产人参皂苷元的重组酿酒酵母及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了产人参皂苷元的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。本发明所提供的一株能同时产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇等三种人参皂苷元的重组酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7725。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1能同时生产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇等三种人参皂苷元，产量分别达21.4mg/L发酵液，17.2mg/L发酵液和15.9mg/L发酵液，占总人参皂苷元比例分别为39.3%，31.5%和29.2%。

权利要求

1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其菌株号为GY-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7725。

2.构建产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌的方法，包括向重组酿酒酵母菌BY-βA中导入GgbAS表达盒,AtCPR1表达盒和MtOAS表达盒得到产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌BY-OA的步骤；所述GgbAS是由SEQ ID No.2的第8-2305位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述AtCPR1是由SEQ ID No.1的核苷酸序列编码的蛋白质；所述MtOAS是由SEQ ID No.3的第8-1447位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述重组酿酒酵母菌BY-βA为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7726。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括向所述重组酿酒酵母菌BY-OA中导入所述GgbAS表达盒,所述AtCPR1表达盒和所述MtOAS表达盒得到产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌BY-2OA的步骤。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述方法中，向所述重组酿酒酵母菌BY-βA的Trp1位点导入所述GgbAS表达盒,所述AtCPR1表达盒和所述MtOAS表达盒；向所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点导入所述GgbAS表达盒,所述AtCPR1表达盒和所述MtOAS表达盒。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述GgbAS表达盒由所述GgbAS的编码基因，启动所述GgbAS的编码基因转录的启动子PPGK1和终止所述GgbAS编码基因转录的终止子TADH1组成；所述启动子PPGK1为酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因的启动子，所述终止子TADH1为酿酒酵母乙醇脱氢酶基因I的终止子；

所述AtCPR1表达盒由所述AtCPR1的编码基因，启动所述AtCPR1的编码基因转录的启动子PTDH3和终止所述AtCPR1的编码基因转录的终止子TTPI1组成；所述启动子PTDH3为酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶3基因的启动子，所述终止子TTPI1为酿酒酵母磷酸丙糖异构酶基因的终止子；

所述MtOAS表达盒由所述MtOAS的编码基因、启动所述MtOAS的编码基因转录的启动子PTEF1、终止所述MtOAS的编码基因转录的终止子TCYC1组成；所述启动子PTEF1为酿酒酵母翻译延伸因子1基因的启动子，所述终止子TCYC1为酿酒酵母细胞色素C1基因的终止子。

6.由权利要求2-5中任一所述的方法构建的产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌。

7.构建产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌的方法，包括向权利要求2-5中任一所述的重组酿酒酵母菌BY-OA中导入SynPgPPDS表达盒、SynPgPPTS表达盒、AtCPR1表达盒和PgDDS表达盒得到产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌；所述SynPgPPDS是由SEQ ID No.4的第8-1468位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述SynPgPPTS是由SEQ ID No.5的第8-1417位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述AtCPR1是由SEQ ID No.1的核苷酸序列编码的蛋白质；所述PgDDS是由SEQ ID No.6的第825-3134位编码的蛋白质。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：向所述重组酿酒酵母菌BY-OA的 His3位点导入所述SynPgPPDS表达盒、所述SynPgPPTS表达盒、所述AtCPR1表达盒和所述PgDDS表达盒。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述SynPgPPDS表达盒由所述SynPgPPDS的编码基因、启动所述SynPgPPDS的编码基因转录的启动子PTEF1、终止所述SynPgPPDS的编码基因转录的终止子TCYC1组成；所述启动子PTEF1为酿酒酵母翻译延伸因子

1基因的启动子，所述终止子TCYC1为酿酒酵母细胞色素C1基因的终止子；

所述SynPgPPTS表达盒由所述SynPgPPTS的编码基因，启动所述SynPgPPTS的编码基因转录的启动子PFBA1和终止所述SynPgPPTS的编码基因转录的终止子TTDH2组成；所述启动子PFBA1为酿酒酵母果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因的启动子，所述终止子TTDH2为酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶2基因的终止子；

所述AtCPR1表达盒由所述AtCPR1的编码基因，启动所述AtCPR1的编码基因转录的启动子PTDH3和终止所述AtCPR1的编码基因转录的终止子TTPI1组成；所述启动子PTDH3为酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶3基因的启动子，所述终止子TTPI1为酿酒酵母磷酸丙糖异构酶基因的终止子；

所述PgDDS表达盒由所述PgDDS的编码基因，启动所述PgDDS的编码基因转录的启动子PPGK1和终止所述PgDDS的编码基因转录的终止子TADH1组成；所述启动子PPGK1为酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因的启动子，所述终止子TADH1为酿酒酵母乙醇脱氢酶基因I的终止子。

10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌为权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

11.由权利要求7-9中任一所述的方法构建的产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌。

12.权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在生产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇中的应用，或在生产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇这三种物质中两种或一种物质中的应用。

13.权利要求11所述的产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌在生产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇中的应用，或在生产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇这三种物质中两种或一种物质中的应用。

14.权利要求6所述的产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌在生产齐墩果酸和/或β-香树脂中的应用。

说明书

产人参皂苷元的重组酿酒酵母及其构建方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及产人参皂苷元的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。

背景技术

[0002] 人参皂苷（Ginsenoside）是五加科（Araliaceae）植物人参（Panax ginseng）和西洋参（Panax quinquefolium）的主要活性成分。迄今为止已经发现的人参皂苷约有40余种，它们具有相似的基本结构，都含有由30个碳原子排列成四个环的甾烷类固醇核。依糖苷基架构的不同，人参皂苷分为人参二醇型，人参三醇型和齐墩果酸型三种，如下：

[0003] 人参二醇型，包含种类最多的人参皂苷，如人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2及糖苷基PD；

[0004] 人参三醇型，包含人参皂苷Re、Rg1、Rg2、Rh1及糖苷基PT；

[0005] 齐墩果烷型，包含人参皂苷R0。

[0006] 1）达玛二烯（dammarenediol-II）为人参二醇型和人参三醇型人参皂苷生物合成的共同前体。

[0007] 原人参二醇（protopanaxadiol）为人参二醇型人参皂苷的苷元，其本身具有抗癌、抗抑郁、激活氯离子通道和抑制钠离子通道去极化的作用、抑制人胚肾HEK-293细胞和幽门螺旋杆菌生长等多种药理活性。原人参二醇的糖基化产物：人参二醇型人参皂苷类化合物，如人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg3等在心脑血管，抗肿瘤等方面也有很好的药理活性，这类化合物的相关产品已在临床广泛使用。

[0008] 原人参三醇（protopanaxatriol）为人参三醇型人参皂苷的苷元，其糖基化产物形成了系列药理作用显著的人参皂苷。

[0009] 2）β-香树脂（β-amyrin）为齐墩型药用三萜酸化合物生物合成的共同前体，这类物质包括齐墩果酸（oleanolic acid），及其他药用植物来源的甘草酸（glycyrrhizin），山楂酸（maslinic acid）等重要化合物。其中齐墩果酸具有抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗氧化应激及促进肝糖原合成和肝细胞再生作用等药理活性，齐墩果酸片等药品已在临床广泛应用于肝脏保护。在人参中为人参皂苷R0的苷元。

[0010] 人参皂苷类化合物的主要来源是通过中药材人参中直接提取，然而作为人参皂苷的主要来源，人参、西洋参需要4-15年的生长栽培阶段，生产上由于连作障碍和病虫害的困扰，其品质及其生长环境受到严重限制。人参皂苷类化合物产量已经远不能满足社会的需求，严重影响了人参的临床应用和人参皂苷类制药原料中间体的开发和应用，亟待需要提供新的资源途径。

发明内容

[0011] 本发明所要解决的技术问题是提供产人参皂苷元的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。

