注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法及含量测定方法

摘要

本发明属于药物分析领域，具体涉及注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法及含量测定方法。本发明目的是提供一种操作简便，迅速、精确的方法用于检测注射用盐酸克林霉素中的杂质林可霉素、克林霉素B和7-差向克林霉素，采用液相色谱检测上述杂质，关键在于控制HPLC检测条件：流动相为磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比为50-60∶50-40，杂质林可霉素、克林霉素B和7-差向克林霉素检测波长为208～212nm。通过控制关键检测参数实现简便，迅速、精确检测的目的，本发明方法操作简便；测定结果准确可靠；专属性更强；主峰保留时间在10-12分钟，检测时间较短；为检测杂质、控制产品质量提供了一种全新的选择。

权利要求

1.注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法，其特征在于：所述杂质为林可霉素，采用液相色谱检测，HPLC检测条件如下：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比为50-60:50-40；其中，磷酸二氢钾溶液是磷酸二氢钾6-8g，加水溶解稀释至1000ml，用25％的氢氧化钾溶液调节pH值至7-8；

流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：30-40℃；

检测波长：208-212nm；

理论板数按克林霉素峰计算不低于4000；

实验材料的处理：

(1)供试品溶液的制备：精密称取注射用盐酸克林霉素，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素0.8-1.2mg的溶液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：

精密称取林可霉素对照品适量，加流动相溶解并稀释至每1ml含林可霉素40-60μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

2.注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法，其特征在于：所述杂质为克林霉素B，采用液相色谱检测，HPLC检测条件如下：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比为50-60:50-40；其中，磷酸二氢钾溶液是磷酸二氢钾6-8g，加水溶解稀释至1000ml，用25％的氢氧化钾溶液调节pH值至7-8；

流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：30-40℃；

检测波长：208-212nm；

理论板数按克林霉素峰计算不低于4000；

实验材料的处理：

(1)供试品溶液的制备：精密称取注射用盐酸克林霉素，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素0.8-1.2mg的溶液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：

精密称取克林霉素B对照品适量，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素B

90-110μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

3.注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法，其特征在于：所述杂质为7-差向克林霉素，采用液相色谱检测，HPLC检测条件如下：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比为50-60:50-40；其中，磷酸二氢钾溶液是磷酸二氢钾6-8g，加水溶解稀释至1000ml，用25％的氢氧化钾溶液调节pH值至7-8；

流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：30-40℃；

检测波长：208-212nm；

理论板数按克林霉素峰计算不低于4000；

实验材料的处理：

(1)供试品溶液的制备：精密称取注射用盐酸克林霉素，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素0.8-1.2mg的溶液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：

精密称取克林霉素对照品适量，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素90-110μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

4.根据权利要求1、2或3所述的注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法，其特征在于：HPLC检测条件中流动相磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比为55:45。

5.根据权利要求1、2或3所述的注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法，其特征在于：HPLC检测条件中所述的流速为1.0ml/min；柱温为35℃。

6.根据权利要求1、2或3所述的注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法，其特征在于：所述检测波长为210nm。

7.根据权利要求1所述的注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法，其特征在于：加流动相溶解并稀释至每1ml含林可霉素50μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

8.根据权利要求2所述的注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法，其特征在于：加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素B100μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

9.根据权利要求3所述的注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法，其特征在于：加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素100μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

10.注射用盐酸克林霉素杂质的含量测定方法，其特征在于：所述杂质为林可霉素，采用液相色谱检测，HPLC检测条件如下：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比为50-60：50-40；其中，磷酸二氢钾溶液是磷酸二氢钾6-8g，加水溶解稀释至1000ml，用25％的氢氧化钾溶液调节pH值至7-8；

流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：30-40℃；

检测波长：208-212nm；

理论板数按克林霉素峰计算不低于4000；

实验材料的处理：

(1)供试品溶液的制备：精密称取注射用盐酸克林霉素，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素0.8-1.2mg的溶液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：

精密称取林可霉素对照品适量，加流动相溶解并稀释至每1ml含林可霉素40-60μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

