磁性纳米多孔复合骨组织工程支架材料及其制备方法

摘要

本发明涉及生物医学复合材料，具体涉及一种磁性纳米多孔复合骨组织工程支架材料及其制备方法，该支架材料是由纳米羟基磷灰石、聚乳酸和磁性粒子复合而成的支架材料。本发明利用低温快速成型技术将Nano-HA、PLLA和磁性纳米粒子Fe2O3复合制备三维多孔的Nano-HA/PLLA/Fe2O3人工骨，该三维多孔的磁性纳米人工骨支架材料综合了Nano-HA、PLLA和Fe2O3三者的优点，使其在良好骨传导性和生物相容性的基础上，提高柔韧性和生物降解性，改善生物力学性能，更加有利于骨细胞的粘附生长和血管化，必将极大地提高骨缺损处移植人工骨的愈合速度及效果，是一种理想的新型纳米复合人工骨材料。

权利要求

1.磁性纳米多孔复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征是，由纳米羟基磷灰石、聚乳酸和磁性粒子复合而成,纳米羟基磷灰石、聚乳酸和磁性粒子的质量比为纳米羟基磷灰石：聚乳酸：磁性粒子＝3：20：3,所述磁性粒子为Fe2O3,制备方法包括以下步骤：(1)将PLLA溶解于有机溶剂里，60℃水浴中搅拌形成PLLA/有机溶剂的均相溶液；将所述质量比的Nano-HA和Fe2O3加入上述溶液中，超声波震荡各15min、电磁搅拌至Nano-HA和Fe2O3完全分散均匀制得凝胶；

(2)将凝胶转入低温冷冻快速成型仪中-4℃条件下进行低温快速成型,通过RIPF工艺成形具有一定间隔的平行的冰线，将配制好的生物材料填入冰线间的间隔，将填了生物材料后的表面刮平，使得冰线和生物材料交替排列；在正交方向成形下一层冰线，重复以上步骤；

(3)成形后，将冰和生物材料构成的实体拿到冷藏室，冰融化后再将产品置于真空冷冻干燥机去除有机溶剂；风干后即得多孔纳米复合骨组织工程支架材料。

2.根据权利要求1所述多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征是，所述步骤(1)中有机溶剂是1,4-二氧六环。

3.根据权利要求1或者2所述多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征是，所述Nano-HA通过如下方法制得：将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成，合成过程中，加入氨水调整溶液的pH值为

8～13，添加分散剂，搅拌使其沉淀完全，然后经洗涤、过滤，将沉淀物在80～120℃干燥，再在600～800℃温度下烧结2～3小时，得到Nano-HA粉末。

4.根据权利要求1或者2所述多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征是，所述PLLA通过如下方法制得：①丙交酯的制备：取乳酸与ZnO粉末，逐渐升温使乳酸脱水变为丙交酯；然后升温抽真空蒸出淡黄色丙交酯单体，再以乙酸乙酯为溶剂反复洗涤、重结晶提纯，抽滤，真空干燥，得纯净丙交酯单体；

②PLLA的合成：纯净丙交酯单体，加入辛酸亚锡引发剂，常温下真空干燥一定时间后，在硅油浴中浸泡3～5min，密封反应瓶，升温至单体刚熔化时反复摇动反应瓶至混合均匀，聚合完成后取出反应瓶；

③PLLA的纯化：粗制PLLA中加入二氯甲烷使其完全溶解，过滤，滤液中加入甲醇至沉淀完全，再过滤，甲醇洗涤，真空干燥，得到白色纯PLLA。

说明书

磁性纳米多孔复合骨组织工程支架材料及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学复合材料，具体涉及一种磁性纳米多孔复合骨组织工程支架材料及其制备方法。

背景技术

[0002] 骨组织工程的研究和发展为临床上骨缺损的修复和治疗提供了崭新的思路，并逐渐引起研究者的兴趣。其中，三维多孔支架材料是骨组织工程的重要基础，它不仅起支撑作用，保持原有组织的形状，而且还起到模板作用，为细胞提供赖以寄宿、生长、分化和增殖的场所，从而引导受损组织的再生和控制再生组织的结构。但目前骨组织工程支架的研究和应用仍面临着许多问题，如材料体内降解不可控，细胞繁殖效率低，降解产物引起炎性反应，细胞去分化等。尤其是在力学性能方面，单一的使用聚合物或陶瓷材料作为支架材料存在强度弱或脆性大的问题，都无法满足承力骨修复的要求。