[0012] 本发明所提供的一株能同时产齐墩果酸（OA），原人参二醇（PPD）和原人参三醇（PPT）等三种人参皂苷元的重组酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7725。

[0013] 本发明所提供的一株产β-香树脂的重组酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7726。

[0014] 本发明还提供了构建产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌的方法。

[0015] 本发明所提供的构建产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌的方法，包括向重组酿酒酵母菌BY-βA中导入GgbAS表达盒,AtCPR1表达盒和MtOAS表达盒得到产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌BY-OA的步骤；所述GgbAS是由SEQ ID No.2的第8-2305位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述AtCPR1是由SEQ ID No.1的核苷酸序列编码的蛋白质；所述MtOAS是由SEQ ID No.3的第8-1447位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述重组酿酒酵母菌BY-βA为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7726。

[0016] 上述构建产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌的方法中，所述方法还包括向所述重组酿酒酵母菌BY-OA中导入所述GgbAS表达盒,所述AtCPR1表达盒和所述MtOAS表达盒得到产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌BY-2OA的步骤。

[0017] 上述构建产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌的方法中，向所述重组酿酒酵母菌BY-βA的Trp1位点导入所述GgbAS表达盒,所述AtCPR1表达盒和所述MtOAS表达盒；向所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点导入所述GgbAS表达盒,所述AtCPR1表达盒和所述MtOAS表达盒。

[0018] 上述构建产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌的方法中，所述GgbAS表达盒由所述GgbAS的编码基因，启动所述GgbAS的编码基因转录的启动子PPGK1和终止所述GgbAS编码基因转录的终止子TADH1组成；所述启动子PPGK1为酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子，所述终止子TADH1为酿酒酵母乙醇脱氢酶基因I(ADH1)终止子；

[0019] 所述AtCPR1表达盒由所述AtCPR1的编码基因，启动所述AtCPR1的编码基因转录的启动子PTDH3和终止所述AtCPR1的编码基因转录的终止子TTPI1组成；所述启动子PTDH3为酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶3基因（TDH3）的启动子，所述终止子TTPI1为酿酒酵母磷酸丙糖异构酶基因（TPI1）的终止子；

[0020] 所述MtOAS表达盒由所述MtOAS的编码基因、启动所述MtOAS的编码基因转录的启动子PTEF1、终止所述MtOAS的编码基因转录的终止子TCYC1组成；所述启动子PTEF1为酿酒酵母翻译延伸因子1基因（TEF1）的启动子，所述终止子TCYC1为酿酒酵母细胞色素C1基因（CYC1）的终止子。

[0021] 在本发明的一个实施方式中，所述GgbAS表达盒（PPGK1-GgbAS-TADH1）中，启动子PPGK1的功能序列（具有启动子功能的序列）为SEQ ID No.6的第63-812位，GgbAS基因的编码序列为SEQ ID No.2的第8-2305位，终止子TADH1的功能序列（具有终止子功能的序列）为SEQ ID No.6的第3143-3300位；所述AtCPR1表达盒（PTDH3-AtCPR1-TTPI1）中，启动子PTDH3的功能序列为SEQ ID No.10，终止子TTPI1的功能序列为SEQ ID No.11，AtCPR1基因的编码序列为SEQ ID No.1；所述MtOAS表达盒（PTEF1-MtOAS-TCYC1）中，启动子PTEF1的功能序列为SEQ ID No.8，终止子TCYC1的功能序列为SEQ ID No.9，MtOAS基因的编码序列为SEQ ID No.3的第8-1447位。

[0022] 在本发明的一个实施方式中，向所述重组酿酒酵母菌BY-βA的Trp1位点导入所述GgbAS表达盒,所述AtCPR1表达盒和所述MtOAS表达盒是通过同源重组实现的，所述GgbAS表达盒,所述AtCPR1表达盒和所述MtOAS表达盒通过Trp1位点上游同源片段M1和Trp1位点下游同源片段M5导入所述重组酿酒酵母菌BY-βA的Trp1位点；所述Trp1位点上游同源片段M1的核苷酸序列是SEQ ID No.7的第1429-1861位，所述Trp1位点下游同源片段M5的核苷酸序列是SEQ ID No.12的第1-455位。

[0023] 在本发明的一个实施方式中，向所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点导入所述GgbAS表达盒,所述AtCPR1表达盒和所述MtOAS表达盒是通过同源重组实现的，所述GgbAS表达盒,所述AtCPR1表达盒和所述MtOAS表达盒通过His3位点上游同源片段M1和His3位点下游同源片段M5导入所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点；所述His3位点上游同源片段M1的核苷酸序列是SEQ ID No.14的第1059-1507位，所述His3位点下游同源片段M5的核苷酸序列是SEQ ID No.15的第1-463位。

[0024] 由上述构建产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌的方法构建的产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌也属于本发明的保护范围。

[0025] 本发明还提供了构建产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌的方法。

[0026] 本发明所提供的构建产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌的方法，包括向上述重组酿酒酵母菌BY-OA中导入SynPgPPDS表达盒、SynPgPPTS表达盒、AtCPR1表达盒和PgDDS表达盒得到产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌；所述SynPgPPDS是由SEQ ID No.4的第8-1468位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述SynPgPPTS是由SEQ ID No.5的第8-1417位的核苷酸序列编码的蛋白质；所述AtCPR1是由SEQ ID No.1的核苷酸序列编码的蛋白质；所述PgDDS是由SEQ ID No.6的第825-3134位编码的蛋白质。

[0027] 上述构建产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌的方法中，向所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点导入所述SynPgPPDS表达盒、所述SynPgPPTS表达盒、所述AtCPR1表达盒和所述PgDDS表达盒。

[0028] 所述SynPgPPDS表达盒由所述SynPgPPDS的编码基因、启动所述SynPgPPDS的编码基因转录的启动子PTEF1、终止所述SynPgPPDS的编码基因转录的终止子TCYC1组成；所述启动子PTEF1为酿酒酵母翻译延伸因子1基因（TEF1）的启动子，所述终止子TCYC1为酿酒酵母细胞色素C1基因的（CYC1）的终止子；

[0029] 所述SynPgPPTS表达盒由所述SynPgPPTS的编码基因，启动所述SynPgPPTS的编码基因转录的启动子PFBA1和终止所述SynPgPPTS的编码基因转录的终止子TTDH2组成；所述启动子PFBA1为酿酒酵母果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因（FBA1）的启动子，所述终止子TTDH2为酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶2基因（TDH2）的终止子；

[0030] 所述AtCPR1表达盒由所述AtCPR1的编码基因，启动所述AtCPR1的编码基因转录的启动子PTDH3和终止所述AtCPR1的编码基因转录的终止子TTPI1组成；所述启动子PTDH3为酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶3基因（TDH3）的启动子，所述终止子TTPI1为酿酒酵母磷酸丙糖异构酶基因（TPI1）的终止子；

[0031] 所述PgDDS表达盒由所述PgDDS的编码基因，启动所述PgDDS的编码基因转录的启动子PPGK1和终止所述PgDDS的编码基因转录的终止子TADH1组成；所述启动子PPGK1为酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子，所述终止子TADH1为酿酒酵母乙醇脱氢酶基因I(ADH1)终止子TADH1。