11.注射用盐酸克林霉素杂质的含量测定方法，其特征在于：所述杂质为克林霉素B，采用液相色谱检测，HPLC检测条件如下：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比为50-60：50-40；其中，磷酸二氢钾溶液是磷酸二氢钾6-8g，加水溶解稀释至1000ml，用25％的氢氧化钾溶液调节pH值至7-8；

流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：30-40℃；

检测波长：208-212nm；

理论板数按克林霉素峰计算不低于4000；

实验材料的处理：

(1)供试品溶液的制备：精密称取注射用盐酸克林霉素，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素0.8-1.2mg的溶液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：

精密称取克林霉素B对照品适量，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素B

90-110μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

12.注射用盐酸克林霉素杂质的含量测定方法，其特征在于：所述杂质为7-差向克林霉素，采用液相色谱检测，HPLC检测条件如下：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比为50-60：50-40；其中，磷酸二氢钾溶液是磷酸二氢钾6-8g，加水溶解稀释至1000ml，用25％的氢氧化钾溶液调节pH值至7-8；

流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：30-40℃；

检测波长：208-212nm；

理论板数按克林霉素峰计算不低于4000；

实验材料的处理：

(1)供试品溶液的制备：精密称取注射用盐酸克林霉素，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素0.8-1.2mg的溶液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：

精密称取克林霉素对照品适量，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素90-110μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

13.根据权利要求10、11或12所述的注射用盐酸克林霉素杂质的含量测定方法，其特征在于：HPLC检测条件中流动相磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比为55:45。

14.根据权利要求10、11或12所述的注射用盐酸克林霉素杂质的含量测定方法，其特征在于：HPLC检测条件中所述的流速为1.0ml/min；柱温为35℃。

15.根据权利要求10、11或12所述的注射用盐酸克林霉素杂质的含量测定方法，其特征在于：所述检测波长为210nm。

16.根据权利要求10所述的注射用盐酸克林霉素杂质的含量测定方法，其特征在于：加流动相溶解并稀释至每1ml含林可霉素50μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

17.根据权利要求11所述的注射用盐酸克林霉素杂质的含量测定方法，其特征在于：加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素B100μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

18.根据权利要求12所述的注射用盐酸克林霉素杂质的含量测定方法，其特征在于：加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素100μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

说明书

注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法及含量测定方法

技术领域

[0001] 本发明属于药物分析领域，具体涉及注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法及含量测定方法。

背景技术

[0002] 盐酸克林霉素属林可霉素类抗生素，为林可霉素的衍生物。抗菌谱与林可霉素形同，抗菌活性较林可霉素强4～8倍。对革兰氏阳性菌如葡萄球菌属（包括耐青霉素株）、链球菌属、白喉杆菌、炭疽杆菌等有较高抗菌活性。对革兰氏阴性厌氧菌也有良好抗菌活性，拟杆菌属包括脆弱拟杆菌、梭杆菌属、消化球菌、消化链球菌、产气荚膜杆菌等大多对本品高度敏感。革兰氏阴性需氧菌包括流感嗜血杆菌、奈瑟菌属及支原体属均对本品耐药。本品与青霉素、氯霉素、头孢菌素类和四环素类之间无交叉耐药，与大环内酯类有部分交叉耐药，与林可霉素有完全交叉耐药性。本品的作用机制是与细菌核糖体50S亚基结合，组织肽链的延长，从而抑制细菌细胞的蛋白质合成。本品系抑菌药，但在高浓度时，对某些细菌也具有杀菌作用。

[0003] 盐酸克林霉素中目前欧洲药典报道的杂质共有3种，分别为：

[0004] 杂质Ⅰ-林可霉素，化学式见式Ⅰ；杂质Ⅱ-克林霉素B，化学式见式Ⅱ；杂质Ⅲ-7-差向克林霉素，化学式见式Ⅲ。

[0005]

[0006] 发明人生产注射用盐酸克林霉素中林可霉素、7-差向克林霉素为降解产物，林可霉素化学名称为6-(1-甲基-反-4-丙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基)-1-硫代-6,8-二脱氧-D-赤式-α-D-半乳辛吡喃糖苷（林可霉素），分子式为C18H34N2O6S；7-差向克林霉素化学名称为6-（1-甲基-反-4-丙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基）-1-硫代-7（R）-氯-6，7，8-三脱氧-D-赤式-α-D-半乳辛吡喃糖苷，分子式为C18H33ClN2O5S；克林霉素B为合成过程中的中间体，化学名称为6-（1-甲基-反-4-乙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基）-1-硫代-7（S）-氯-6，7，8-三脱氧-L-苏式-α-D-半乳辛吡喃糖苷，分子式为C17H31ClN2O5S。