[0003] 羟基磷灰石(Hydroxy-apatite,简称HA）是最常见的一种生物活性材料，它具有与人体骨组织相似的无机成分，是目前公认的具有较好生物相容性和骨传导性的生物活性陶瓷材料。但HA人工骨仍存在着力学性能差、不能承重、缺乏骨诱导活性、骨渗入深度有限、不能完全降解等较多缺点。目前已有纳米羟基磷灰石（Nano-HA）应用于临床骨缺损的修复。但因骨骼本身是一种具有很高韧性和硬度的天然纳米复合材料，它主要由纳米级的片状羟基磷灰石结晶分散在骨胶原骨架中组成，而骨胶原和羟基磷灰石本身都不能作为结构材料，因此以Nano-HA作为单一成分的人工骨仍然不能满足理想人工骨的要求。

[0004] 聚乳酸(Polylactic acid,简称PLLA)是目前组织工程研究和应用最为广泛的一类材料，这类材料无毒，无抗原性，具有良好的可降解吸收性、生物安全性和力学强度，可以通过控制成份含量来调节材料的降解速度，使产品性质的重复性和力学性能达到较高水平。除了作为手术缝合线和药物缓释载体外，PLLA也用作医疗缝合补强材料、骨折内固定材料和组织工程材料。

[0005] 随着生物工程和生物医学的发展,经常需要一些功能性材料。如单分散、微米级、功能性高分子粒子,磁性纳米粒子具有比表面积大、吸附性强、凝集作用大以及表面具有反应能力等特异性质而得到了广泛的应用。而且能在外加磁场中很方便地与介质分离，可作为分离材料和载体，用于细胞分离、固定化酶、免疫分析、靶向药物等方面。

发明内容

[0006] 本发明的目的是为了解决目前骨组织工程支架存在的缺陷，满足支架的性能要求，将Nano-HA、PLLA和Fe2O3复合制备三维多孔的Nano-HA/PLLA/Fe2O3人工骨，提供一种磁性纳米多孔复合骨组织工程支架材料及其制备方法。

[0007] 本发明的方案为：

[0008] 磁性纳米多孔复合骨组织工程支架材料，所述支架材料是由纳米羟基磷灰石、聚乳酸和磁性粒子复合而成的支架材料。

[0009] 优选地，所述纳米羟基磷灰石、聚乳酸和磁性粒子的质量比为纳米羟基磷灰石：聚乳酸：磁性粒子＝1～5：20：1～5。

[0010] 优选地，所述纳米羟基磷灰石、聚乳酸和磁性粒子的质量比为纳米羟基磷灰石：聚乳酸：磁性粒子＝3：20：3。

[0011] 优选地，所述磁性粒子为Fe2O3。

[0012] 本发明还提供所述磁性纳米多孔复合骨组织工程支架材料的制备方法，该方法包括以下步骤：

[0013] 将Nano-HA、Fe2O3和PLLA材料在50～70℃下混合，超声波震荡，然后电磁搅拌至Nano-HA和Fe2O3完全分散均匀得到凝胶；然后将凝胶转入-5～-3℃下进行低温成型并填入生物材料即得多孔纳米复合骨组织工程支架材料。

[0014] 优选地，包括以下步骤：

[0015] （1）将PLLA溶解于有机溶剂里，60℃水浴中搅拌形成PLLA/有机溶剂的均相溶液；将不同质量比的Nano-HA和Fe2O3加入上述溶液中，超声波震荡各15min、电磁搅拌至Nano-HA和Fe2O3完全分散均匀制得凝胶；

[0016] （2）将凝胶转入低温冷冻快速成型仪中-4℃条件下进行低温快速成型,通过RIPF工艺成形具有一定间隔的平行的冰线，将配制好的生物材料填入冰线间的间隔，将填了生物材料后的表面刮平，使得冰线和生物材料交替排列；在正交方向成形下一层冰线，重复以上步骤；