[0032] 在本发明的一个实施方式中，所述SynPgPPDS表达盒（PTEF1-SynPgPPDS-TCYC1）中，启动子PTEF1的功能序列为SEQ ID No.8，终止子TCYC1的功能序列为SEQ ID No.9，SynPgPPDS基因的编码序列为SEQ ID No.4的第8-1468位；所述SynPgPPTS表达盒（PFBA1-SynPgPPTS-TTDH2）中，启动子PFBA1的功能序列为SEQ ID No.16，终止子TTDH2的功能序列为SEQ ID No.13，SynPgPPTS基因的编码序列为SEQ ID No.5的第8-1417位；所述AtCPR1表达盒（PTDH3-AtCPR1-TTPI1）中，启动子PTDH3的功能序列为SEQ ID No.10，终止子TTPI1的功能序列为SEQ ID No.11，AtCPR1基因的编码序列为SEQ ID No.1；所述PgDDS表达盒（PPGK1-PgDDS-TADH1）的核苷酸序列如SEQ ID No.6，其中，第63-812位为启动子PPGK1的功能序列，第825-3134位为PgDDS基因的编码序列，第3143-3300位终止子TADH1的功能序列。

[0033] 在本发明的一个实施方式中，向所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点导入所述SynPgPPDS表达盒、所述SynPgPPTS表达盒、所述AtCPR1表达盒和所述PgDDS表达盒通过同源重组实现的，所述SynPgPPDS表达盒、所述SynPgPPTS表达盒、所述AtCPR1表达盒和所述PgDDS表达盒通过所述His3位点上游同源片段M1和所述His3位点下游同源片段M5导入所述重组酿酒酵母菌BY-OA的His3位点。

[0034] 上述产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌具体可为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7725。

[0035] 由上述构建产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌方法构建的产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌也属于本发明的保护范围。

[0036] 上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1、或上述方法构建的产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的重组酿酒酵母菌在生产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇中的应用，或在生产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇这三种物质中两种或一种物质中的应用也属于本发明的保护范围。

[0037] 上述产齐墩果酸和β-香树脂的重组酿酒酵母菌在生产齐墩果酸和/或β-香树脂中的应用，以及上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA在生产β-香树脂中的应用也属于本发明的保护范围。

[0038] 本发明中所述表达盒均指能够在宿主细胞（酿酒酵母细胞）中表达目的蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止所述目的基因转录的终止子。

[0039] 上文中，AtCPR1为拟南芥烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶，GgbAS为β-香树脂合酶，MtOAS为齐墩果酸合酶，SynPgPPDS为原人参二醇合成酶，SynPgPPTS为原人参三醇合成酶，PgDDS为来源于人参的达玛二烯合酶。

[0040] 实验证明，本发明方法构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1能同时生产齐墩果酸（OA），原人参二醇（PPD）和原人参三醇（PPT）等三种人参皂苷元，产量分别达21.4mg/L发酵液，17.2mg/L发酵液和15.9mg/L发酵液，占总人参皂苷元比例分别为39.3%,31.5%和29.2%。本发明方法构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-2OA的β-香树脂含量达141.7mg/L发酵液（11.8mg/g细胞干重），齐墩果酸含量达203.4mg/L发酵液（17.0mg/g细胞干重）。本发明方法构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA的β-香树脂含量达61.4mg/L发酵液（5.1mg/g细胞干重），齐墩果酸含量达72.0mg/L发酵液（6.0mg/g细胞干重）。本发明方法构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA的β-香树脂含量达57.5mg/L发酵液（5.0mg/g细胞干重）。

[0041] 保藏说明

[0042] 1、菌种名称：酿酒酵母

[0043] 拉丁名：Saccharomyces cerevisiae

[0044] 菌株编号：GY-1

[0045] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

[0046] 保藏机构简称：CGMCC

[0047] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

[0048] 保藏日期：2013年6月18日

[0049] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7725

[0050] 2、菌种名称：酿酒酵母

[0051] 拉丁名：Saccharomyces cerevisiae

[0052] 菌株编号：BY-βA

[0053] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

[0054] 保藏机构简称：CGMCC

[0055] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

[0056] 保藏日期：2013年6月18日

[0057] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7726

附图说明

[0058] 图1为β-香树脂GC-MS分析。

[0059] A、B和C的横坐标为保留时间（分钟），D横坐标为M/Z，纵坐标为丰度。

[0060] 图2为齐墩果酸LC-MS分析。

[0061] A、B和C的横坐标为保留时间（分钟），纵坐标为丰度。

[0062] 图3为原人参二醇LC-MS分析。

[0063] A、B和C的横坐标为保留时间（分钟），纵坐标为丰度。

[0064] 图4为原人参三醇LC-MS分析。

[0065] A、B和C的横坐标为保留时间（分钟），纵坐标为丰度。

[0066] 图5人参皂苷元在酿酒酵母中的含量。

[0067] PPT（原人参三醇）；OA(齐墩果酸）；PPD（原人参二醇）。

具体实施方式

[0068] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0069] 实施例1：质粒构建

[0070] 一、基因元件的克隆分为以下三步：

[0071] （1）酵母基因组DNA提取

[0072] 提取酿酒酵母BY4742(Saccharomyces cerevisiae BY4742，记载在Carrie baker brachmann et al.,1998,YEAST,14:115–132，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。）的基因组DNA。

[0073] （2）拟南芥cDNA的获得

[0074] 提取拟南芥（col-0生态型，记载在Athanasios Theologis et al.,2000，Nature408：816-820，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得）的总RNA，经反转录得到拟南芥cDNA。

[0075] （3）PCR扩增及克隆基因元件

[0076] 以酿酒酵母BY4742(Saccharomyces cerevisiae BY4742，记载在Carrie baker brachmann et al.,1998,YEAST,14:115–132，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。）的基因组DNA为模板，用引物列表1中引物，扩增ERG9、ERG1；以拟南芥（col-0生态型，记载在Athanasios Theologis et al.,2000，Nature 408：816-820，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得）的cDNA为模板扩增AtCPR1基因。

[0077] 表1引物序列

[0078]

[0079] 扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度均用58℃）、72℃延伸均用2分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）。将扩增产物分别克隆到pEASY-Blunt克隆载体（购自北京全式金生物技术有限公司）上。

[0080] 提取阳性克隆质粒进行测序验证，将测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入编码序列是表19的酿酒酵母鲨烯合酶（ERG9）基因的重组载体命名为p-ERG9，将测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入编码序列是表19的酿酒酵母鲨烯环氧酶（ERG1）基因的重组载体命名为p-ERG1，将测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入编码序列是SEQID No.1的拟南芥烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶（AtCPR1）基因的重组载体命名为p-AtCPR1。

[0081] （4）β-香树脂合成酶基因和齐墩果酸合成酶基因合成

[0082] 将SEQ ID No.2的β-香树脂合酶（GgbAS）基因（编码序列为SEQ ID No.2的第8-2305位）插入pUC57（南京金斯瑞生物科技有限公司）的EcoRV位点获得含有GgbAS基因的重组载体p-GgbAS；将SEQ ID No.3的齐墩果酸合酶（MtOAS）基因）（编码序列为SEQ ID No.3的第8-1447位）插入pUC57（南京金斯瑞生物科技有限公司）的EcoRV位点获得含有MtOAS基因的重组载体p-MtOAS。

[0083] （5）原人参二醇合成酶基因和原人参三醇合成酶基因的合成

[0084] 将SEQ ID No.4的原人参二醇合成酶（SynPgPPDS）基因（编码序列为SEQ ID No.4的第8-1468位）插入pUC57（南京金斯瑞生物科技有限公司）的EcoRV位点间获得含有SynPgPPDS基因的重组载体p-SynPgPPDS，将SEQ ID No.5的的原人参三醇合成酶（SynPgPPTS）基因（编码序列是SEQ ID No.5的第8-1417位）插入pUC57（南京金斯瑞生物科技有限公司）的EcoRV位点获得含有SynPgPPTS基因的重组载体p-SynPgPPTS。