[0007] 现有报道中，盐酸克林霉素的杂质检测方法是采用HPLC检测，其色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为磷酸二氢钾溶液（磷酸二氢钾6.8g，加水溶解稀释至1000ml，用25%的氢氧化钾溶液调节pH值至7.5）-乙腈（55：45）；检测波长为210nm。

[0008] 为了更快速、精确检测注射用盐酸克林霉素中的杂质，发明人提供了一种新的方法检测注射用盐酸克林霉素中的杂质及其含量测定，以实现简便、快速、精确控制产品质量的目的。

发明内容

[0009] 本发明所解决的技术问题是提供一种操作简便，迅速、精确的检测方法，用于检测注射用盐酸克林霉素中的杂质：林可霉素、克林霉素B和7-差向克林霉素。

[0010] 本发明所述杂质林可霉素化学名称为6-(1-甲基-反-4-丙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基)-1-硫代-6,8-二脱氧-D-赤式-α-D-半乳辛吡喃糖苷（林可霉素），分子式为C18H34N2O6S；所述杂质克林霉素B化学名称为6-（1-甲基-反-4-乙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基）-1-硫代-7（S）-氯-6，7，8-三脱氧-L-苏式-α-D-半乳辛吡喃糖苷，分子式为C17H31ClN2O5S；所述杂质7-差向克林霉素化学名称为6-（1-甲基-反-4-丙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基）-1-硫代-7（R）-氯-6，7，8-三脱氧-D-赤式-α-D-半乳辛吡喃糖苷，分子式为C18H33ClN2O5S。

[0011] 本发明杂质林可霉素、克林霉素B、7-差向克林霉素的检测方法采用液相色谱检测，HPLC检测条件如下：

[0012] 固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0013] 流动相：磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比为50-60：50-40，优选体积比为55：45；其中磷酸二氢钾溶液是磷酸二氢钾6-8g，加水溶解稀释至1000ml，用25%的氢氧化钾溶液调节pH值至7-8。

[0014] 流速：0.8-1.2ml/min（流速优选1.0ml/min）；

[0015] 柱温：30-40℃（柱温优选35℃）；

[0016] 检测波长：210nm；

[0017] 理论板数按克林霉素峰计算不低于4000；

[0018] 实验材料的处理：

[0019] （1）供试品溶液的制备：精密称取注射用盐酸克林霉素，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素1mg的溶液，作为供试品溶液。

[0020] （2）杂质对照品溶液的制备：精密称取林可霉素、克林霉素B、克林霉素对照品用适量，加流动相溶解并稀释至每1ml含林可霉素40-60μg（优选50μg/ml），含克林霉素B90-110μg（优选100μg/ml），含克林霉素90-110μg（优选100μg/ml）的溶液摇匀，作为杂质对照品溶液。

[0021] 检测前，按照HPLC检测条件，精密量取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%。

[0022] 该检测方法的优点是：操作简便；测定结果准确可靠；专属性更强；主峰保留时间在12分钟左右，检测时间较短。

[0023] 在上述检测方法的基础上，本发明还提供了一种注射用盐酸克林霉素杂质林可霉素、克林霉素B、7-差向克林霉素的含量测定方法，可快速、简便、准确的确定注射用盐酸克林霉素中杂质含量，实现控制产品质量的目的。

[0024] （1）供试品溶液的制备：精密称取注射用盐酸克林霉素，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素1mg的溶液，作为供试品溶液；

[0025] （2）对照品溶液的制备：

[0026] 精密称取林可霉素、克林霉素B、克林霉素对照品用适量，加流动相溶解并稀释至每1ml含林可霉素40-60μg（优选50μg/ml），含克林霉素B90-110μg（优选100μg/ml），含克林霉素90-110μg（优选100μg/ml）的溶液摇匀，作为杂质对照品溶液。