[0017] （3）成形后，将冰和生物材料构成的实体拿到冷藏室，冰融化后再将产品置于真空冷冻干燥机去除有机溶剂；风干后即得多孔纳米复合骨组织工程支架材料。

[0018] 优选地，所述步骤（1）中有机溶剂是1,4-二氧六环。

[0019] 优选地，所述Nano-HA通过如下方法制得：

[0020] 将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成，合成过程中，加入氨水调整溶液的pH值为8～13，添加分散剂，搅拌使其沉淀完全，然后经洗涤、过滤，将沉淀物在80～120℃干燥，再在600～800℃温度下烧结2～3小时，得到Nano-HA粉末。

[0021] 优选地，所述PLLA通过如下方法制得：

[0022] ①丙交酯的制备：取乳酸与ZnO粉末，逐渐升温使乳酸脱水变为丙交酯；然后升温抽真空蒸出淡黄色丙交酯单体，再以乙酸乙酯为溶剂反复洗涤、重结晶提纯，抽滤，真空干燥，得纯净丙交酯单体；

[0023] ②PLLA的合成：纯净丙交酯单体，加入辛酸亚锡引发剂，常温下真空干燥一定时间后，在硅油浴中浸泡3～5min，密封反应瓶，升温至单体刚熔化时反复摇动反应瓶至混合均匀，聚合完成后取出反应瓶；

[0024] ③PLLA的纯化：粗制PLLA中加入二氯甲烷使其完全溶解，过滤，滤液中加入甲醇至沉淀完全，再过滤，甲醇洗涤，真空干燥，得到白色纯PLLA。

[0025] 本发明利用低温快速成型技术将Nano-HA、PLLA和磁性纳米粒子Fe2O3复合制备三维多孔的Nano-HA/PLLA/Fe2O3人工骨，该三维多孔的磁性纳米人工骨支架材料综合了Nano-HA、PLLA和Fe2O3三者的优点，使其在良好骨传导性和生物相容性的基础上，提高柔韧性和生物降解性，改善生物力学性能，更加有利于骨细胞的粘附生长和血管化，必将极大地提高骨缺损处移植人工骨的愈合速度及效果，是一种理想的新型纳米复合人工骨材料。

[0026] 本发明采用磁性粒子做为复合材料，磁性纳米粒子Fe2O3具有磁响应性及超顺磁性，可以在恒定磁场下聚集和定位、在交变磁场下吸收电磁波产热。由于磁性纳米粒子具有和细胞表面结合的能力，这就使在外加磁场的条件下控制和调节细胞的功能成为可能。磁性纳米粒子以平均每个细胞20pg的浓度聚集在间充质干细胞内，在外加磁场的作用下，磁性纳米粒子可显著促进骨髓间充质干细胞的增殖。而且人间充质干细胞在磁性纳米粒子和外加磁场的作用下具有分化为成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞的能力，磁性纳米粒子和磁场联合作用能够促进骨修复。

具体实施方式

[0027] 以下提供本发明优选的具体实施方式，以助于进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不仅限于这些实施例。

[0028] 本实施例磁性纳米多孔复合骨组织工程支架材料的制备方法技术方案如下：

[0029] 1.采用溶胶-絮凝法合成Nano-HA。

[0030] 2.采用开环聚合法合成PLLA。

[0031] 3.采用低温快速成型技术合成磁性纳米多孔复合支架材料。

[0032] 上述制备方法中，所述Nano-HA的合成方法如下：

[0033] 将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成，合成过程中，加入氨水调整溶液的pH值为8～13，添加分散剂，搅拌使其沉淀完全，然后经洗涤、过滤，将沉淀物在80～120℃干燥，在600～800℃温度下烧结2～3小时，得到粉末粒径小于100nm、与人体骨组织成份相似的Nano-HA粉末。

[0034] 上述制备方法中，所述PLLA的合成方法如下：

[0035] ①丙交酯的制备：取乳酸与ZnO粉末，逐渐升温使乳酸脱水变为丙交酯；然后升温抽真空蒸出淡黄色丙交酯单体，再以乙酸乙酯为溶剂反复洗涤、重结晶提纯，抽滤，真空干燥，得无色片状纯丙交酯晶体。

