香菇C91-3菌株的Latcripin-15基因片段、编码蛋白及制备方法

摘要

本发明公开一种香菇C91-3菌株的Latcripin-15基因片段、编码蛋白及制备方法，Latcripin-15基因片段，具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；编码蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。Latcripin-15基因片段的制备方法按如下步骤进行：提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；PCR扩增目标基因：以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；回收纯化DNA片段。

权利要求

1.一种香菇C91-3菌株的Latcripin-15基因片段，其特征在于所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

2.一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-15基因片段编码的蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-15基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

c. PCR扩增目标基因：

以所得到的cDNA为模板，以具有EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：上游引物：

5'- ATCGGATCCGAATTCCATGGCAATGTCTACACCTG-3'下游引物：

5'- GTGGTGGTGCTCGAGCAATCCTACGACATGCTGAC-3'回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化720bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。

4.根据权利要求3所述香菇C91-3菌株的Latcripin-15基因片段的制备方法，其特征在于所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，

12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中，然后加入1/5体积氯仿，温和振荡后，

4˚C, 12000r/min离心15min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置15min，再次4˚C，12000r/min离心10min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。

5.根据权利要求4所述香菇C91-3菌株的Latcripin-15 基因片段的制备方法，其特征在于所述c步骤的PCR反应体系50 µl： cDNA模板1µl，上游引物0.5µl，下游引物

0.5µl，dNTP Mixture 4 µl、5×PrimeSTAR Buffer 10 µl、2.5 U/µl 的PrimeSTAR HS DNA Polymerase0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5µl；反应条件：98˚C变性10s，55˚C复性10s，72˚C延伸

1min，30个循环；72˚C延伸5min；4˚C冷却10min。

说明书

香菇C91-3菌株的Latcripin-15 基因片段、编码蛋白及制

备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-15基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有RCC1结构域，具有杀伤肿瘤细胞、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。

背景技术

[0002] 真菌富含多种生物活性分子，包括核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素样蛋白、多糖和激酶。其中的抗肿瘤成分以不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面具有独到之处。香菇菌C91-3属真菌为担子菌亚门担子菌纲侧耳科，该菌种已于2013年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7354。香菇菌C91-3含有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，et a1．An Antitumor lectin from edible Mushroom Agrocybe aegerita[J]．Biochem J，2003，374：321—327]。香菇菌C91-3发酵液中含有多种蛋白成分，通过动物体内实验证实有些蛋白成分具有较好的抗肿瘤作用[黄敏，宁安红，张卓然等．香菇C91-3菌丝发酵液小鼠体内抗肿瘤作用的研究[J]．中国微生态学杂志，1996，8(3)：38-150]。体外实验也证实，其发酵液中的一些蛋白组分具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力[戴兵,黄敏,宁安红.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究.浙江医学，2004，26（9）；656 -658]。但是，迄今为止还没有关于从香菇C91-3菌中提取可杀伤肿瘤细胞的基因片段、编码蛋白及制备方法等相关报道。

发明内容

[0003] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-15 基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有RCC1结构域，具有杀伤肿瘤细胞、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。

[0004] 本发明的技术解决方案是一种香菇C91-3菌株的Latcripin-15基因片段，其特征在于如SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列。

[0005] 一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-15 基因片段编码蛋白，其特征在于如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

[0006] 一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-15基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

[0007] a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

[0008] b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

[0009] c.PCR扩增目标基因：

[0010] 以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅠ 和 XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：

[0011] 上游引物EcoRⅠ：

[0012] 5'- ATCGGATCCGAATTCCATGGCAATGTCTACACCTG-3'

[0013] 下游引物XhoⅠ：

[0014] 5'- GTGGTGGTGCTCGAGCAATCCTACGACATGCTGAC-3'

[0015] d. 回收纯化DNA片段：

[0016] 将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化720bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。

[0017] 所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中，然后加入1/5体积氯仿，温和振荡后，4˚C, 12000r/min离心，15min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置15min，再次4˚C，12000r/min离心，10min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。