[0027] 杂质的含量测定方法的HPLC检测条件如下：

[0028] 固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0029] 流动相：磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比（50-60：50-40），优选（55：45）；其中磷酸二氢钾溶液是磷酸二氢钾6-8g，加水溶解稀释至1000ml，用25%的氢氧化钾溶液调节pH值至7-8。

[0030] 流速：0.8-1.2ml/min（流速优选1.0ml/min）；

[0031] 柱温：30-40℃（柱温优选35℃）；

[0032] 检测波长：210nm；

[0033] 理论板数按克林霉素峰计算不低于4000；

[0034] 本发明杂质检测方法及含量测定方法的有益效果是操作简便，检测迅速，测定结果准确可靠，专属性更强；为检测杂质、控制产品质量提供了一种全新的选择。

附图说明

[0035] 图1林可霉素紫外扫描图。

[0036] 图2克林霉素B紫外扫描图。

[0037] 图3克林霉素紫外扫描图。

[0038] 图4林可霉素线性图。

[0039] 图5克林霉素B线性图。

[0040] 图6克林霉素线性图。

具体实施方式

[0041] 以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。

[0042] 现有的检测盐酸克林霉素中杂质的相关技术有：

[0043] 《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）：盐酸克林霉素有关物质的测定方法，测定条件规定如下：取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每lml中含4.0mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用流动相定量稀释制成每1ml中含80μg的溶液，作为对照溶液。精密量取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%；再精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，7-差向克林霉素峰面积和克林霉素B峰面积均不得大于对照溶液主峰面积（2.0%），其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（1.0%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的3倍（6.0%）。其中采用的色谱条件为采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢钾溶液（每1ml中含磷酸二氢钾6.8mg，用25%的氢氧化钾溶液调节pH值至7.5）-乙腈（55：45）为流动相；检测波长为210nm。然而，这种方法对盐酸克林霉素有关物质的测定准确度不够，测得的有关物质的含量比实际要小，使得产品的质量可控性受到影响。

[0044] 本发明杂质的检测方法采用液相色谱检测，HPLC检测条件如下：

[0045] 固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0046] 流动相：磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比（50-60：50-40），优选（55：45）；其中磷酸二氢钾溶液是磷酸二氢钾6-8g，加水溶解稀释至1000ml，用25%的氢氧化钾溶液调节pH值至7-8。

[0047] 流速：0.8-1.2ml/min（流速优选1.0ml/min）；

[0048] 柱温：30-40℃（柱温优选35℃）；

[0049] 检测波长：210nm；

[0050] 理论板数按克林霉素峰计算不低于4000；

[0051] 实验材料的处理：

[0052] （1）供试品溶液的制备：精密称取注射用盐酸克林霉素，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素1mg的溶液，作为供试品溶液；

[0053] （2）对照品溶液的制备：精密称取林可霉素、克林霉素B、克林霉素对照品用适量，加流动相溶解并稀释至每1ml含林可霉素40-60μg（优选50μg/ml），含克林霉素B90-110μg（优选100μg/ml），含克林霉素90-110μg（优选100μg/ml）的溶液摇匀，作为杂质对照品溶液。

[0054] 检测前，按照HPLC检测条件，精密量取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%。

[0055] 该检测方法的优点是：操作简便，迅速、精确。

[0056] 杂质的含量测定方法中的色谱条件及供试品溶液、对照品溶液的制备也可以参照杂质的检测方法条件及制备方法。

[0057] 本发明以对照品外标法计算杂质含量，其中林可霉素以林可霉素对照品外标法计算，克林霉素B以克林霉素B对照品外标法计算。7-差向克林霉素为克林霉素的光学异构体，两者的物理化学性质基本一致，以克林霉素对照品外标法计算。杂质方法学研究如下。

[0058] 一、以下为本发明注射用盐酸克林霉素杂质检测方法及含量测定方法的检测条件筛选实验。

[0059] 1、确定检测波长

[0060] 确定本发明检测方法的检测波长：

[0061] 精密称取林可霉素、克林霉素B与克林霉素对照品适量，分别加流动相溶解并稀释至每1ml约含10μg的溶液，在200～400nm波长范围内扫描。林可霉素的紫外扫描图见图1，克林霉素B的紫外扫描图见图2，克林霉素的紫外扫描图见图3。

