一种南方红豆杉根际高效解磷嗜麦芽寡养单胞菌及其应用转让专利
申请号 : CN201310431792.3
文献号 : CN103484405B
文献日 : 2015-03-04
发明人 : 任嘉红 , 冯建国 , 常惠丽 , 郁国栋 , 李世宏 , 燕妮
申请人 : 长治学院
摘要 :
本发明公开了一种南方红豆杉根际高效解磷嗜麦芽寡养单胞菌，其分类命名为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenortrophomonas maltophilia）JYD-4，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2012264，保藏日期为2012年7月1日。本发明还公开了上述嗜麦芽寡养单胞菌在促进南方红豆杉生长中的应用。JYD-4菌株对卵磷脂具有较强降解能力；JYD-4菌剂接种南方红豆杉实生苗，结果表明，该菌剂能明显促进南方红豆杉苗的生长。因此，本发明能为将来开发南方红豆杉专用微生物肥料提供优良的菌株资源。
权利要求 :
1.一种南方红豆杉根际高效解磷嗜麦芽寡养单胞菌在促进南方红豆杉生长中的应用；
其中，所述的南方红豆杉根际高效解磷嗜麦芽寡养单胞菌，其分类命名为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)JYD-4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2012264，保藏日期为2012年7月1日。
说明书 :
一种南方红豆杉根际高效解磷嗜麦芽寡养单胞菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物肥料领域中的微生物肥料技术领域，具体涉及一种南方红豆杉根际高效解磷嗜麦芽寡养单胞菌及其应用。
背景技术
[0002] 南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)，又名美丽红豆杉、紫杉、红榧，隶属红豆杉科(Taxaceae)、红豆杉属(Taxus)，为新生代第一纪孑遗植物，由于南方红豆杉可提取特效抗癌活性成分紫杉醇而倍受世人关注。近年来，紫杉醇的生产大多利用天然林提供原料，造成天然林数量剧减。1999年8月4日国务院批准的《国家重点野生植物名录》，将红豆杉属的所有种类列为国家一级保护植物。由于长期严重砍伐，造成南方红豆杉天然林数量剧减，目前已处于濒危状态(潘标志，2004；王昌腾，2005)。通过营造大面积的南方红豆杉人工林，能够有效保护该珍贵树种和改善生态环境，满足目前市场所需和紫杉醇产业的可持续发展。
[0003] 磷是植物生长发育的重要物质基础，是植物体内核酸及多种酶、辅酶、ATP等的重要组成成分，这些物质对于细胞来说是至关重要的。植物体需要的磷主要是从土壤中获得，土壤中的磷主要是无效态磷，植物很难直接利用，但是植物对磷素营养又是必须的，所以必须施加磷肥来保证植物的正常生长。但是由于易溶性的磷肥只有少部分被植物利用，2+ 2+
更多的磷与土壤中的Ca 、Fe 等金属离子相反应形成难溶性磷酸盐，成为植物无法利用的形态，致使土壤中沉积更多的无效磷；还有一部分磷肥会随雨水流入水体，导致水体富营养化，致使磷肥的利用率非常低。解磷微生物是土壤中能够将难溶性磷转化为植物能够吸收利用的可溶性磷的一类特殊的微生物功能类群。据不完全统计，目前全世界共筛选出30属
89种解磷微生物，其中对解磷细菌开展的研究较多。有机磷化物是土壤磷的重要组成部分，约占土壤总磷量的1/3～1/2。解有机磷微生物一般约占土壤微生物总数的30％～60％。
与真菌、放线菌相比，植物根际细菌被认为是最有效的解有机磷微生物。土壤中的有机磷在微生物分泌的酶作用下，逐步降解，最终释放出植物可以吸收利用的无机态的磷，这种过程也被称为有机磷的矿化作用。
更多的磷与土壤中的Ca 、Fe 等金属离子相反应形成难溶性磷酸盐，成为植物无法利用的形态，致使土壤中沉积更多的无效磷；还有一部分磷肥会随雨水流入水体，导致水体富营养化，致使磷肥的利用率非常低。解磷微生物是土壤中能够将难溶性磷转化为植物能够吸收利用的可溶性磷的一类特殊的微生物功能类群。据不完全统计，目前全世界共筛选出30属
89种解磷微生物，其中对解磷细菌开展的研究较多。有机磷化物是土壤磷的重要组成部分，约占土壤总磷量的1/3～1/2。解有机磷微生物一般约占土壤微生物总数的30％～60％。
与真菌、放线菌相比，植物根际细菌被认为是最有效的解有机磷微生物。土壤中的有机磷在微生物分泌的酶作用下，逐步降解，最终释放出植物可以吸收利用的无机态的磷，这种过程也被称为有机磷的矿化作用。
[0004] 20世纪80年代以后，国内许多单位相继开发出了多种解磷菌制剂，微生物肥料的研究及开发得到了高度重视。Sperber等(1958)发现不同土壤中解磷微生物的数量有很大的差异，大部分解磷微生物出现在植物根际土壤中。Katznelson(1962)对小麦根际解磷细菌的分布进行研究，发现根表面上分离的解磷细菌的数量远远高于非根际土和根际土。解磷菌表现出的强烈根际效应可能与根际磷素营养亏缺诱导有关，但是由于根际微生物的群落结构受根系分泌物及根脱落物的影响，导致不同植物根圈微生物的组成差异很大，这种作用也影响解磷菌的群落组成。大量研究表明，微生物具有强烈的根际效应，不同土壤、不同作物根际及不同环境条件下，解有机磷细菌的种类和数量均有所不同。
[0005] 总之，从土壤中筛选高效解磷微生物，研制解磷菌剂施入土壤，活化土壤中难溶性磷以供植物吸收利用是低投入高产出的可持续发展途径。因此，开展南方红豆杉根际高效解磷细菌菌株的筛选，进行南方红豆杉专用生物肥料的开发研究，对于我国顺利实施珍稀植物的保护，保护生态环境具有重要的意义。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种南方红豆杉根际高效解磷嗜麦芽寡养单胞菌。
[0007] 本发明还要解决的一个技术问题是提供上述南方红豆杉根际高效解磷嗜麦芽寡养单胞菌的应用。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0009] 从山西省长治市大峡谷南方红豆杉根际土壤中，筛选获得了南方红豆杉根际高效解磷嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)JYD-4。已保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2012264，保藏日期为2012年7月1日。