[0018] 所述c步骤的PCR反应体系50 µl： cDNA模板1µl，上游引物0.5µl，下游引物2＋
0.5µl，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 µl、5×PrimeSTAR Buffer（Mg plus） 10 µl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/µl）0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5µl；反应条件：98˚C变性10s，55˚C复性10s，72˚C延伸1min，30个循环；72˚C延伸5min；4˚C冷却10min。

[0019] 本发明是从香菇C91-3菌丝体转录组中，克隆出一段特异性基因片段，命名为Latcripin-15 基因片段，该基因片段所编码的蛋白具有RCC1结构域，具有杀伤肿瘤细胞、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。可将该基因片段进行基因重组，并于pET-32a原核表达体系中进行高效的表达，将表达产物通过亲和层析进行分离和提纯，获得该基因编码的蛋白质，该蛋白可用于研究细胞凋亡中的机制及其在细胞信号通路中的作用，也可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

附图说明

[0020] 图1是本发明实施例 PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图。

[0021] 图2是本发明实施例所用载体 pET-32a（＋）双酶切后的电泳图。

[0022] 图3是本发明实施例提取的Latcripin-15 基因片段转化后的单克隆阳性菌落。

[0023] 图4是本发明实施例重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。

[0024] 图5是本发明实施例诱导表达蛋白的Western-blot电泳图。

[0025] 图6是本发明实施例纯化后的目标蛋白SDS-PAGE电泳图。

[0026] 图7是本发明实施例纯化后的目标蛋白对HepG2细胞的生长抑制率示意图。

[0027] 图8是本发明实施例纯化后的目标蛋白对A549细胞的生长抑制率示意图。

[0028] 图9是本发明实施例纯化后的目标蛋白对HepG2的生长抑制效果图。

[0029] 香菇C91-3菌株保藏日期：2013年3月15日；

[0030] 分类命名：香菇（Lentinula edodes）；

[0031] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；

[0032] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

[0033] 保藏号：CGMCC No.7354。

具体实施方式

[0034] a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA：

[0035] 取用培养基培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入1ml的Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中，然后加入0.2ml氯仿，温和振荡后，4˚C, 12000r/min离心，15min；吸取上层水相溶液0.5ml并转移至另一干净的1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置15min，再次4˚C,12000r/min离心，10min，弃上清，然后加入75%乙醇1ml洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

[0036] 紫外分光光度计验证纯度，OD260/280比值在1.8~2.0之间。

[0037] 进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，表明RNA提取纯度较高。

[0038] b. 将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

[0039] 使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒反转录合成cDNA，本试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。

[0040] 反应体系：香菇菌丝体总RNA (1 µg/µl) 1 µl、3’ RACE Adaptor (5 µM) 1 µl、dNTP Mixture (10 mM each) 1 µl、RNase Free dH2O 4.5 µl；

[0041] 反应条件：70˚C，10 min 立即冰上放置2分钟；

[0042] 然后加入下列组分：5× M-MLV Buffer 2 µl、 RNase Inhibitor (40 U/µl) 0.25 µl、Reverse Transcriptase M-MLV (无RNA酶) (200 U/ µl) 0.25 µl，体系总体积达到10 µl。

[0043] 反应条件： 42˚C，60 min 70˚C，15 min 得到反转录反应液（cDNA）。

[0044] c.PCR扩增目标基因：

[0045] 以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅠ和 XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：

[0046] 上游引物EcoRⅠ：

[0047] 5'- ATCGGATCCGAATTCCATGGCAATGTCTACACCTG-3'

[0048] 下游引物XhoⅠ：

[0049] 5'- GTGGTGGTGCTCGAGCAATCCTACGACATGCTGAC-3'