[0062] 图1中林可霉素的峰值数据表如下：

[0063] 峰值数据表

[0064]

[0065] 图2中克林霉素B的峰值数据表如下：

[0066] 峰值数据表

[0067]

[0068] 图3中克林霉素的峰值数据表如下：

[0069] 峰值数据表

[0070]

[0071] 结果：林可霉素、克林霉素B与克林霉素都只有末端吸收，因此检测波长选择210nm。

[0072] 2、确定流动相

[0073] 2.1色谱条件

[0074] 流动相：设定不同流动相条件，考察流动相对检测方法的影响；

[0075] 固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0076] 检测波长：210nm；

[0077] 流速：1.0ml/min；

[0078] 柱温：35℃；

[0079] 理论板数按克林霉素峰计算不低于4000。

[0080] 试验样品的制备：

[0081] （1）供试品溶液的制备：精密称取注射用盐酸克林霉素，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素1mg的溶液，作为供试品溶液；

[0082] （2）对照品溶液的制备：精密称取林可霉素、克林霉素B、克林霉素对照品用适量，加流动相溶解并稀释至每1ml含林可霉素50μg/ml，含克林霉素B100μg/ml，含克林霉素100μg/ml的溶液摇匀，作为杂质对照品溶液。【修改说明，由于此处仅考察了流动相，故不宜将设置变量。】

[0083] 2.2在2.1色谱条件的基础上筛选流动相条件。

[0084] 流动相筛选组别见表1，检测结果见表2。

[0085] 表1流动相筛选组列表-1

[0086]

[0087] 表1中：

[0088] 磷酸二氢钾溶液是取磷酸二氢钾6.8g，加水溶解稀释至1000ml，用25%的氢氧化钾溶液调节pH值至7.5。

[0089] 磷酸二氢铵溶液是取磷酸二氢铵2.88g，加水溶解并稀释制成1000ml，用80%磷酸溶液调节pH值至3.0。

[0090] 表2流动相筛选组检测结果-1

[0091]

[0092] 表2结果显示：根据杂质含量及保留时间，并结合流动相的pH值对克林霉素中的杂质检查有一定的影响；而且不同pH值的流动相可以改善克林霉素主峰与杂质峰的分离度，尤其是当pH值为7.5时，主成分和杂质峰的峰型对称性较好，杂质能完全达到基线分离，有关物质检查较为准确，对克林霉素中的林可霉素、克林霉素B和7-差向克林霉素的测定没有影响。

[0093] 再用磷酸二氢铵配制pH值为7.5的溶液，取磷酸二氢铵2.88g，加水溶解并稀释制成1000ml，用氨试液调节pH值至7.5。

[0094] 比较相同pH不同溶质溶液对分离度的影响。

[0095] 表3流动相筛选组列表-2

[0096]

[0097] 表4流动相筛选组检测结果-2

[0098]

[0099] 表4结果显示：同pH不同溶质溶液，主成分和杂质峰的峰型有差别，pH7.5的磷酸二氢铵溶液没有pH7.5的磷酸二氢钾溶液峰形好看，峰型的对称性较差。

[0100] 故最终选择以磷酸二氢钾溶液（取磷酸二氢钾6.8g，加水溶解稀释至1000ml，用25%的氢氧化钾溶液调节pH值至7.5）-甲醇系统作为流动相，磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比为50-60：40-40，二者之和为100，磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比优选55:45为流动相，测定克林霉素中的杂质相对可行。

[0101] 2.3进一步考察不同体系的流动相对检测方法的影响

[0102] 流动相1：按照《中国药典》记载的检测方法：以磷酸二氢钾溶液（每1ml中含磷酸二氢钾6.8mg，用25%的氢氧化钾溶液调节pH值至7.5）-乙腈（55：45）为流动相。

[0103] 流动相2：以磷酸二氢钾溶液（每1ml中含磷酸二氢钾6.8mg，用25%的氢氧化钾溶液调节pH值至7.5）-甲醇（55：45）为流动相。

[0104] 精密称取注射用盐酸克林霉素，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素1mg的溶液，作为供试品溶液。分别以上述2种流动相，精密量取20μl，注入液相色谱仪，其他色谱条件不变，在210nm波长下考察各杂质与盐酸克林霉素主峰的分离度及对称因子，结果见下表5-6。

