用或者与其它药学上可接受的药用辅料、药用载体或美白剂混合使用，其中，所述美白剂可以采用但不限于下列成分：熊果苷、曲酸衍生物、L-抗坏血酸及其衍生物及它们的盐、氢醌及其衍生物及它们的盐、植物提取物如甘草提取物、芦荟提取物等。所述美白剂可任意选择1种或2种以上成分掺入。

[0014] 所述的药用载体选自软膏基质、乳化剂、表面活性剂和稳定剂。

[0015] 本发明提供了式（1）所示的蜂斗菜酚化合物在制备作为酪氨酸酶抑制剂的化妆品或食品添加剂中的应用。

[0016] 具体地，所述化妆品用于抑制黑色素生成；所述食品添加剂用于预防褐变。

[0017] 优选地，所述蜂斗菜酚化合物单独使用或者与其它化妆品或食品可接受的辅料、载体或美白剂混合使用，其中，所述美白剂可以采用但不限于下列成分：熊果苷、曲酸衍生物、L-抗坏血酸及其衍生物及它们的盐、氢醌及其衍生物及它们的盐、植物提取物如甘草提取物、芦荟提取物等。所述美白剂可任意选择1种或2种以上成分掺入。

[0018] 式（1）所示的蜂斗菜酚化合物具有显著的抑制酪氨酸酶活性的作用，其IC50值为0.18±0.05μM，强于阳性药曲酸，并在细胞水平可有效抑制黑色素的生成，可用于预防食物褐变、用于制备抗色素增加性皮肤病药物，以及美白化妆品。

附图说明

[0019] 图1为蜂斗菜酚的提取和初步分离流程图；

[0020] 图2为乙酸乙酯部位的分离流程图；

[0021] 图3为蜂斗菜酚HPLC纯度检测结果和紫外吸收特征；

[0022] 图4为蜂斗菜酚1H NMR图谱；

[0023] 图5为蜂斗菜酚及曲酸对蘑菇来源的酪氨酸酶抑制的剂量依赖曲线；

[0024] 图6为蜂斗菜酚对B16细胞的活力影响曲线；

[0025] 图7为蜂斗菜酚对B16细胞胞内酪氨酸酶的活性影响的柱状图；以及

[0026] 图8为蜂斗菜酚对B16细胞黑色素合成影响的柱状图。

具体实施方式

[0027] 制备实施例1本发明蜂斗菜酚化合物的制备

[0028] 1材料与仪器

[0029] 1.1药材

[0030] 毛裂蜂斗菜：2009年10月采自重庆石柱，由上海中医药大学中药研究所吴立宏副研究员鉴定为菊科蜂斗菜属植物毛裂蜂斗菜（Petasites tricholobus Franch）。

[0031] 1.2试剂

[0032] 柱层析硅胶（200-300目，青岛海洋硅胶干燥剂厂），薄层层析硅胶GF254（青岛海洋硅胶干燥剂厂），MCI层析填料（日本，GEL CHP20P，75-100μ），Sephadex LH-20层析填料（瑞典，GE Healthcare），95%乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇等试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

[0033] 1.3仪器

[0034] 旋转蒸发仪：EYELA Rotary evaporator N1001，东京理化。

[0035] 电子天平：AL104型，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

[0036] 暗箱紫外透射仪：ZF-90，上海顾村电光仪器厂。

[0037] ESI-MS：Finnigan LCQ-DECA型质谱仪测定

[0038] 1H NMR：Varian INOVA400型核磁共振仪测定，TMS为内标。

[0039] 高效液相色谱仪（HPLC）：Agilent 1200高效液相系统，DAD检测器。

[0040] 2化学成分的提取分离

[0041] 2.1化学成分的提取

[0042] 取毛裂蜂斗菜干燥全草6.5kg，粉碎后加入10倍量95%乙醇浸泡1h，70℃水浴上回流提取3次，每次1.5h，过滤后提取液于50℃经减压浓缩回收溶剂，所得流浸膏经50℃减压干燥，得干浸膏320g。