[0085] 二、含有基因元件的质粒构建

[0086] （1）pδ-tHMG1质粒的构建

[0087] 以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板，用表2中引物，扩增功能序列为SEQ ID No.6的第63-812位的酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因（PGK1）启动子PPGK1片段、扩增功能序列为SEQ ID No.6的第3143-3300位的酿酒酵母乙醇脱氢酶基因I(ADH1)终止子TADH1片段，扩增表19的酿酒酵母3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（tHMG1）片段。

[0088] 表2引物序列

[0089]

[0090] SexAI酶切PPGK1片段、SexAI和AscI酶切tHMG1基因片段、AscI酶切TADH1片段，割胶纯化三个目的片段，各50ng加入连接体系：2ul 10XT4 ligation Buffer(NEB公司)、1ulT4 ligase(NEB公司，400,000 cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物；取1ul连接产物加入PCR体系：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、加引物Sac11-pGK1和Sac11-Pme-ADHt（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、58℃退火10秒、
72℃延伸均用1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）；得到约2492bp的目标片段PPGK1-tHMG1-TADH1，为tHMG1基因的表达盒，其中PPGK1的功能序列为SEQ ID No.6的第63-812位，tHMG1基因的核苷酸序列如表19，TADH1的功能序列为SEQ ID No.6的第3143-3300位。

[0091] 将约2492bp目标片段PPGK1-tHMG1-TADH1与pEASY-Blunt克隆载体连接，得到含有PPGK1-tHMG1-TADH1的重组载体pM2-tHMG1。

[0092] SacII 分 别 酶 切 质 粒 pM2-tHMG1 和 pδ-UB（Lee FW and Da Silva NA,1997,Biotechnol Prog.13:368-373，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得），将PPGK1-tHMG1-TADH1插入pδ-UB的SacII位点得到含有tHMG1的重组质粒pδ-tHMG1。

[0093] （2）pM2-GgbAS的质粒构建

[0094] SexAI和AscI分别双酶切pM2-tHMG1和质粒p-GgbAS，割胶回收目的片段：pEASY-Blunt-PPGK1-//-TADH1（约4837bp，100ng）和GgbAS（约2298bp，30ng），连接，得到含有GgbAS基因的表达盒PPGK1-GgbAS-TADH1重组载体pM2-GgbAS。GgbAS基因的表达盒PPGK1-GgbAS-TADH1中，PPGK1的功能序列为SEQ ID No.6的第63-812位，GgbAS基因的编码序列为SEQ ID No.2的第8-2305位，TADH1的功能序列为SEQ ID No.6的第3143-3300位。

[0095] （3）pM3-ERG9的质粒构建

[0096] 以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板，用引物列表3中引物，扩增功能序列为SEQ ID No.8的酿酒酵母翻译延伸因子1（TEF1）基因启动子PTEF1片段、扩增功能序列为SEQ ID No.9的酿酒酵母细胞色素C1（CYC1）终止子TCYC1片段。

[0097] 表3引物

[0098]

[0099]

[0100] SexAI酶切PTEF1片段；AscI酶切TCYC1片段；SexAI和AscI酶切质粒p-ERG9；割胶纯化三个目的片段，各50ng加入连接体系：2ul 10XT4 ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4 ligase(NEB公司，400,000 cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，取1ul连接产物加入PCR体系：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、加引物Pac1-TEF1和CYC1t-Pme1（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积
50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），得到约2072bp的ERG9的表达盒PTEF1-ERG9-TCYC1，其中启动子为PTEF1（功能序列为SEQ ID No.8），终止子为TCYC1（功能序列为SEQ ID No.9），ERG9基因的核苷酸序列如表19将约2072bp的ERG9的表达盒PTEF1-ERG9-TCYC1克隆到pEASY-Blunt Simple克隆载体（购自北京全式金生物技术有限公司），得到含有ERG9的表达盒PTEF1-ERG9-TCYC1的重组载体pM3-ERG9。

[0101] （4）pM3-MtOAS的质粒构建

[0102] SexAI和AscI分别双酶切pM3-ERG9和质粒p-MtOAS，割胶回收目的片段：

[0103] pEASY-Blunt-TEF1-//-CYC1t（约4567bp，100ng）和MtOAS（约1440bp，30ng），连接，得到含有MtOAS基因的表达盒PTEF1-MtOAS-TCYC1重组载体，命名为pM3-MtOAS。MtOAS基因的表达盒PTEF1-MtOAS-TCYC1中启动子为PTEF1（功能序列为SEQ ID No.8），终止子为TCYC1（功能序列为SEQ ID No.9），MtOAS基因的编码序列为SEQ ID No.3的第8-1447位。

[0104] （5）pM3-SynPgPPDS的质粒构建

[0105] SexAI和AscI分别双酶切pM3-ERG9和质粒p-SynPgPPDS，割胶回收目的片段：

[0106] pEASY-Blunt-TEF1-//-CYC1t（约4567bp，100ng）和SynPgPPDS（1461bp，30ng），连接，得到含有SynPgPPDS基因的表达盒PTEF1-SynPgPPDS-TCYC1的重组载体pM3-SynPgPPDS。SynPgPPDS基因的表达盒PTEF1-SynPgPPDS-TCYC1中启动子为PTEF1（功能序列为SEQ ID No.8），终止子为TCYC1（功能序列为SEQ ID No.9），SynPgPPDS基因的编码序列为SEQ ID No.4的第8-1468位。

[0107] （6）pM13-LYS2的质粒构建

[0108] 以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板，用引物列表4中引物，扩增功能序列为SEQ ID No.8的酿酒酵母翻译延伸因子1（TEF1）基因启动子PTEF1片段；用引物列表4中引物，扩增核苷酸序列如表19的LYS2基因片段。

[0109] 表4引物

[0110]

[0111]

[0112] PacI和AscI酶切LYS2基因片段,PacI酶切PTEF1片段、AscI酶切步骤（3）的TCYC1片段；割胶纯化三个目的片段，各50ng加入连接体系：2ul 10XT4 ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4 ligase(NEB公司，400,000 cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，取1ul连接产物加入PCR体系：NewEngland Biolabs Phusion5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、加引物X-Only-pTEF1-F和CYC1t-Pme1（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），片段克隆到pEASY-Blunt Simple克隆位点间，得到含有LYS2基因的表达盒PTEF1-LYS2-TCYC1的重组载体pM13-LYS2。LYS2基因的表达盒PTEF1-LYS2-TCYC1中启动子为PTEF1（功能序列为SEQ ID No.8），终止子为TCYC1（功能序列为SEQ ID No.9），LYS2基因的核苷酸序列见表19。

[0113] （7）pM11-AtCPR1的质粒构建

[0114] 以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板，用引物列表5中引物，扩增功能序列为SEQ ID No.10的酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶3（TDH3）基因启动子PTDH3片段、扩增功能序列为SEQ ID No.11的酿酒酵母磷酸丙糖异构酶（TPI1）终止子TTPI1片段。

[0115] 表5引物

[0116]片段名字 引物名字 引物序列（5’→3’）
PTDH3 Pac1-TDH3 GcgttaattaaATACTAGCGTTGAATGTTAGCGTCA
SexA-TDH3 GcgaccwggtTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTC
TTPI1 Asc1-TPI1t GcggcgcgccGATTAATATAATTATATAAAAATAT
Pme-TPI1t GcggtttaaacCTATATAACAGTTGAAATTTGGATA

[0117] SexAI酶切PTDH3片段、AscI酶切TTPI1片段、SexAI和AscI酶切质粒p-AtCPR1；割胶纯化三个目的片段，各50ng加入连接体系：2ul 10XT4 ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4 ligase(NEB公司，400,000 cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，取1ul连接产物加入PCR体系：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、加引物Pac1-TDH3和Pme-TPI1t(10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积
50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），得到约3281bp的AtCPR1表达盒PTDH3-AtCPR1-TTPI1，其中启动子PTDH3的功能序列为SEQ ID No.10，终止子TTPI1的功能序列为SEQ ID No.11，基因AtCPR1的编码序列为SEQ ID No.1；将约3281bp的AtCPR1表达盒PTDH3-AtCPR1-TTPI1克隆到pEASY-Blunt Simple的克隆位点间得到的载体pM11-AtCPR1。

