PCR直接测序法对汉坦病毒进行基因分型的引物及试剂盒和方法转让专利
申请号 : CN201310413527.2
文献号 : CN103484566B
文献日 : 2015-03-04
发明人 : 戴方伟 , 宋晓明 , 周莎桑 , 卢领群 , 萨晓婴
申请人 : 浙江省医学科学院
摘要 :
本发明公开了一种PCR直接测序法对汉坦病毒进行基因分型的引物及试剂盒和方法。该引物包括：上游引物：ATTAGCCCWGTCATGAGTGT；下游引物：CTTTGACTCYTTTGKYTCCA；其中Y为C或T，W为A或T，K为G或T。所述方法包括：提取待测病毒样本的总RNA，逆转录获得cDNA；以cDNA为模板，利用引物进行PCR扩增，并对扩增的目的片段进行测序；基于目的片段的序列信息并以已知基因型代表毒株的相应片段为参照构建系统发生树；根据系统发生树对待测病毒样本进行基因分型。利用该引物只进行一次PCR扩增即可获得汉坦病毒S基因的特异性序列，利用该特异性序列能简便快速地对汉坦病毒进行基因分型。
权利要求 :
1.一对引物，包括：
上游引物：ATTAGCCCWGTCATGAGTGT；
下游引物：CTTTGACTCYTTTGKYTCCA；
其中Y为C或T，W为A或T，K为G或T。
2.一种用于汉坦病毒基因分型的试剂盒，包括PCR缓冲液、dNTP液、MgCl2溶液、Taq酶、引物、阴性对照、阳性对照和去离子水，其特征在于，所述引物为权利要求1所述的引物。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，MgCl2溶液的浓度为25mM，dNTP液的浓度为10mM。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取液和胶回收提取液。
说明书 :
PCR直接测序法对汉坦病毒进行基因分型的引物及试剂盒
和方法
技术领域
[0001] 本发明涉及基因诊断技术领域，尤其涉及一种PCR直接测序法对汉坦病毒进行基因分型的引物及试剂盒和方法。
背景技术
[0002] 汉坦病毒（Hanta virus，HV）属布尼亚病毒科的汉坦病毒属是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，包括引起汉坦病毒肾综合征出血热（HFRS）的汉坦型、汉城型、普马拉型等，以及引起汉坦病毒肺综合征（HPS）的纽约型、无名型等，在我国以汉坦型和汉城型为主要流行株。汉坦病毒的自然宿主主要是小型啮齿动物，并经由啮齿类动物传播给人类，引起HFRS或HPS等。
[0003] 汉坦病毒感染又称出血热，是重要的烈性人兽共患病原，被国家国卫生部和农业部列为二类危害病原。实验动物高度易感，近年来，实验动物汉坦病毒感染人事件的频发已成为危害科研人员健康和实验动物业发展的重要因素。
[0004] 自上世纪60年代到90年代先后发生30余起实验室内大鼠感染流行性出血热事件，共导致50余名科研人员发病。2000～2001年间，在对杭州市多家科研和教学单位的实验动物相关工作人员血清人兽共患病病原抗体的检测中发现，家鼠型肾综合征出血热病毒和弓形虫抗体均有阳性病例，表明实验动物密切接触者时刻存在着感染人兽共患病病原风险。
[0005] 从事实验动物大小鼠生产及科学研究人员由于经常接触携带HV的宿主动物及其排泄物、污染的尘埃等而受感染，由于汉坦病毒引发疾病的类型及其严重程度取决于病毒的型别，对汉坦病毒株的分型，以及阐明病毒之间的关系对汉坦病毒病原防治具有重要的意义。
[0006] 采用血清学方法虽然能对病毒进行分类，但血清学分型的实验周期长，工作量大，得到病毒分离物较为困难无法进行血清学分型，而且不能阐明病毒之间的系统发生关系。基于病毒基因的序列数据分析不但能对病毒进行基因分型，还能较好地阐明病毒之间的系统发生关系。