[0050] 引物委托宝生物（大连）公司合成。

[0051] PCR反应体系50 µl： cDNA模板1µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，dNTP2＋
Mixture（各2.5 mM）4 µl、5×PrimeSTAR Buffer（Mg plus） 10 µl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/µl）0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5µl；反应条件：98˚C变性10s，55˚C复性
10s，72˚C延伸1min，30个循环；72˚C延伸5min；4˚C冷却10min。

[0052] PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳如图1所示，图1中M ： DL2,000 DNA Marker；1：Latcripin-15 目的克隆片段产物，证明成功获得了该基因片段。

[0053] d. 回收纯化DNA片段：

[0054] 将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化720bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段，名命为Latcripin-15 基因片段。

[0055] 实验：

[0056] 1. Latcripin-15 基因片段序列测定：

[0057] 测序由大连宝生物公司测定，香菇C91-3 Latcripin-15 基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1。Latcripin-15 的基因片段序列长为720bp的cDNA，其含有240个密码子可读框（ORF）。经使用NCBI数据库核苷酸相似性检索表明，无任何相似性的基因片段序列，证明此基因为一新型基因片段。

[0058] 2. Latcripin-15 基因片段的克隆表达

[0059] 2.1 载体构建

[0060] 2.1.1 将质粒pET-32a（＋），使用EcoRⅠ/XhoⅠ进行酶切；

[0061] 反应体系 （37˚C过夜）：

[0062] pET-32a（＋）（100 ng/µl） 10 µl

[0063] 10×K Buffer 5 µl

[0064] EcoRⅠ（10 U/µl） 1 µl

[0065] XhoⅠ（10 U/µl） 1 µl

[0066] dH2O Up to 50 µl

[0067] 取5 µl 进行1% 琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，M ： λ-Hind Ⅲ digest；1 ： pET-32a（＋）-plasmid；2 ： pET-32a（＋）- EcoRⅠ/ XhoⅠ，表明质粒切割完全，可进行后续实验。

[0068] 2.1.2 载体回收

[0069] 使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0切胶回收约5.9 kbp 的DNA 片段。

[0070] 2.1.3 将pET-32a（＋）载体与本发明实施例的Latcripin-15 基因片段进行重组[0071] 使用In-Fusion® HD Cloning Kit，分别将本发明实施例的Latcripin-15 基因片段与酶切后回收载体连接，反应体系及条件如下：

[0072] Latcripin-15 基因片段（100 ng/µl） 2 µl

[0073] 酶切后回收载体（50 ng/µl） 1 µl

[0074] 5xIn-Fusion HD Enzyme Premix 2 µl

[0075] dH2O Up to 10 µl

[0076] 50˚C 15 min

[0077] 取上述In-Fusion 产物2.5 µl 热转化至E.coli Rosetta-gami(DE3)中，涂布于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB平板上，37 ˚C 过夜培养。培养结果如图3所示，表明重组载体成功转化到宿主菌中，并获得阳性菌落。

[0078] 同时，选取平板上生长的单克隆阳性菌落接种于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB液体培养基于37 ˚C 培养14小时，采用宝生物公司Plasmid Miniprep Kit V3.l 抽提质粒进行测序鉴定，结果如SEQ ID NO.1。

[0079] 2.2Latcripin-15蛋白的诱导表达及鉴定

[0080] 2.2.1 Latcripin-15蛋白的自诱导表达

[0081] 挑取2.1.3的单克隆阳性菌落，接种于10 ml 含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB液体培养基中，于37 ˚C 下，190 r/min振荡培养5小时，再接种于10ml含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的自诱导培养基中，于37 ˚C 下，190 r/min振荡培养3小时。取菌液进行反复冻融破碎（4次），低温（4˚C）离心6000 r/min，5min，取上清，加入50μl PBS。将上清按蛋白样品处理方法处理后，做12%SDS-PAGE电泳图如图4所示，M：蛋白标准Marker；1：空白对照，2：3小时Lp-15，图4中条带表明：重组蛋白成功表达。