[0105] 表5不同体系流动相对分离度的影响

[0106]

[0107] 表6不同体系流动相对色谱峰对称因子的影响

[0108]流动相组别 林可霉素 克林霉素B 7-差向克林霉素 克林霉素
流动相1 1.172 1.231 1.103 1.127
流动相2 1.033 1.006 1.004 1.010

[0109] 流动相2，即本发明检测方法选择的流动相，杂质能与克林霉素主峰完全分离且各杂质对称因子在0.95～1.05之间。且本法采用甲醇作为流动相，相对乙腈流动相而言，检测成本更低。

[0110] 3、确定流速和柱温

[0111] 3.1色谱条件

[0112] 流动相：以磷酸二氢钾溶液（每1ml中含磷酸二氢钾6.8mg，用25%的氢氧化钾溶液调节pH值至7.5）-甲醇（55：45）为流动相。

[0113] 固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0114] 检测波长：210nm；

[0115] 理论板数按克林霉素峰计算不低于4000。

[0116] 3.2考察柱温和流速

[0117] 考察柱温在30-40℃，流速在0.8-1.2ml/min的影响，其他色谱条件见3.1，供试品溶液及对照品溶液制备方法见本发明检测方法最优选择。柱温和流速的影响结果见表7。

[0118] 表7柱温和流速对检测方法的影响

[0119]

[0120] 柱温在30-40℃，流速在0.8-1.2ml/min范围对杂质测定无影响。

[0121] 综合1-3的筛选结果，确定本发明检测方法及含量测定方法中的色谱条件为：

[0122] HPLC检测条件如下：

[0123] 固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0124] 流动相：磷酸二氢钾溶液-甲醇体积比（50-60：50-40），优选（55：45）；其中磷酸二氢钾溶液是磷酸二氢钾6.8g，加水溶解稀释至1000ml，用25%的氢氧化钾溶液调节pH值至7.5；

[0125] 流速：0.8-1.2ml/min（流速优选1.0ml/min）；

[0126] 柱温：30-40℃（柱温优选35℃）；

[0127] 检测波长：210nm；

[0128] 理论板数按克林霉素峰计算应不低于4000。

[0129] 二、以下为本发明检测方法和含量测定方法的色谱条件确定后，验证其测定效果的实验。

[0130] 1、本发明检测方法的专属性研究

[0131] 取规格0.3g，100901批样品，按以下操作配制破坏样品溶液。

[0132] 未破坏样品溶液：精密称取注射用盐酸克林霉素适量，加流动相溶解稀释至含克林霉素5mg/ml的溶液，摇匀，作为未破坏样品溶液。

[0133] 酸破坏样品溶液：精密称取注射用盐酸克林霉素适量，加少量流动相溶解，加1.0mol/LHCl1ml，静置24h，再加0.5mol/L NaOH2ml中和，加流动相稀释至含克林霉素5mg/ml的溶液，摇匀，作为酸破坏供试品溶液。同法操作制备酸破坏空白溶液。

[0134] 碱破坏样品溶液：精密称取注射用盐酸克林霉素适量，加少量流动相溶解，加0.5mol/LNaOH1ml，静置24h，再加1.0mol/L HCl0.5ml中和，加流动相稀释至含克林霉素
5mg/ml的溶液，摇匀，作为碱破坏供试品溶液。同法操作制备碱破坏空白溶液。

[0135] 光破坏样品溶液：取未破坏样品溶液，置紫外灯下静置24h，作为光破坏供试品溶液。

[0136] 高温破坏样品溶液：取未破坏样品溶液，水浴煮沸1h，放冷，作为高温破坏供试品溶液。

[0137] 氧破坏样品溶液：取未破坏样品溶液，加30%双氧水1ml，立刻加流动相等倍稀释，摇匀，作为氧破坏供试品溶液。同法操作制备氧破坏空白溶液。

[0138] 取上述各供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表8。

[0139] 表8专属性实验结果

[0140]破坏样 杂质峰个数 主峰归一化法含量% 主峰与前杂质峰分离度 主峰与后杂质峰分离度未破坏 8 98.40 2.81 \
氧破坏 5 92.89 2.87 \
高温破坏 14 92.10 1.35 \
光破坏 11 97.92 2.93 \
碱破坏 9 97.45 3.63 \
酸破坏 8 97.94 3.65 \