[0007] 已有研究表明，依据M基因片段和S基因片段的全长核苷酸序列构建系统发生树，对汉坦病毒进行基因分型的结果与血清学分型结果一致，但需对整个基因进行全核苷酸测序分析，目前尚无文献报道仅用一次PCR产物的直接测序结果实现汉坦病毒不同毒株的基因分型。
发明内容
[0008] 本发明提供了一对引物，利用该引物可以一次特异性扩增汉坦病毒S片段的目标序列，利用该目标序列能准确对汉坦病毒进行基因分型。
[0009] 一对引物，包括：
[0010] 上游引物：ATTAGCCCWGTCATGAGTGT；
[0011] 下游引物：CTTTGACTCYTTTGKYTCCA；
[0012] 其中Y为C或T，W为A或T，K为G或T。
[0013] 该引物是基于Genbank上公开的24株汉坦病毒代表株的S基因片段序列设计的，利用该引物只需进行一次PCR扩增，获得的扩增产物即可用于对待测病毒样本的基因分型。
[0014] 具体地，利用所述引物对汉坦病毒进行基因分型的方法包括：
[0015] （1）提取待测病毒样本的总RNA，逆转录获得cDNA；
[0016] （2）以所述cDNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增，并对扩增的目的片段进行测序；
[0017] （3）基于目的片段的序列信息并以已知基因型代表毒株的相应片段为参照构建系统发生树；
[0018] （4）根据系统发生树对待测病毒样本进行基因分型。
[0019] 为保证测序数据的准确性，作为优选，步骤（2）中，采用双向测序法对扩增的目的片段进行测序，测序完成后进行序列拼接。目的片段的长度在200bp左右，单向测序可完全测通但只有一次覆盖，若采用的双向测序法进行测序，则每个扩增产物即可有两次覆盖。测序完成后对双向测序得到的两条序列进行合并，即得到一条高质量序列。
[0020] 作为优选，步骤（3）中，利用邻位相连法构建系统发生树。邻位相连法（NJ法）通过确定距离最近的成对分类单位使系统发生树的总距离达到最小，通过循序地将相邻点合并成新的点，从而建立起一个相应的拓扑树。与其他方法相比，利用邻位相连法构建的系统发生树，其基因分型结果更为准确。
[0021] 所述已知基因型代表毒株包括株号为76-118、A16、C1-2、NC167、Z10、Gou3、K24-V2、L99、R22、SR11、160V、Dobrava、Cg-13891、Cg-Erft、K27、Vranica、AH1、C9717869、Of22819、Bayou、NMH10、NMR11、CC74和CC107的汉坦病毒。这24株汉坦病毒代表毒株的基因序列索引号依次是：M14626、AF288646、D25533、AB027523、AF184987、AF184988、AF288655、AF488708、AF488707、M34881、AJ009773、L41916、U22423、AJ238779、L08804、U14137、AF324902、NC_003466、AF482714、L36929、L25784、L37904、L33816、L33683，涵盖了7种汉坦病毒血清型。在利用本发明引物进行扩增的基础上，以这些代表毒株为参照构建系统发生树能够准确地获得待测病毒样本的系统分类位置。
[0022] 在利用多条序列进行系统发育分析前，还需对这些序列进行联配，对它们的序列相似性进行评估，为后期分析提供信息位点。
[0023] 本发明还提供了一种用于汉坦病毒基因分型的试剂盒，包括PCR缓冲液、dNTP液、MgCl2溶液、Taq酶、阴性对照、阳性对照和去离子水，以及上述引物。其中，MgCl2溶液的浓度为25mM，dNTP液的浓度为10mM。
[0024] 作为优选，所述试剂盒还包括核酸提取液和胶回收提取液。如此一来，利用该试剂盒即可完成对病毒样本进行核酸提取、反转录、PCR扩增、胶回收纯化的一系列步骤，不必再另外使用其他的核酸提取试剂盒以及胶回收试剂盒。