[0118] （8）pM11-ERG1的质粒构建

[0119] 以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板，用引物列表6中引物，扩增功能序列为SEQ ID No.10的酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶3（TDH3）基因启动子PTDH3片段。

[0120] 表6引物

[0121]片段名字 引物名字 引物序列（5’→3’）
PTDH3 X-Only-TDH3-F ATACTAGCGTTGAATGTTAGCGTCA
X-TDH3-Pac1-R GcgttaattaaTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTC

[0122] PacI酶切PTDH3片段、AscI酶切步骤（7）的TTPI1片段、PacI和AscI酶切质粒p-ERG1；割胶纯化三个目的片段，各50ng加入连接体系：2ul10XT4ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4 ligase(NEB公司，400,000 cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，取1ul连接产物加入PCR体系：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer
10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、加引物X-Only-TDH3-F和Pme-TPI1t（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），得到约2693bp的ERG1表达盒PTDH3-ERG1-TTPI1，其中启动子PTDH3的功能序列为SEQ ID No.10，终止子TTPI1的功能序列为SEQ ID No.11，ERG1基因的核苷酸序列见表19。约2693bp的ERG1表达盒PTDH3-ERG1-TTPI1克隆到pEASY-Blunt Simple克隆位点间，得到重组载体pM11-ERG1。

[0123] （9）pM8-SynPgPPTS的质粒构建

[0124] 以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板，用引物列表7中引物,扩增SEQ ID No.16的酿酒酵母果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBA1）基因启动子PFBA1片段、扩增SEQ ID No.13的酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶2（TDH2）基因终止子TTDH2片段。

[0125] 表7引物

[0126]

[0127] SexAI酶切PFBA1、AscI酶切TTDH2、SexAI和AscI酶切质粒p-SynPgPPTS；割胶纯化三个目的片段，各50ng加入连接体系：2ul 10XT4 ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4 ligase(NEB公司，400,000 cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，取1ul连接产物加入PCR体系：NewEngland Biolabs Phusion5Xbuffer10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、加引物Pac-pFBA和tTDH2-Pme1（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积
50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），得到约2633bp的SynPgPPTS基因表达盒PFBA1-SynPgPPTS-TTDH2，其中启动子PFBA1的功能序列为SEQ ID No.16，终止子TTDH2的核苷酸序列为SEQ ID No.13，基因SynPgPPTS的编码序列为SEQ ID No.5的第8-1417位。
将约2633bp的SynPgPPTS基因表达盒PFBA1-SynPgPPTS-TTDH2克隆到pEASY-Blunt simple克隆载体，得到重组载体pM8-SynPgPPTS。

[0128] （10）prDNA-LEU的质粒构建

[0129] prDNA-LEU的构建分两步：

[0130] 第一步：p-rDNA质粒的构建

[0131] 以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板，用引物列表8中引物，扩增rDNA。得到约1264bprDNA（核苷酸序列见表19）片段。将该rDNA片段克隆到pEASY-Blunt克隆载体，得到p-rDNA。

[0132] 表8引物

[0133]

[0134] 第二步：prDNA-LEU质粒的构建

[0135] KpnI酶切p-rDNA，割胶纯化目的片段（约5193bp）。

[0136] 以pRS425质粒（Christianson,T.W.et al.,1992,Gene110:119-122，公众可从天津工业生物技术研究所获得）为模板，用引物列表9中引物，扩增约1808bp LEU2（核苷酸序列见表19）片段。将该LEU2片段与上述约5193bp的p-rDNA的KpnI酶切片段（经Klenow酶补平）用T4连接酶连接，得到重组质粒prDNA-LEU。

[0137] 表9引物

[0138]基因片段名字 引物名字 引物序列（5’→3’）
LEU2 Bsp-Leu-F TGGcgTCCGGATTAAGCAAGGATTTTCTTAACTTCTTC
Bsp-Leu-R TGGcgTCCGGAGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCA

[0139] （11）p-△Trp1的质粒构建

[0140] p-△Trp1的构建分两步：

[0141] 第一步：p-Trp质粒的构建

[0142] 以酿酒酵母BY4742基因组为模板，用引物列表10中引物，扩增1563bp Trp（核苷酸序列见表19）片段。将约1563bp Trp扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体，得到p-Trp。

[0143] 表10引物

[0144]

[0145] 第二步：p-△Trp1的质粒构建

[0146] 以pRS313（Sikorski,R.S.and Hieter,P.1989,Genetics122(1):19-27，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得）质粒为模板，用表11中引物，扩增约1168bp Loxp-HIS3（其中HIS3的核苷酸序列见表19所示）。

[0147] 表11引物

[0148]

[0149] 以p-Trp质粒为模板，用表11中引物，扩增约4816bp的TRP-R。将该TRP-R片段与上述Loxp-HIS3用T4连接酶连接，得到重组质粒p-△Trp1。

[0150] 上述构建的质粒基本信息见表12。

[0151] 表12质粒信息

[0152]质粒名 基本信息
p-△Trp1 Trp1DNA位点,HIS3筛选标记
pδ-tHMG1 包含PPGK1-tHMG1-TADH1表达盒
pM3-ERG9 包含PTEF1-ERG9-TCYC1表达盒
pM13-LYS2 包含PTEF1-LYS2-TCYC1表达盒
pM3-MtOAS 包含PTEF1-MtOAS-TCYC1表达盒
pM11-ERG1 包含PTDH3-ERG1-TTPI1表达盒
pM11-AtCPR1 包含PTDH3-AtCPR1-TTPI1表达盒
pM2-GgbAS 包含PPGK1-GgbAS-TADH1表达盒
pM3-SynPgPPDS 包含PTEF1-SynPgPPDS-TCYC1表达盒
pM8-SynPgPPTS 包含PFBA1-SynPgPPTS-TTDH2表达盒
prDNA-LEU 将rDNA位点和LEU2筛选标记克隆入pEASY-Blunt

[0153] 实施例2、工程菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA的构建

[0154] 一、BY4742-TRP工程菌构建

[0155] 以实施例1的p-△Trp1质粒为模板，用表11中引物，扩增约2056bp的Trp-Loxp-HIS3。

[0156] 酿酒酵母BY4742于YPD中过夜培养，取1ml(OD约0.6-1.0)分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液（10mM LiAc；10mM DTT；0.6M sorbitol；10mM Tris-HCl(pH7.5),处理液使用时才加DTT），25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml 1M sorbitol（0.22um水系膜过膜除菌）重悬，离心，弃上清（用1M sorbitol重悬二次），到最终体积约为90μl，即为BY4742感受态细胞。

[0157] 向BY4742感受态细胞中加入转化用片段：Trp-Loxp-HIS3，在筛选培养基1中培养，得到转化子。

[0158] 筛选培养基1为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His（北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司），2%葡萄糖，0.01%Leu，0.01%Ura，0.01%Trp；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。转化子分别用表10引物进行PCR鉴定，得到1条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为菌株BY4742-TRP-HIS。

[0159] 菌株BY4742-TRP-HIS按照上述方法制备感受态后，转入质粒pSH47（记载在Guldener,U.et al.1996.Nucleic Acids Res.24:2519-2524.），在筛选培养基中2培养，得到转化子1。

[0160] 转化子1在含2%半乳糖YPD诱导培养中诱导培养24小时后，在1g/L的5-FOA的YPD培养基中筛选得到阳性转化子2。

[0161] 阳性转化子2在筛选培养基3和筛选培养基4中均不生长，转化子2分别用表10引物进行PCR鉴定，得到1条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为菌株BY4742-TRP。

