一种快速定量检测橄榄油中含羟基化合物的方法

摘要

本发明公开了一种快速定量检测橄榄油中含羟基成份的方法，属于食用油脂检测领域。本发明基于19F NMR技术发明的方法能够简单快速定量检测橄榄油中含羟基化合物的含量，可广泛运用到其他食用油脂的检测。氟衍化试剂氟代苯甲酰氯与含羟基化合物发生取代反应，使含羟基化合物氟衍生化。运用傅立叶超导核磁共振波谱仪将氟衍生化的含羟基化合物做19F NMR图谱。对图谱进行手动积分，可以准确计算出含羟基化合物的含量。结果准确可靠，方法简单可行，操作简单易学，可为橄榄油的质量分析提供很有价值的参考，也可用于检测其他食用油的含羟基化合物的含量。

权利要求

1.一种快速定量检测橄榄油中含羟基化合物的方法，其特征在于具有以下的过程和步骤:a.羟基化合物的氟衍化试剂的选择：所述的氟衍化试剂为4-氟苯甲酰氯、2,4,6-三氟苯甲酰氯或3，5-二氟苯甲酰氯；

b.存储溶液的配制：所述的存储溶液为氘代氯仿与吡啶体积比为1.5：1或1.6：1的混合液，存储溶液用量为10.0ml，存储溶液含有0.1mg六氟苯20mg叔丁基对苯酚，放在分子筛里防水储存，六氟苯、叔丁基对苯酚为内标；

c.橄榄油样品的反应处理：所述的橄榄油样品投放量100mg至150mg，置于5mm核磁管里并加入0.5ml至0.6ml上述存储溶液和30μL氟衍化试剂，将反应混合物放置室温下反

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应30min，待完全反应完后，立即用核磁共振波谱仪做 F NMR图谱；

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d.利用核磁共振波谱仪作 F NMR图谱：所述 F NMR 图谱是在BRUKER AVANCE/AV 500 MHz傅立叶超导核磁共振波谱仪上操作得到的；探头温度为26 ± 1 °C；光谱参数如下：

90脉冲宽度19.3μs，扫描宽度100 kHz，弛豫延迟1s，内存大小64 K，每个谱累积采样64次；所有图谱在进行傅里叶变换之前，扩大线宽0.3Hz校正漂移。

说明书

一种快速定量检测橄榄油中含羟基化合物的方法

技术领域

[0001] 本发明属于食用油脂检测技术领域，具体是检测橄榄油中含羟基化合物的方法。

背景技术

[0002] 橄榄油是常用食用油脂中营养价值比较丰富的一种。由于橄榄油含有丰富的不饱和脂肪酸及微量成份，使其具有非常高的食用价值和保健功效。在西方被誉为“液体黄金”、“地中海甘露”。含羟基化合物是橄榄油微量成份的重要组成部分，包括单甘酯、甘油二酯、直链脂肪醇类、甾醇类（β-谷甾醇、Δ-5-燕麦甾醇、胆固醇）、酚类（生育酚、酪醇、羟基酪醇、木质素等）等物质。

[0003] 橄榄油中的脂肪酸绝大部分都是以甘油酸酯的形式存在，其中甘三酯占到90%以上，单甘酯的含量低于1%，甘二酯主要是以1，3-甘二酯的形式存在，但是由于随着储存时间的增加、精炼、产地等不同，橄榄油中的1，3-甘二酯会异构化为1，2-甘二酯。研究表明1，3-甘二酯与总甘二酯的比例可以作为橄榄油分级的重要依据。

[0004] 临床研究表明，饮食中的植物甾醇可以抑制小肠对胆固醇的吸收和降低血液中胆固醇的水平。现代研究表明植物甾醇还具有抗炎、抗菌、抗溃疡、抗氧化和抗肿瘤活性。初榨橄榄油中的游离植物甾醇含量受到储存时间和储存条件的影响会酯化，另外精炼橄榄油中的游离植物甾醇也会发生酯化。因此检测橄榄油中的游离植物甾醇的含量对橄榄油的质量评价具有重要参考价值，也是检测橄榄油掺假的重要指标。