[0036] ②PLLA的合成：纯净丙交酯单体，加入辛酸亚锡引发剂，常温下真空干燥，然后在硅油浴中浸泡3-5min，密封反应瓶，升温至单体刚熔化时反复摇动反应瓶至混合均匀，然后记时聚合完成后取出反应瓶。

[0037] ③PLLA的纯化：粗制PLLA中加入二氯甲烷使其完全溶解，过滤，滤液中加入甲醇至沉淀完全，再过滤，甲醇洗涤，真空干燥，得到白色纯PLLA。

[0038] ④PLLA分子量的测定：称取一定量的PLLA溶解于三氯甲烷中，用乌氏粘度法测定，计算相对粘均分子质量。

[0039] 上述制备方法中，所述磁性纳米多孔复合支架材料的合成方法如下：

[0040] 将不同质量比例的Nano-HA、块状PLLA材料以及磁性纳米粒子Fe2O3共2g，使Nano-HA和Fe2O3在复合材料中的比例分别为(10％、20％、30％、40％、50%)，采用低温快速成型技术制作成立方体状多孔支架材料(25mm×25mm×25mm)。具体步骤如下：

[0041] ①将PLLA溶解于有机溶剂(1,4-二氧六环)，并于60℃水浴中搅拌配制PLLA/1,4-二氧六环均相溶液；将不同质量比的Nano-HA和Fe2O3加入上述溶液中，超声波震荡各15min、电磁搅拌12小时后至Nano-HA和Fe2O3完全分散均匀制得凝胶。

[0042] ②成型后的凝胶转入低温冷冻快速成型仪中-4℃条件下进行低温快速成型,通过RIPF工艺成形具有一定间隔的平行的冰线，将配制好的生物材料填入冰线间的间隔，将填了生物材料后的表面刮平，使得冰线和生物材料交替排列。在正交方向成形下一层冰线，重复以上步骤。

[0043] ③成形后，将冰和生物材料构成的实体拿到冷藏室，冰融化剩下的空间即为骨组织支架所需的纵横交错、彼此连通的大孔。

[0044] ④得到的样品置于真空冷冻干燥机去除有机溶剂；风干2天后取出样品，有机溶剂升华后支架材料留下了大量更为微细的孔洞，表面喷金后经电镜扫描，并测量孔隙率。

[0045] 本发明所述制备的磁性纳米多孔复合支架材料是通过低温快速成型技术制备的一种新型的复合人工骨支架材料，经对其进一步的生物力学测试，生物降解性能测试，生物相容性研究得出一种最佳比例的新型人工骨支架材料。

[0046] 1、磁性纳米多孔（Nano-HA/PLLA/Fe2O3）复合人工骨的生物力学测试，采用三点抗弯法在生物力学测试机上测定各个比例的磁性纳米多孔（Nano-HA/PLLA/Fe2O3）复合人工骨材料的弹性模量

[0047] 表1磁性纳米多孔（Nano-HA/PLLA/Fe2O3）复合人工骨力学性能比较(n=8， )[0048]

[0049] 2、磁性纳米多孔（Nano-HA/PLLA/Fe2O3）复合人工骨的扫描电镜观，各个比例的磁性纳米多孔（Nano-HA/PLLA/Fe2O3）复合人工骨的扫描电镜结果（5000×）：多孔网状结构，孔内壁粗糙,孔间以微孔相通。

[0050] 3、磁性纳米多孔（Nano-HA/PLLA/Fe2O3）复合人工骨的细胞相容性[0051] 3.1细胞增殖度测定

[0052] 将兔骨髓间充质干细胞（rBMSCs）与磁性纳米多孔（Nano-HA/PLLA/Fe2O3）复合人工骨材料浸提液共培养，测定rBMSCs的增殖能力。结果提示Nano-HA/PLLA/Fe2O3复合人工骨材料浸提液对rBMSCs细胞增殖无明显影响。

[0053] 表2各组细胞培养不同时间点吸光度值、相对增殖度及毒性分级(n=6)[0054]

[0055] 3.2细胞形态及生长状况