[0025] 本发明仅针对汉坦病毒S基因特定片段设计单一引物，该引物经Genbank中24株汉坦病毒代表性毒株序列的比对验证，结果表明该序列能实现对汉坦病毒不同基因型的分型鉴定。此外，对9株流行性毒株进行PCR-直接测序，并与上述24株汉坦病毒代表性毒株共同构建系统发生数，其结果与血清学分型一致，表明该方法具备一次PCR实现汉坦病毒基因分型的能力。
[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0027] 利用本发明设计的引物和试剂盒只需进行一次PCR扩增即可获得汉坦病毒S基因的特异性序列，利用该特异性序列能简便快速地对汉坦病毒进行基因分型。
[0028] 说明书附图
[0029] 图1为各病毒样本的PCR产物电泳图；其中，M为DNA分子量标准，1-4分别为肺440、肺473、471、97阴性对照的PCR产物，5、7-11、T8、N1～4分别为天77-2、游10-31、泉
547、龙泉、游10-30、R88、T8及N1、N2、N3、N4的PCR产物；
547、龙泉、游10-30、R88、T8及N1、N2、N3、N4的PCR产物；
[0030] 图2为24株汉坦病毒代表株S片段引物设计区基因的分型结果；
[0031] 图3为24株汉坦病毒代表株和11株实验毒株S片段引物设计区基因的分型结果。
具体实施方式
[0032] 一、主要试剂
[0033] RNA提取试剂盒Rneasy Mini Kit购自Qiagen公司；克隆载体、T4连接酶、M-MLV逆转录酶、DNA Taq酶、聚合酶链式反应（PCR）相关试剂、琼脂糖凝胶纯化试剂盒及质粒DNA纯化试剂盒购自日本TaKaRa中国分公司。
[0034] 二、引物设计
[0035] 从Genbank数据库中下载24株汉坦病毒代表性毒株的基因序列，这24株病毒代表株包括7种血清亚型，详细信息见表1。
[0036] 表124株汉坦病毒代表性毒株的信息
[0037]
[0038]
[0039] 注：Aa：Apodemus agraius，黑线姬鼠；Nc：Niviventer confucianus，社鼠；Hu：Human，人；Rr：Rattus rattus，黑鼠；Rn：Rattus norvegicus，褐家鼠；Rl：Rattus losea，黄毛鼠；Af：Apodemus flavicollis，黄喉姬鼠；Cg：Clethrionomys glareolus，欧洲棕背鼠平；Ol：Oligoryzomys longicaudatus，长尾矮小稻鼠；Of：Oligoryzomys flavescens，金黄小啸鼠；Pm：Peromyscus maniculatus，鹿鼠。
[0040] 以上述24株病毒代表株的核苷酸序列作参照，选择最佳基因位点，利用DNA STAR软件设计S基因的扩增引物，并由上海生物工程公司合成；设计的引物序列如下所示：
[0041] 上游引物：ATTAGCCCWGTCATGAGTGT；
[0042] 下游引物：CTTTGACTCYTTTGKYTCCA；
[0043] 其中Y为C或T，W为A或T，K为G或T。
[0044] 三、汉坦病毒实验毒株的系统分析
[0045] 1、汉坦病毒实验毒株信息
[0046] 本具体实施方式选取11株汉坦病毒实验毒株进行系统分析，这11株汉坦病毒实验毒株分别为：天77-2、游10-31、泉547、龙泉、游10-30、R88、N1、N2、N3以及1株汉城病毒标准株N4（UR，SEO血清型）和1株汉坦病毒标准株T8（76-118，HTN血清型），其中，N4和T8作为阳性对照；同时采用了肺440、肺473、471、97这4个临床检测阴性样本的DNA作为阴性对照。所有病毒株均由浙江省疾病预防控制中心提供，各病毒株的相关信息详见表2。
[0047] 表2研究中用于系统发生分析的汉坦病毒株鉴定及其来源信息
[0048]