[0005] 橄榄油中的酚类物质（ 、羟基酪醇、橄榄苦味素等）是天然的抗氧化剂，橄榄油无需再添加其他合成的抗氧化剂，而且酚类物质也是赋予橄榄油特殊口味的主要物质。流行病学研究表明酚类物质能够很好的预防癌症和冠心病，也具有抗衰老的作用。由于橄榄油中的酚类化合物含量低、结构复杂，传统的方法的检测方法很难快速准确的检测出含量。精炼橄榄油中的酚类物质由于经过高温、脱臭等处理含量下降。

[0006] 酸度是用来测定每一百克油脂中自由脂肪酸所占的比例的指标，自由脂肪酸又叫游离脂肪酸，是油脂中“不安分”的脂肪组成部分，酸度过高容易导致氧化，从而导致油脂酸败，不可食用。国际橄榄油理事会和欧盟的标准显示，特级初榨橄榄油的油酸含量低于0.8，初榨橄榄油低于2.0，精炼橄榄油由于经过化学脱酸过程，酸度低于0.3。检测橄榄油及其他油脂的酸度能够判断油脂的游离脂肪酸的比例指标，容易判断是否酸败。在油脂氧化过程中也会产生醛基化合物，检测醛基化合物的含量可以判断油脂的氧化程度，初榨橄榄油没有经过高温、高压，所以醛基化合物含量都比较低，精炼橄榄油的醛基含量比初榨橄榄油高的多，这是判断橄榄油等级的重要指标之一。1 13

[0007] 目前检测橄榄油中的含羟基物质主要是气相色谱法、H NMR法、C NMR法。由于1 13
H NMR有重叠峰，C NMR弛豫时间长不敏感，这样图谱解析和定量都具有非常大的挑战性。
气相色谱检测需要先将游离甾醇酯化，由于橄榄油中本身就含有一部分酯化植物甾醇，所以检测游离植物甾醇要先检测出总植物甾醇才能进一步检测游离植物甾醇。这种方法过程繁琐复杂而且耗时耗力，对实验的操作和条件的控制要求都比较高。

[0008] 本发明基于19F NMR技术发明的方法能够简单快速定量检测橄榄油中含羟基化合物的含量。

发明内容

[0009] 本发明基于19F NMR技术发明的方法试剂盒能够简单快速定量检测橄榄油中含羟基化合物的含量，可广泛运用到其他食用油脂的检测。

[0010] 本发明所采用的技术方案是： 氟衍化试剂4-氟苯甲酰氯与含羟基化合物发生取代反应，使含羟基化合物氟衍生化。运用德国BRUKER AVANCE/AV 500 MHz傅立叶超导核磁19
共振波谱仪将氟衍生化的含羟基化合物做 F NMR图谱。

[0011] 运用核磁图谱处理软件MestReNova V6.1 对含羟基化合物图像进行手动积分，计算出样品中含羟基化合物含量。

[0012] 一种快速定量检测橄榄油中含羟基化合物的方法，其特征在于具有以下的过程和步骤:

[0013] a.羟基化合物的氟衍生化试剂的选择：所述的氟衍化试剂包括4-氟苯甲酰氯、2,4,6-三氟苯甲酰氯、3，5-二氟苯甲酰氯。

[0014] b.存储溶液的配制：所述的存储溶液为氘代氯仿与吡啶体积比为1.5：1或1.6：1的混合液，储存试剂用量为10.0ml,储存试剂含有0.1mg六氟苯20mg叔丁基对苯酚，放在分子筛里防水储存。六氟苯、叔丁基对苯酚为内标。

[0015] c.橄榄油试样的反应处理：所述的橄榄油样品投放量100mg至150mg，置于5mm核磁管里并加入0.5ml至0.6ml上述储存试剂和30μL氟衍化试剂，将反应混合物放置室温19
下反应30min，待完全反应完后，立即用核磁共振波谱仪做 F NMR图谱。