[0162] 筛选培养基2为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His（北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司），2%葡萄糖，0.01%Leu，0.01%Trp；

[0163] 筛选培养基3为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His（北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司），2%葡萄糖，0.01%Leu，0.01%Ura，0.01%Trp；

[0164] 筛选培养基4为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His（北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司），2%葡萄糖，0.01%Leu，0.01%Ura，0.005%His。

[0165] 二、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-T1工程菌构建

[0166] 1）δDNA-URA3-up，PPGK1-tHMG1-TADH1t，PTEF1-LYS2-TCYC1和δDNA-down的制备[0167] 用BamHI和XhoI酶切质粒pδ-UB（Lee FW and Da Silva NA,1997,Biotechnol Prog.13:368-373）回收获得约4499bp的M1（δDNA-URA3-up）。

[0168] 分别用表13描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模：M2（PPGK1-tHMG1-TADH1），M3（PTEF1-LYS2-TCYC1），M4（δDNA-down）功能模块。得到如下PCR产物：约2492bp M2（PPGK1-tHMG1-TADH1）、约4916bp M3（PTEF1-LYS2-TCYC1）、约307bp M4（δDNA-down）。

[0169] 表13引物

[0170]

[0171] （2）BY-T1的构建

[0172] 按照上述进行BY-TRP感受态细胞的制备及转化，转入M1，M2，M3和M4共1ug（摩尔比为1:1:1:1）基因模块。筛选培养的培养基为：0.8%酵母选择培养基
SD-Ura-Trp-Leu-HIS，2%葡萄糖，0.005%His，0.01%Leu，0.01%Trp；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。

[0173] 转化子分别用表13引物进行PCR鉴定，得到全部3条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-T1。

[0174] 三、工程菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA的构建

[0175] 1）rDNA-LEU2-up，PPGK1-GgbAS-TADH1，PTDH3-ERG1-TTPI1，PTEF1-ERG9-TCYC1和rDNA-down的制备

[0176] 分别用表14描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模块：M1（rDNA-LEU2-up），M2（PPGK1-GgbAS-TADH1），M3（PTDH3-ERG1-TTPI1），M4（PTEF1-ERG9-TCYC1），M5（rDNA-down）等功能模块。分别得到如下PCR产物：约2384bp M1（rDNA-LEU2-up）、约3206bp M2（PPGK1-GgbAS-TADH1）、约2693bp M3（PTDH3-ERG1-TTPI1）、约2072bp M4（PTEF1-ERG9-TCYC1）和约688bp M5（rDNA-down）。

[0177] 表14引物

[0178]

[0179] （2）工程菌重组酿酒酵母菌BY-βA的构建

[0180] 按照上述方法进行BY-T1感受态细胞的制备及转化，向酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-T1中转入M1，M2，M3，M4和M5共1ug（摩尔比为1:1:1:1:1）基因模块。筛选培养的培养基为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2%葡萄糖，0.005%His.，0.01%Trp.；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。

[0181] 转化子分别用表14引物进行PCR鉴定，得到全部5条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA已于2013年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.7726，下文中均简称酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA。

[0182] 实施例3、工程菌重组酿酒酵母菌BY-OA的构建

[0183] 1）Trp-HIS3-up，PPGK1-GgbAS-TADH1，PTDH3-AtCPR1-TTPI1，PTEF1-MtOAS-TCYC1和Trp-down的制备

[0184] 制备1861bp的SEQ ID No.7所示的DNA片段M1（Trp-HIS3-up），M1中含有SEQ ID No.7的第1429-1861位所示的Trp1位点上游同源片段。制备648bp的SEQ ID No.12所示的DNA片段M5（Trp-down），M5中含有SEQ ID No.12的第1-455位所示的Trp1位点下游同源片段。分别用表15描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模块（DNA片段M2-M4）：约3206bp的M2（PPGK1-GgbAS-TADH1）、约3281bp的M3（PTDH3-AtCPR1-TTPI1）和约2177bp的M4（PTEF1-MtOAS-TCYC1）。M2（PPGK1-GgbAS-TADH1）中含有GgbAS基因的表达盒PPGK1-GgbAS-TADH1，GgbAS基因的表达盒PPGK1-GgbAS-TADH1中，PPGK1的功能序列为SEQ ID No.6的第63-812位，GgbAS基因的编码序列为SEQ ID No.2的第8-2305位，TADH1的功能序列为SEQ ID No.6的第3143-3300位；M3（PTDH3-AtCPR1-TTPI1）含有AtCPR1表达盒PTDH3-AtCPR1-TTPI1，AtCPR1表达盒PTDH3-AtCPR1-TTPI1中，启动子PTDH3的功能序列为SEQ ID No.10，终止子TTPI1的功能序列为SEQ ID No.11，基因AtCPR1的编码序列为SEQ ID No.1；M4（PTEF1-MtOAS-TCYC1）含有MtOAS基因的表达盒PTEF1-MtOAS-TCYC1，MtOAS基因的表达盒PTEF1-MtOAS-TCYC1中，启动子为PTEF1（功能序列为SEQ ID No.8），终止子为TCYC1（功能序列为SEQ ID No.9），MtOAS基因的编码序列为SEQ ID No.3的第8-1447位。

[0185] 表15引物

[0186]

[0187] （2）BY-OA的构建

[0188] 采用和实施例2中相同的方法进行酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA感受态细胞的制备及转化，向实施例2中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA转入M1，M2，M3，M4和M5共1ug（摩尔比为1:1:1:1:1）基因模块。筛选培养的培养基为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2%葡萄糖，0.01%Trp.；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。

[0189] 转化子分别用表15引物进行PCR鉴定，得到全部5条对应的目的片段（约1861bp 的 M1（Trp-HIS3-up）、约 3206bp 的 M2（PPGK1-GgbAS-TADH1）、约 3281bp 的 M3（PTDH3-AtCPR1-TTPI1）、约2177bp的M4（PTEF1-MtOAS-TCYC1）、约648bp的M5（Trp-down））的为正确的阳性克隆，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA。

[0190] 实施例4、工程菌重组酿酒酵母BY-2OA构建

[0191] 1）His-TRP1-up，PPGK1-GgbAS-TADH1，PTDH3-AtCPR1-TTPI1，PTEF1-MtOAS-TCYC1和His-down的制备

[0192] 制备1507bp的SEQ ID No.14所示的DNA片段M1（His-TRP1-up），M1中含有SEQ ID No.14的第1059-1507位所示的His3位点上游同源片段。制备659bp的SEQ ID No.15所示的DNA片段M5（His-down），M5中含有SEQ ID No.15的第1-463位所示的His3位点下游同源片段。

[0193] 分别用表16描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模块（DNA片段M2-M4）：约3206bp M2（PPGK1-GgbAS-TADH1）、约 3281bp M3（PTDH3-AtCPR1-TTPI1）和 约 2177bp M4（PTEF1-MtOAS-TCYC1）。M2（PPGK1-GgbAS-TADH1）含有GgbAS基因的表达盒PPGK1-GgbAS-TADH1，GgbAS基因的表达盒PPGK1-GgbAS-TADH1中，PPGK1的功能酸序列为SEQ ID No.6的第63-812位，GgbAS基因的编码序列为SEQ ID No.2的第8-2305位，TADH1的功能序列为SEQ ID No.6的第3143-3300位；M3（PTDH3-AtCPR1-TTPI1）中含有AtCPR1表达盒PTDH3-AtCPR1-TTPI1，AtCPR1表达盒PTDH3-AtCPR1-TTPI1中，启动子PTDH3的功能序列为SEQ ID No.10，终止子TTPI1的功能序列为SEQ ID No.11，基因AtCPR1的编码序列为SEQ ID No.1；M4（PTEF1-MtOAS-TCYC1）中含有MtOAS基因的表达盒PTEF1-MtOAS-TCYC1，MtOAS基因的表达盒PTEF1-MtOAS-TCYC1中，启动子为PTEF1（功能序列为SEQ ID No.8），终止子为TCYC1（功能序列为SEQ ID No.9），MtOAS基因的编码序列为SEQ ID No.3的第8-1447位。