[0049] 注：“—”表示阴性结果，“+”表示阳性结果，“ND”表示未做检查。
[0050] 2、RT-PCR扩增
[0051] 利用设计并合成的引物，对上述病毒株进行RT-PCR扩增，具体步骤如下：
[0052] （1）提取RNA
[0053] 将汉坦病毒感染样本置于研钵，加入液氮研磨；将研磨得到的粉末，快速转移至无RNase、经过液氮冷却的2mL离心管中；加入350μL Buffer RLT，颠倒混匀，涡旋溶解；将溶解物转移至QIA spin column，最大转速离心3min，取上清转移至新的2mL的收集管；
加约1倍体积的70%乙醇，迅速吹打混匀；将样品（约700μL）转移至带有2mL回收管的粉色RNeasy spin column（以下简称column），8000g离心15s，将滤出物丢弃；加入700μL Buffer RW1至column，≥8000g离心15s以清洗柱子上的滤膜，丢弃滤出物和收集管；转移column至新的收集管，加入500μLBuffer RPE，≥8000g离心15s以清洗柱子上的滤膜，丢弃滤出物；再加入500μL Buffer RPE，≥8000g离心2min以清洗柱子上的滤膜；最大转速离心1min，转移column至新的1.5mL收集管，加入30-50μL无RNA酶的水于滤膜上，≥8000g离心1min，洗脱RNA。
加约1倍体积的70%乙醇，迅速吹打混匀；将样品（约700μL）转移至带有2mL回收管的粉色RNeasy spin column（以下简称column），8000g离心15s，将滤出物丢弃；加入700μL Buffer RW1至column，≥8000g离心15s以清洗柱子上的滤膜，丢弃滤出物和收集管；转移column至新的收集管，加入500μLBuffer RPE，≥8000g离心15s以清洗柱子上的滤膜，丢弃滤出物；再加入500μL Buffer RPE，≥8000g离心2min以清洗柱子上的滤膜；最大转速离心1min，转移column至新的1.5mL收集管，加入30-50μL无RNA酶的水于滤膜上，≥8000g离心1min，洗脱RNA。
[0054] （2）反转录
[0055] 以提取的RNA为模板进行反转录，反转录体系为：
[0056] 模板RNA（约500ng） 1μL
[0057] Random Primers（25μM） 1μL
[0058] DEPC水 4μL；
[0059] 70℃保温10min，迅速置冰浴2min；再加入：
[0060]
[0061] 总体积为10μL。
[0062] 反应条件为：30℃保温10min，42℃1h，70℃15min。反应结束后，迅速置于冰上冷却，-20℃保存备用（以上所有操作均在冰上进行），获得cDNA。
[0063] （3）PCR扩增
[0064] 以反转录获得的cDNA为模板，利用上述设计的引物进行PCR扩增，反应体系为：2+
模板0.5μL，10×PCR buffer（含Mg ）2μL，MgCl2（终浓度2.5mM）2μL，dNTP（终浓度
75μM）0.15μL，Taq酶（0.75U）0.15μL，正反向引物（终浓度0.25μM）各0.5μL，DEPC水补足至20μL体系。
模板0.5μL，10×PCR buffer（含Mg ）2μL，MgCl2（终浓度2.5mM）2μL，dNTP（终浓度
75μM）0.15μL，Taq酶（0.75U）0.15μL，正反向引物（终浓度0.25μM）各0.5μL，DEPC水补足至20μL体系。
[0065] 反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，扩增30个循环。
[0066] PCR产物进行电泳验证，具体结果见图1。由图1可见，本发明引物在11株实验毒株（含阳性对照T8和N4）中扩增结果均为阳性，且产物大小与目标区域一致，而阴性对照组中没有条带。由此表明本发明引物对汉坦病毒的检测具有很好的敏感性和特异性。