[0082] 2.2.2目标蛋白Western-blotting 鉴定分析

[0083] 将SDS-PAGE电泳分离样品后，将PAGE胶用湿转膜的方式转印到NC膜上，经5%脱脂牛奶室温封闭液封闭100分钟后，第一抗Mouse Anti-His Tag Monoclonal Antibody，4˚C孵育过夜。再加入第二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L)室温孵育60分钟，显色试剂盒显色如图5所示，1：空白对照，2：3小时Lp-15，图5中条带表明诱导表达的重组蛋白确实为目的蛋白。

[0084] 2.3 Latcripin-15蛋白的纯化及活性鉴定

[0085] 2.3.1. Latcripin-15蛋白的纯化

[0086] 将上述条件诱导的菌体低温5000 r/min，10min~20 min离心，每50~100 mg菌体（湿重）加入1~2 ml细菌裂解液。10000×g，4˚C离心15~20分钟，分离上清和沉淀，并收集沉淀（包涵体）。将沉淀重悬于Binding Buffer中。10,000×g离心20分钟，收集上清。将上清负载上柱，利用HIS标签的亲和层析进行蛋白的纯化，使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。得到单一的目的蛋白，12%SDS-PAGE电泳验证如图6所示，M：蛋白标准Marker；1：上样液；2：流穿液；3：第1管；4：第2管；5：第3管；6：第4管；7：第5管；8：第6管，图
6中，第2管到第6管均出现单一目的蛋白，表明蛋白纯化成功。

[0087] 采用现有方法纯化浓缩的目标蛋白进行测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。此新型特异蛋白序列（Latcripin-15蛋白，简称Lp-15），经NCBI数据库氨基酸相似性检索和Pfam数据库检索分析，结果表明Latcripin-15蛋白具有RCC1结构域，该结构域具有杀伤肿瘤细胞、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等多种生物学功能。

[0088] 2.3.2. Latcripin-15蛋白的除盐和复性

[0089] 将纯化后的Lp-15蛋白进行梯度透析，将Lp-15蛋白装入MW16000的透析袋中，两端用透析袋夹夹紧。将透析袋放入0.5L~2L的透析复性液中，冰浴，搅拌透析，24h~72 h，每6~8 h换液一次复性，逐步降低尿素浓度直至0。将透析袋中的溶液离心10000 r/min，4˚C离心，20~30min上清即为复性的重组蛋白。

[0090] 2.3.3 Latcripin-15蛋白的活性鉴定（MTT法）

[0091] 将纯化浓缩的目的蛋白进行微量BCA蛋白定量后，用MTT法检测细胞存活和生长情况。将目的蛋白作用的终浓度分别调整为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml（用于HepG2）, 50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml（用于A549），以RPMI-1640作为空白对照。评价其对肿瘤细胞的细胞毒作用。选用人肝癌HepG2细胞株和人肺癌A549细胞株进行MTT实验。用0.25~1%胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数4
调整其浓度至5×10/ml。每孔加入100μl，边缘孔用无菌PBS填充，5%CO2，37˚C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）加入上述对应浓度的药物每孔100μl ，每个浓度设6个复孔，5%CO2，37˚C孵育24小时，48小时。并倒置显微镜下观察。然后每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4小时。终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min。在酶联免疫检测仪562 nm处测量各孔的吸光值，参考波长630nm，按照下面公式计算抑瘤率（细胞生长抑制率）=（对照组平均OD值－实验组平均OD值）/对照组平均OD值。目标蛋白的MTT实验结果如图7，图8所示说明本发明基因表达的蛋白对人肝癌HepG2细胞株和人肺癌A549细胞株有明显地抑制作用。

[0092] Lp-15蛋白作用HepG2肿瘤细胞的形态学变化如图9所示，上边图片是对照组，肿瘤细胞排列紧密整齐，生长良好；下边照片是实验组，肿瘤细胞变圆，脱落，出现明显死亡现象。说明本发明基因表达的蛋白对肝癌HepG2细胞株有明显地抑制作用。