[0043] 2.2提取分离流程图

[0044] 2.2.1提取和初步分离流程见图1。

[0045] 2.2.2乙酸乙酯部位的分离流程见图2。

[0046] 3化合物的结构鉴定

[0047] 3.1化合物的纯度检查

[0048] 3.1.1薄层色谱法检查化合物的纯度

[0049] 蜂斗菜酚化合物经薄层色谱法检查为一个斑点，结果见表1。

[0050] 表1蜂斗菜酚化合物的薄层色谱检查

[0051]

[0052] 3.1.2HPLC法检查化合物的纯度

[0053] 仪器：Agilent 1200高效液相系统，DAD检测器。

[0054] 试剂：乙腈，超纯水

[0055] 色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18250×4.6mm 5μm，流速1ml/min，柱温25℃，洗脱条件：乙腈-水（30%），检测波长320nm。

[0056] 化合物蜂斗菜酚经HPLC法检查，其纯度大于95%（面积%），紫外吸收图谱及HPLC分析结果见图3。

[0057] 3.2蜂斗菜酚的物理常数和波谱数据

[0058] 蜂斗菜酚：淡黄色无定形粉末（甲醇）；负离子ESI-MS m/z：343[M-H]-,687[2M-H]-，分子量为344，分子式为C18H16O7；λmax为290nm，325nm，。

[0059] 1H-NMR(CD3OD,300MHz)δ：7.58(1H,d,J=15.9Hz,H-β),7.05(1H,d,J=1.8Hz,H-2),6.96(1H,dd,J=8.1,1.8Hz,H-6),6.77(1H,d,J=8.1Hz,H-5),6.72(1H,d,J=8.1Hz,H-5”),6.68(1H,d,J=2.1Hz,H-2”),6.56(1H,d,J=8.1,2.1Hz,H-6”),6.31(1H,d,J=15.9Hz,H-α),4.85(2H,s,H-1’),3.63(2H,s,H-3’)。以上数据与文献（Ryozo I,Kohji F,Ritsuo N,et al.Isolation and Synthesis of a New Bio-antimutagen,Petasiphenol,from Scapes ofPetasites japonicum[J].Biosci.Biotech.Biochem.,1992,56(11)：1773-1775）报道的蜂斗菜酚数据一致，核磁图谱见图4。结构式如下：

[0060]

[0061] 试验实施例1蜂斗菜酚化合物蘑菇来源的酪氨酸酶活性测试

[0062] 1.1实验方法

[0063] 在96孔板中，加入100μL磷酸盐缓冲盐溶液PBS稀释的不同浓度的蜂斗菜酚溶液（DMSO终浓度1%）和50μL酪氨酸酶稀释液（5μg/mL，PBS稀释），酶与化合物孵育10min后，加入50μL底物左旋多巴（4mM，PBS稀释）溶液启动反应，37℃下反应20min，用酶标仪（Multiskan MK3,Thermo,美国）测492nm处的吸光度（OD492）。

[0064] 根据OD492计算化合物不同浓度下对酪氨酸酶的抑制率(%)，IC50为酶活性被抑制50%时化合物的浓度。抑制率(%)根据下式计算：

[0065] 抑制率(%)=[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100

[0066] 上式中，A表示反应20分钟后空白孔在492nm下的吸光度；B表示反应前空白孔在492nm下的吸光度；C表示反应20分钟后样品孔在492nm下的吸光度；D表示反应前样品孔在492nm下的吸光度。

[0067] 1.2实验结果

[0068] 表2对蘑菇来源酪氨酸酶的抑制活性

[0069]

[0070] 1.3实验结论

[0071] 从表2及图5可以看出，蜂斗菜酚具有较强的抑制蘑菇来源的酪氨酸酶的活性，IC50比曲酸(Kojic acid)强约80倍。

[0072] 试验实施例2蜂斗菜酚化合物对B16细胞（C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞）活力的影响测试