[0141] 结果：氧破坏后，主峰含量下降较大，其中杂质林可霉素大幅增加；高温破坏后，主峰含量也下降较大，新产生的杂质较多，其中林可霉素和相对主峰0.5倍保留时间的杂质显著增加；酸破坏后含量略有下降；碱破坏后，含量有所下降，其中相对主峰0.5倍保留时间的杂质明显增加；光破坏后含量略有下降。本品对光和酸性条件相对稳定，氧、高温、碱性条件下不稳定。林可霉素和相对主峰0.5倍保留时间的杂质是不稳定的杂质，易增加，而克林霉素B和7-差向克林霉素相对比较稳定，各个破坏条件下均没有明显增加。总之，本品经破坏性试验后，主峰含量均有所下降，但各杂质峰与主峰分离度良好，该色谱条件适合本品有关物质检测。由本品的破坏试验可知：在主峰保留时间的2倍后，没有检出杂质，因此有关物质供试品溶液色谱图记录至主峰保留时间的2倍。

[0142] 2、检测限试验

[0143] 林可霉素检测限试验

[0144] 精密称取林可霉素对照品10.26mg，用流动相溶解并稀释至10ml，得0.8895mg/ml的林可霉素对照品溶液。用流动相逐步稀释，分别进样20μl，结果在浓度为0.4448μg/ml时色谱讯号约为噪声的10倍，经换算定量限为：8.90ng；在浓度为0.1334μg/ml时色谱讯号约为噪声的3倍，经换算检测限为：2.67ng。

[0145] 克林霉素B检测限试验

[0146] 精密称取克林霉素B对照品10.07mg，用流动相溶解并稀释至10ml，得0.8852mg/ml的克林霉素B对照品溶液。用流动相逐步稀释，分别进样20μl，结果在浓度为0.8852μg/ml时色谱讯号约为噪声的10倍，经换算定量限为：17.70ng；在浓度为
0.2655μg/ml时色谱讯号约为噪声的3倍，经换算检测限为：5.31ng。

[0147] 克林霉素检测限与定量限

[0148] 精密称取克林霉素对照品10.28mg，用流动相溶解并稀释至10ml，得0.884mg/ml的克林霉素对照品溶液。用流动相逐步稀释，分别进样20μl，结果在浓度为0.884μg/ml时色谱讯号约为噪声的10倍，经换算定量限为：17.68ng；在浓度为0.265μg/ml时色谱讯号约为噪声的3倍，经换算检测限为：5.30ng。

[0149] 3、线性试验

[0150] 3.1林可霉素线性试验

[0151] 精密称取林可霉素对照品11.54mg，用流动相溶解并稀释至10ml，作为林可霉素对照品溶液①。精密吸取林可霉素对照品溶液①5ml，加流动相稀释至50ml，作为林可霉素对照品溶液②。再分别精密吸取林可霉素对照品溶液②5.0ml、4.0ml、2.0ml、1.0ml、0.5ml，分别加流动相稀释至10ml，摇匀，作为林可霉素对照品溶液③、④、⑤、⑥、⑦，再精密吸取林可霉素对照品溶液⑦1.0ml，加流动相稀释至10ml，摇匀，作为林可霉素对照品溶液⑧。分别精密吸取林可霉素对照品溶液②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

[0152] 以林可霉素对照品进样量（X）和对照品峰面积（Y）进行线性回归，得林可霉素线2
性回归方程：Y=224537x-322.41，R=0.9999。结果林可霉素进样量在0.010μg～2.001μg范围内进样量与峰面积线性关系良好。试验结果见表9，线性图见图4。

[0153] 表9林可霉素线性试验结果

[0154]