[0010] JYD-4菌株的主要生物学特征：在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，菌落较小，半透明，乳黄色，圆形、边缘整齐，表面光滑，有光泽，中央有突起；菌体短杆状，革兰氏染色阴性，大小约0.23～0.33μm×0.34～1.40μm，无芽孢，极生多鞭毛；好氧，氧化酶反应阳性，KOH阳性，吲哚试验阳性；明胶液化阳性，硝酸还原试验阳性，产氨和硫化氢试验阳性。
[0011] JYD-4菌株16SrDNA基因序列，见SEQ ID No.1所示。
[0012] 将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，结果表明：菌株JYD-4与寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)同源性都很高，与Stenotrophomonas maltophilia的相似度为96％。结合形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。
[0013] 上述嗜麦芽寡养单胞菌JYD-4在促进南方红豆杉生长中的应用。CCTCC NO：M2012264菌株菌剂盆栽接种试验表明，该菌剂明显促进了南方红豆杉的生长发育。
[0014] 有益效果：本发明的嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC NO：M 2012264在蛋黄平板培养条件下，在菌落周围可产生明显溶磷圈；在液体振荡培养条件下，对卵磷脂具有较好降解效果，与对照(CK)相比，差异显著；本发明的嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC NO：M 2012264制成菌剂接种南方红豆杉实生苗。结果表明，该菌剂能明显促进南方红豆杉的生长发育，因此，本发明为将来开发南方红豆杉专用微生物肥料提供了优良的菌株资源。
附图说明
[0015] 嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)JYD-4，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M2012264，保藏日期：2012年7月1日。
[0016] 图1为JYD-4菌株在蛋黄平板上溶磷圈。
[0017] 图2为JYD-4菌株对卵磷脂降解能力。
[0018] 图3为JYD-4菌株对一年生南方红豆杉接种1年后促生效果。
具体实施方式
[0019] 根据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0020] 实施例1：JYD-4平板解磷能力测定。
[0021] 卵黄培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂15.0～18.0g，pH 7.0，灭菌，待温度降至50℃左右时，每50mL中加入3～4mL新鲜蛋黄液(蛋黄与无菌生理盐水等体积混合)，混匀，倒平板。
[0022] 将活化2次的JYD-4菌株用灭菌牙签点接于卵黄平板上，30℃培养3天后，测量溶磷圈与菌落直径，并计算溶磷圈与菌落直径之比(图1)。
[0023] 从图1中看出，JYD-4菌株在卵黄平板上培养后，可产生明显不透明的溶磷圈。经测量与计算，溶磷圈直径为32.18mm，菌落直径为15.98mm，溶磷圈与菌落比达2.01。
[0024] 实施例2：JYD-4液体解磷能力测定。
[0025] 蒙金娜培养基：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水硫酸镁0.3g，七水硫酸亚铁0.03g，四水硫酸锰0.03g，卵磷脂0.4g，碳酸钙5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0
[0026] 将活化2次的JYD-4菌株接种NA培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂18.0g，pH 7.2～7.4)中，30℃培养2天后，无菌水冲洗菌体制成菌悬液，取1mL菌悬液于含50mL蒙金娜培养基的100mL三角瓶中，以接1mL灭菌菌悬液的蒙金娜培养基为对照(CK)，每个处理3个重复，30℃，200r/min振荡培养72h后，发酵液
4℃，10000r/min离心10min，钼锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量(图2)。
4℃，10000r/min离心10min，钼锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量(图2)。
[0027] 从图2中可看出，接种JYD-4菌株发酵液中可溶性磷含量为82.85mg·L-1，是对照-1(14.21mg·L )的5.83倍。综上表明，JYD-4菌株对卵磷脂具有较强的降解能力。
[0028] 实施例3：JYD-4温室盆栽试验。
[0029] 将JYD-4活化2～3次后，用接种环挑取少量菌体接种于含有50mL NB培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)100mL三角瓶中，30℃，200r/min振荡培养48h。发酵液(4℃，6000r/min)离心5min，用无菌生理盐水润洗菌体3次后，8
无菌生理盐水调节菌悬液(10cfu/mL)制成菌剂。接种一年生南方红豆杉，以等量无菌生理盐水为对照，接种量为5mL/株。每处理8个重复，置于温室统一管理，适时浇水。
无菌生理盐水调节菌悬液(10cfu/mL)制成菌剂。接种一年生南方红豆杉，以等量无菌生理盐水为对照，接种量为5mL/株。每处理8个重复，置于温室统一管理，适时浇水。
[0030] JYD-4菌株接种1年后对一年生南方红豆杉实生苗生长的影响(见表1)。从表1和图3可看出，接种JYD-4菌剂明显促进了南方红豆杉实生苗的生长。接种处理南方红豆杉实生苗的苗高、地径与CK相比均有不同程度的增长。其中，苗高和地径比CK分别增长了43.39％和24.11％。
[0031] 表1 JYD-4对南方红豆杉实生苗生长的影响
[0032]
[0033] 注：P<0.05，同行不同列小写字母不相同代表差异显著。