[0194] 表16引物

[0195]

[0196] （2）BY-2OA的构建

[0197] 采用和实施例2中相同的方法进行酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA感受态细胞的制备及转化，向实施例3中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA转入M1，M2，M3，M4和M5共1ug（摩尔比为1:1:1:1:1）基因模块。筛选培养的培养基为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2%葡萄糖；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。

[0198] 转化子分别用表16引物进行PCR鉴定，得到全部5条对应的目的片段（约1507bp 的 M1（His-TRP1-up）、约 3206bp 的 M2（PPGK1-GgbAS-TADH1）、约 3281bp 的 M3（PTDH3-AtCPR1-TTPI1）、约2177bp的M4（PTEF1-MtOAS-TCYC1）、约659bp的M5（His-down））的为正确的阳性克隆，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-2OA。

[0199] 实施例5、工程菌重组酿酒酵母GY-1构建

[0200] 1）His-TRP1-up，PPGK1-PgDDS-TADH1，PFBA1-SynPPTS-TTDH2，PTDH3-AtCPR1-TTPI1，PTEF1-SynPPDS-TCYC1和His-down的制备

[0201] 制备SEQ ID No.6所示的DNA片段M2（PPGK1-PgDDS-TADH1），M2为PgDDS表达盒，其核苷酸序列如SEQ ID No.6，其中，SEQ ID No.6的第63-812位为启动子PPGK1的功能序列，SEQ ID No.6的第825-3134位为PgDDS基因的编码序列，SEQ ID No.6的第3143-3300位终止子TADH1的功能序列。制备1507bp的SEQ ID No.14所示的DNA片段M1（His-TRP1-up），M1中含有SEQ ID No.14的第1059-1507位所示的His3位点上游同源片段。制备659bp的SEQ ID No.15所示的DNA片段M5（His-down），M5中含有SEQ ID No.15的第1-463位所示的His3位点下游同源片段。分别用表17描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模块（DNA片段M3、M4和M6）：约2633bp的M3（PFBA1-SynPgPPTS-TTDH2），约3281bp的M4（PTDH3-AtCPR1-TTPI1）和约2198bp的M6（PTEF1-SynPPDS-TCYC1）。M3（PFBA1-SynPgPPTS-TTDH2）中含有SynPgPPTS基因表达盒PFBA1-SynPgPPTS-TTDH2，SynPgPPTS基因表达盒PFBA1-SynPgPPTS-TTDH2中启动子PFBA1的功能序列为SEQ ID No.16，终止子TTDH2的功能序列为SEQ ID No.13，基因SynPgPPTS的编码序列为SEQ ID No.5的第8-1417位；M4（PTDH3-AtCPR1-TTPI1）中含有AtCPR1表达盒PTDH3-AtCPR1-TTPI1，AtCPR1表达盒PTDH3-AtCPR1-TTPI1中，启动子PTDH3的功能序列为SEQ ID No.10，终止子TTPI1的功能序列为SEQ ID No.11，基因AtCPR1的编码序列为SEQ ID No.1；M6（PTEF1-SynPPDS-TCYC1）中含有SynPgPPDS基因的表达盒PTEF1-SynPgPPDS-TCYC1，SynPgPPDS基因的表达盒PTEF1-SynPgPPDS-TCYC1中启动子为PTEF1（功能序列为SEQ ID No.8），终止子为TCYC1（功能序列为SEQ ID No.9），SynPgPPDS基因的编码序列为SEQ ID No.4的第8-1468位。

[0202] 表17引物

[0203]

[0204] （2）GY-1的构建

[0205] 采用和实施例2中相同的方法进行酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA感受态细胞的制备及转化，向实施例3中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA转入M1，M2，M3，M4，M5和M6共1ug（摩尔比为1:1:1:1:1:1）基因模块。筛选培养的培养基为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2%葡萄糖；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。

[0206] 转化子分别用表17引物进行PCR鉴定，得到全部6条对应的目的片段（约 1507bp 的 M1（His-TRP1-up），约 3218bp 的 M2（PPGK1-PgDDS-TADH1），约 2633bp 的M3（PFBA1-SynPgPPTS-TTDH2）， 约 3281bp 的 M4（PTDH3-AtCPR1-TTPI1）， 约 2198bp 的 M6（PTEF1-SynPPDS-TCYC1），659bp的M5（His-down）的为正确的阳性克隆，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1已于2013年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：
北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.7725，下文中均简称酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1。

[0207] 上述实施例构建的各工程菌基本信息见表18。

[0208] 表18工程菌信息

[0209]

[0210] 实施案例6、工程菌生产β-香树脂和齐墩果酸

[0211] 1、工程菌培养及产物提取

[0212] 在固体筛选培养平板中活化由实施例2-4构建的重组工程菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-T1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-2OA；于YPD液体培养基中制备发酵种子液（30℃，250rpm，16小时）；离心收集菌体，转移至含100ml发酵液的250ml三角瓶中，调OD600nm至0.05，各菌株相应的发酵培养基同筛选培养基，30℃，250rpm/min，振荡培养在第5天取部分发酵液。进一步检查OD600nm和产物β-香树脂和齐墩果酸的含量。实验重复三次，每次重复设3个三角瓶。

[0213] 提取产物条件：发酵产物离心收集菌体，加少量石英砂，600ul提取液（丙酮:甲醇=1:1），振荡破碎5分钟，冰水中超声30min，7000g离心5min，取上清液（提取三次，合并上清液）；上清液过0.22um有机膜后备用，得到提取产物。

[0214] 2、GC-MS鉴定和测定β-香树脂

[0215] 将上述提取产物经下述处理：

[0216] GC-MS测定条件：进样口温度300℃，进样体积1ul，不分流，溶剂延时12min；色谱柱：Agilent HP-5ms气相毛细管柱（30m*0.25mm*0.5um）；色谱条件：80℃，1min；以-1
20℃min 的速率升温到300℃保温15min；MS条件：SIM：69、218、363、411和437；根据标准品定性，采用标准曲线法进行定量分析。作为标准品的β-香树脂购自美国Sigma公司（产品编号09236）。

[0217] 3、齐墩果酸的LC-MS鉴定

[0218] 将上述提取产物经下述处理：

[0219] 检测采用：液相色谱-串联质谱(LC-MS)仪由安捷伦1200高效液相色谱仪和Bruker-micrOTOF-II质谱仪组成，MicroOTOF control version3.0/Data Anaysis Version4.0数据采集和处理系统。

[0220] 质谱条件：电喷雾电离源负离子模式（ESI-），喷雾电压（-4.5kV），雾化气流量（6L/h），雾化器温度（180℃），碰撞气为氮气，压力为1.0Bar，数据采集频率1.0HZ：碰撞能量为8.0eV。

[0221] 色谱条件：色谱柱Waters SymmetryC18柱(50mm×2.1mm，5μm)；流动相A为0.1%醋酸铵；流动相B乙腈；用将流动相A和流动相B按照15:85的体积比混合得到洗脱液洗脱30分钟；柱温（30℃）；流速（1ml/min）；进样体积（20μl）；标准品定性分析。