[0073] 2.1实验方法：

[0074] 采用MTT法：B16细胞接种于96孔板中，2×103个/孔，100μL/孔，设置四复孔,调零孔加入等体积的培养液（含10%胚胎牛血清FBS的高糖DMEM）。24h后加入不同浓度（0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、5μM、10μM、30μM、100μM）的蜂斗菜酚（培养液配制），对照孔加入等浓度的DMSO(0.1%)溶液（培养液配制）。给药72小时后弃培养基，加入100μL MTT溶液（0.5mg/mL，DMEM配制），4h后弃去上清液，加入100μLDMSO，振荡5min使结晶完全溶解，用酶标仪（Flexstation3,Molecular Devices,美国）测490nm处吸光度（OD490）。细胞存活率(%)计算公式如下：

[0075] 细胞存活率(%)=(C-B)×100/(A-B)

[0076] 上式中A表示对照孔的OD490，B表示调零孔的OD490，C表示加药孔的OD490。

[0077] 2.2实验结果：

[0078] 结果如图6所示，曲线反映B16细胞的活力随蜂斗菜酚浓度的变化。

[0079] 2.3实验结论：

[0080] 从图6中可以看出，蜂斗菜酚在大于等于10μM时对B16细胞有毒性（10μM时细胞存活率72%），小于等于5μM时无毒性。

[0081] 试验实施例3蜂斗菜酚化合物对B16细胞胞内酪氨酸酶活性的影响测试

[0082] 3.1实验方法：

[0083] B16细胞接种于96孔板，2×103个/孔，用含10%胚胎牛血清FBS的高糖DMEM培养。24h后加入不同浓度（0.3μM、0.6μM、1.2μM、2.5μM、5μM）的蜂斗菜酚溶液（200μM的IBMX溶液配制）。72小时后弃培养基，加入100μL含底物左旋多巴2mM、TritonX-1001%的PBS溶液，37℃反应90min后用酶标仪Multiskan MK3测OD492。

[0084] 3.2实验结果：

[0085] 结果如图7，对照组（蜂斗菜酚浓度为0）的酶活性为100%，*表示与对照组相比p<0.05。

[0086] 3.3实验结论：

[0087] 从图7中可以看出，在无毒性的浓度范围内，蜂斗菜酚呈剂量依赖性地抑制B16细胞胞内酪氨酸酶的活性。

[0088] 试验实施例4蜂斗菜酚化合物对B16细胞黑色素生成的影响测试

[0089] 4.1实验方法：

[0090] B16细胞接种于24孔板，2×104个/孔，1mL/孔，用含10%胚胎牛血清FBS的高糖DMEM培养。24h后加入含3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX，200μM）的培养基1mL/孔，同时加入不同浓度（1.25μM、2.5μM、5μM）的蜂斗菜酚溶液。作用72h后，弃培养基，PBS洗两次，每孔加入100μL NaOH（1M）溶液，70℃水浴15min，吸取溶液至96孔板中，用酶标仪MultiskanMK3测OD492。

[0091] 4.2实验结果：

[0092] 结果如图8所示，对照组（蜂斗菜酚浓度为0）的黑色素生成量为100%，[0093] *表示与对照组相比p<0.05。

[0094] 4.3实验结论

[0095] 从图8中可以看出，与对照组相比，蜂斗菜酚1.25μM开始显著降低B16细胞产生黑色素的量，同时从图6可以看出，蜂斗菜酚在有效浓度范围内对细胞活力没有影响。

[0096] 总之，蜂斗菜酚能在体外酶活水平及细胞水平抑制酪氨酸酶的活性，进而能有效降低B16细胞合成黑色素的量，因此蜂斗菜酚作为酪氨酸酶抑制剂能够用于预防食物褐色变性、用于制备抗色素增加性皮肤病药物以及用于制备美白化妆品。