[0067] 对目的片段进行割胶回收，胶回收试剂盒为TaKaRa公司产品，具体如下：
[0068] 将带有目的片段的凝胶块转移至1.5mL离心管，称重后换算体积，加入等体积的Binding Buffer（XP2），于55-65℃水浴中温浴至凝胶完全融化，每2-3min振荡或涡旋混合物；取HiBind DNA Mini柱子，将获得的DNA/熔胶液全部转移至柱子中；室温下10,000g离心1min，弃收集管中的滤液，将柱子套回新的2mL收集管中；转移300μL Binding Buffer（XP2）至柱子中，室温下10,000g下离心1min，弃收集管中的滤液，将柱子套回2mL收集管内，转移700μL SPW Wash buffer至柱子中，室温下10,000g离心1min；重复用700μL SPW Wash buffer洗涤柱子，室温10,000g离心1min；收集管中的滤液，将柱子套回2mL收集管内，室温13,000g离心2min；将柱子装在新的1.5mL离心管上，加入15～30μL Elution Buffer至柱基质上，室温放置1min后，13,000g离心1min以洗脱DNA。
[0069] （4）序列测定及分析
[0070] 回收并纯化的PCR产物委托上海生物工程公司进行序列测定，测定结果见SEQ ID No.1～12所示。将测定得到的序列应用DNA STAR软件（SeqMan）进行序列拼接，应用CLUSTALW软件进行多序列联配，应用MEGA4.0软件包进行系统发生分析，以邻位相连法（neighbor-joining，NJ）构建系统发生树。
[0071] 作为验证和参照，从Genbank网站下载上述24株汉坦病毒代表性毒株的S片段序列，利用上述引物通过BLASTN确定目标序列区域（如SEQ ID No.13～37所示），经多序列联配后，应用MEGA4.0软件包进行系统发生分析，以邻位相连法（neighbor-joining，NJ）构建系统发生树。
[0072] 利用24株汉坦病毒代表性毒株构建的系统发生树如图2所示，利用24株汉坦病毒代表性毒株和11株汉坦病毒实验毒株共同构建的系统发生树如图3所示。
[0073] 由图2可见，该系统发育树将24株汉坦病毒代表性毒株分为5个区域，即引起肾综合征出血热（HFRS）的HTN、SEO、DOB、PUU血清型，以及引起汉坦病毒肺综合征（HPS）的Sin Nombre血清族（AND，BAY，SNV）。引起HFRS的四种血清型具有较稳定的拓扑结构，且能与引起HPS的血清型进行区分。其中PUU血清型的毒株与引起HPS的汉坦病毒具有更近的进化距离。引起HPS的三种血清型亲缘关系较近，其中AND血清型与BAY和SNV的差异较大，而后二者虽然形成较独立的分区，但自展值较小(<50)。
[0074] 由图3可见，系统发育分析将已知血清型的T8毒株分为HTN血清型，N4毒株分为SEO血清型，另外9株血清型不明的毒株分为4个血清型，其中天77-2、游10-31和龙泉为HTN血清型，N1为SEO血清型；而其余5个毒株则形成较为独立的两个分支，即（N2，N3）和（泉547，游10-30，R88），这两个分支之间亲缘关系较近，且与本文选取的5个代表性血清型具有较大的差异。
[0075] 作为验证，采用免疫荧光法对本具体实施方式的11株汉坦病毒实验毒株进行血清学分型，血清学分型的具体方法参见：
[0076] ①姚苹苹，朱函坪，邓小昭等，浙江省汉坦病毒基因分子进化分析，病毒学报，2010，26(6)：465.；
[0077] ②陈秀英，雷永良，梅盛华等，2005-2010年浙江省龙泉市肾综合征出血热监测及病毒分离鉴定，疾病监测，2011，26(11)：870-872.。
[0078] 血清学分型的结果与图3所示系统发生树的结果一致，表明本发明的引物能够用于准确快速地实现汉坦病毒的基因分型。