[0016] d.利用核磁共振波谱仪作19F NMR图谱：利用核磁共振波谱仪作19F NMR 图谱在BRUKER AVANCE/AV 500 MHz傅立叶超导核磁共振波谱仪操作得到的；探头温度为26 ± 1 °C；典型的光谱参数如下：90脉冲宽度19.3μs，扫描宽度100 kHz，弛豫延迟1s，内存大小64 K。每个谱累积采样64次。所有图谱在进行傅里叶变换之前，扩大线宽0.3Hz校正漂移。

[0017] e.运用核磁共振图谱处理软件MestReNova V6.1 对含羟基化合物图像进行手动积分，计算试样中含羟基化合物的含量：计算公式为：

[0018] IDG 和Ii 分别为甘油二酯和4-氟苯甲酰氯的积分，MDG为甘油二酯的分子量，m为实验中橄榄油实际使用量，A 为内标的毫摩尔量。

[0019] 本发明的有益效果是：可以快速简单定量检测橄榄油中含羟基化合物的含量。结果准确可靠，方法简单可行，操作简单易学，可为橄榄油的质量分析提供很有价值的参考，也可用于检测其他食用油的含羟基化合物的含量。

[0020] 说明书附图

[0021] 图1、运用19F NMR 检测甘油的图谱。

[0022] 图2、运用19F NMR 检测羟基酪醇的图谱。

[0023] 图3、运用19F NMR 检测棕榈醇的图谱。

[0024] 图4、运用19F NMR 检测 的图谱。

[0025] 图5、 运用19F NMR 检测1,2-甘油二油酸酯、1,3-甘油二油酸酯的图谱。

[0026] 图6、羟基酪醇、 、棕榈醇等的19F NMR图谱

具体实施方式

[0027] 以下将结合实施实例形式，对本发明的上述内容作进一步说明。

[0028] (1).储存试剂的配制：配制氘代氯仿与吡啶体积比为1.5：1储存试剂10.0ml,储存试剂含有0.1mg六氟苯20mg叔丁基对苯酚，放在分子筛里防水储存。六氟苯、叔丁基对苯酚为内标。

[0029] (2).核磁样品的准备：精确秤取橄榄油150mg置于5mm核磁管里并加入0.5ml上述储存试剂和30μL4-氟苯甲酰氯，将反应混合物放置室温下反应30min，待完全反应完19
后，立即运用核磁共振波谱仪做 F NMR图谱。
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[0030] (3).核磁共振检测：F NMR图谱是在BRUKER AVANCE/AV 500 MHz傅立叶超导核磁共振波谱仪操作得到的。探头温度为25℃。在这项研究中典型的光谱参数如下：90脉冲宽度的19.3μs，扫描宽度100 kHz，弛豫延迟1s，内存大小64 K。每个谱累积采样64次。所有图谱在进行傅里叶变换之前，扩大线宽0.3Hz校正漂移。
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[0031] 模型化合物氟衍生物的 F NMR的化学位移（ppm）见下表1.19

[0032] 表1.模型化合物的氟衍生物的 F NMR化学位移（ppm）

[0033]化合物 19F NMR化学位移

[0034] 1,2-甘油二油酸酯 107.94

[0035] 1,3-甘油二油酸酯 107.84

[0036] 甘油 107.89（α-位羟基）[0037] 107.71（β-位羟基）[0038] 羟基酪醇 107.28（酚羟基）

[0039] 108.54（醇羟基）

[0040] 107.62

[0041] 棕榈醇 108.95

[0042] 硬脂醇 108.95

[0043] 游离脂肪酸 103.90

[0044] 醛基 105.13

[0045]

[0046] 有关橄榄油样品的检测

[0047] 由上海市出入境检验检疫局提供的来自西班牙、意大利、希腊、突尼斯、土耳其等五个国家37个橄榄油样品，其中西班牙12个样品，意大利13个样品，希腊5个样品，土耳其4个样品，突尼斯3个样品。样品1到样品24为特级初榨橄榄油，样品25到样品37为混合橄榄油。

[0048] 检测计算得到的结果统计在表2中。

[0049] 表2. 19F NMR 检测不同地区、不同等级的橄榄油得到的甘油二酯的含量。

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