[0222] 4、齐墩果酸的HPLC检测

[0223] 齐墩果酸含量采用HPLC测定：色谱柱WatersSymmetry C18柱(50mm×2.1mm，5μm)；流动相A（甲醇：水=1:9，含0.1%甲酸）；流动相B为乙腈，用将流动相A和流动相B按照15:85的体积比混合得到洗脱液洗脱30分钟；柱温为30℃；流速（1ml/min）；进样体积（20μl），检测波长210nm。根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法进行定量分析。
作为标准品的齐墩果酸购自美国Sigma公司（产品编号42515）。

[0224] 结果

[0225] 1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-T1的提取产物中没有β-香树脂和齐墩果酸。

[0226] 2）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-T1中引入外源的β-香树脂合酶基因，及酿酒酵母自身的ERG9基因和ERG1基因得到的重组菌。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA的提取产物经GC-MS分析定性和定量分析，结果如图1所示，其中，（A）β-香树脂标准品，1为β-香树脂离子峰；（B）对照样品，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-T1的提取产物；（C）检测样品，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA的提取产物；（D）β-香树脂质谱图，可以看出，检测样品中和β-香树脂标准品中的β-香树脂保留时间为18.376min和保留时间为18.361min，同时有相同的质谱图，表明提取产物中有β-香树脂。结果表明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA的β-香树脂含量达57.5mg/L发酵液（5.0mg/g细胞干重）。

[0227] 3）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA：在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA中引入外源的β-香树脂合酶基因，齐墩果酸合酶基因和细胞色素P450氧化还原酶基因得到的重组菌。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA的提取产物经齐墩果酸LC-MS定性分析，结果如图2所示，其中，（A）齐墩果酸标准品；（B）对照样品，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-βA的提取产物；（C）检测样品，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA的提取产物；（D）齐墩果酸质谱图；可以看出，检测样品中和齐墩果酸标准品中的齐墩果酸保留时间为11.81min和11.82min；同时有相同的质谱图，表明提取产物中有齐墩果酸。结果表明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA的β-香树脂含量达61.4mg/L发酵液（5.1mg/g细胞干重），齐墩果酸含量达72.0mg/L发酵液（6.0mg/g细胞干重）。

[0228] 4）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-2OA：在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA的基础上进一步提高β-香树脂合酶基因，齐墩果酸合酶基因和细胞色素P450氧化还原酶基因的拷贝数后，得到的工程菌。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-2OA发酵的提取产物检测方法同上，实验结果表明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-2OA的β-香树脂含量达141.7mg/L发酵液（11.8mg/g细胞干重），齐墩果酸含量达203.4mg/L发酵液（17.0mg/g细胞干重）。

[0229] 实施案例7、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1生产齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇

[0230] 1、工程菌培养及产物提取

[0231] 在固体筛选培养平板中活化由实施例3构建的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY-OA和实施例5构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1；于YPD液体培养基中制备发酵种子液（30℃，250rpm，16小时）；离心收集菌体，转移至含100ml发酵液的250ml三角瓶中，调OD600nm至0.05，各菌株相应的发酵培养基同筛选培养基，30℃，
250rpm/min，振荡培养在第5天取部分发酵液。进一步检查OD600nm和产物齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇的含量。实验重复三次，每次重复设3个三角瓶。

[0232] 提取产物条件：发酵产物离心收集菌体，加少量石英砂，600ul提取液（丙酮:甲醇=1:1），振荡破碎5分钟，冰水中超声30min，7000g离心5min，取上清液（提取三次，合并上清液）；上清液过0.22um有机膜后备用，得到提取产物。

[0233] 2、原人参二醇的LC-MS鉴定

[0234] 将上述提取产物经下述处理：

[0235] 检测采用：液相色谱-串联质谱(LC-MS)仪由安捷伦1200高效液相色谱仪和Bruker-micrOTOF-II质谱仪组成，MicroOTOF control version3.0/Data Anaysis Version4.0数据采集和处理系统。

[0236] 质谱条件：电喷雾电离源正离子模式（ESI+），喷雾电压（4.5kV），雾化气流量（6L/h），雾化器温度（180℃），碰撞气为氮气，压力为1.0Bar，数据采集频率1.0HZ：碰撞能量为8.0eV。

[0237] 色谱条件：色谱柱WatersSymmetry C18柱(50mm×2.1mm，5μm)；流动相A（甲醇：水=1:9，含0.1%甲酸）;流动相B为乙腈，用将流动相A和流动相B按照15:85的体积比混合得到洗脱液30分钟；柱温（30℃）；流速（1ml/min）；进样体积（20μl）；标准品定性分析。根据标准品的保留时间定性。作为标准品的原人参二醇购自美国Sigma公司（产品编号P0031）。

[0238] 3、原人参三醇的LC-MS鉴定

[0239] 将上述提取产物经下述处理：

[0240] 检测采用：液相色谱-串联质谱(LC-MS)仪由安捷伦1200高效液相色谱仪和Bruker-micrOTOF-II质谱仪组成，MicroOTOF control version3.0/Data Anaysis Version4.0数据采集和处理系统。

[0241] 质谱条件：电喷雾电离源正离子模式（ESI+），喷雾电压（4.5kV），雾化气流量（6L/h），雾化器温度（180℃），碰撞气为氮气，压力为1.0Bar，数据采集频率1.0HZ：碰撞能量为8.0eV。

[0242] 色谱条件：色谱柱WatersSymmetry C18柱(50mm×2.1mm，5μm)；流动相A（甲醇：水=1:9，含0.1%甲酸）;流动相B为乙腈；用将流动相A和流动相B按照15:85的体积比混合得到洗脱液洗脱30分钟；柱温（30℃）；流速（1ml/min）；进样体积（20μl）；标准品定性分析。作为标准品的原人参三醇购自美国Sigma公司（产品编号42476）。

[0243] 4、齐墩果酸，原人参二醇和原人参三醇HPLC测定

[0244] 色谱柱WatersSymmetry C18柱(50mm×2.1mm，5μm)；流动相A（甲醇：水=1:9，含0.1%甲酸）;流动相B为乙腈，用将流动相A和流动相B按照15:85的体积比混合得到洗脱液洗脱30分钟；柱温为30℃；流速（1ml/min）；进样体积（20μl），检测波长203nm；根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法进行定量分析。齐墩果酸的测定方法同实施例6。原人参二醇和原人参三醇的标准品同上。

[0245] 结果

[0246] 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1：在产齐墩果酸工程菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA的基础上转入外源的达玛二烯合成酶基因，原人参二醇合成酶基因，原人参三醇合成酶和细胞色素P450氧化还原酶基因后，得到的工程菌。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1的提取产物经原人参二醇LC-MS定性分析，结果如图3所示，其中，（A）原人参二醇标准品；（B）对照样品，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA的提取产物；（C）检测样品，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1的提取产物；（D）原人参二醇质谱图；可以看出，样品中和原人参二醇标准品中的原人参二醇保留时间为15.91min和15.96min；同时有相同的质谱图，表明提取产物中有原人参二醇。

[0247] 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1的提取产物经原人参三醇LC-MS定性分析，结果如图4所示，其中，（A）原人参三醇标准品；（B）对照样品，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-OA的提取产物；（C）检测样品，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1的提取产物（D）原人参三醇质谱图；可以看出，检测样品中和原人参三醇标准品中的原人参三醇保留时间为4.31min和4.38min；同时有相同的质谱图，表明提取产物中有原人参三醇。

[0248] HPLC检测其发酵的提取产物，结果表明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GY-1能同时生产齐墩果酸（OA），原人参二醇（PPD）和原人参三醇（PPT）等三种人参皂苷元，产量分别达21.4mg/L发酵液，17.2mg/L发酵液和15.9mg/L发酵液，占总人参皂苷元比例分别为39.3%,31.5%和29.2%，含量及产物比例如图5。

[0249] 表19实施例中的DNA片段

[0250]

[0251]

[0252]

[0253]

[0254]

[0255]