[0155] 3.2克林霉素B线性试验

[0156] 精密称取克林霉素B对照品10.49mg，用流动相溶解并稀释至50ml，作为克林霉素B对照品溶液①。精密吸取克林霉素B对照品溶液①5.0ml、4.0ml、2.0ml、1.0ml、0.5ml，分别加流动相稀释至10ml，摇匀作为克林霉素B对照品溶液②、③、④、⑤、⑥，再精密吸取克林霉素B对照品溶液⑥1.0ml，加流动相稀释至10ml，摇匀作为克林霉素B对照品溶液⑦。分别精密吸取克林霉素B对照品溶液①、②、③、④、⑤、⑥、⑦各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

[0157] 以克林霉素B对照品进样量（X）和对照品峰面积（Y）进行线性回归，得克林霉素B2
线性回归方程：Y=149835X+806.1，R=0.9999。结果进样量在0.018μg～3.688μg范围内克林霉素B进样量与峰面积线性关系良好。试验结果见表10，线性图见图5。

[0158] 表10克林霉素B线性试验结果

[0159]

[0160] 3.3克林霉素线性试验

[0161] 虽然含量测定项下已经做过克林霉素的线性试验，但是含量测定克林霉素对照品浓度是杂质测定克林霉素对照品浓度的10倍，为了保证测定的准确度，在低浓度下继续研究克林霉素的线性范围。精密称取克林霉素对照品9.42mg，加流动相溶解并稀释至10ml，作为克林霉素对照品溶液①；精密量取克林霉素对照品溶液①2.0ml加流动相稀释至10ml，摇匀，作为克林霉素对照品溶液②；精密量取克林霉素对照品溶液②5.0ml加流动相稀释至10ml，摇匀，作为克林霉素对照品溶液③；精密量取克林霉素对照品溶液③5.0ml加流动相稀释至10ml，摇匀，作为克林霉素对照品溶液④；精密量取克林霉素对照品溶液④5.0ml加流动相稀释至10ml，摇匀，作为克林霉素对照品溶液⑤；精密量取克林霉素对照品溶液③1.0ml加流动相稀释至10ml，摇匀，作为克林霉素对照品溶液⑥。精密量取克林霉素对照品溶液⑥1.0ml加流动相稀释至10ml，摇匀，作为克林霉素对照品溶液⑦。分别吸取克林霉素对照品溶液②、③、④、⑤、⑥、⑦各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

[0162] 以对照品进样量（X）和对照品峰面积（Y）进行线性回归，得克林霉素线性回归方2
程:Y=208903X-5465.6，R=0.9991。结果进样量在0.016μg～3.240μg范围内克林霉素进样量与峰面积线性关系良好。试验结果见表11，线性图见图6。

[0163] 表11克林霉素线性试验结果

[0164]

[0165] 4、精密度试验

[0166] 精密称取克林霉素对照品约10mg，林可霉素对照品约5mg，克林霉素B对照品约10mg，置同一10ml量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，再精密量取1ml加流动相稀释至10ml，摇匀，作为杂质对照品溶液。精密吸取杂质对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积，分别计算各个峰的RSD值。结果见表12。

[0167] 表12精密度试验结果

[0168]编号 林可霉素峰面积 克林霉素B峰面积 克林霉素峰面积
1# 205274 258675 295011
2# 205156 258790 294495
3# 206299 258705 297806
4# 205591 257611 294720
5# 205235 257738 295428
6# 205306 259720 293961
平均峰面积 205476 258539 295236
RSD（%） 0.21 0.30 0.46

[0169] 结果表明，精密度较好。

[0170] 5、溶液稳定性试验

[0171] 取注射用盐酸克林霉素（批号：100901，规格0.3g），照“有关物质”项下制备供试品溶液，取供试品溶液和“精密度”项下的杂质对照品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、24h精密吸取20μl，注入液相色谱议，考察各成分的溶液稳定性，计算RSD值，结果见表13-15。

[0172] 表13林可霉素稳定性试验结果

[0173]时间（h） 对照品溶液林可霉素峰面积 供试品溶液林可霉素峰面积
0h 205306 16225
2h 204610 16324
4h 206767 16195
6h 204604 16005
8h 204982 16175
24h 205390 15989
平均峰面积 205276 16152
RSD（%） 0.39 0.81

[0174] 表14克林霉素B稳定性试验结果

[0175]时间（h） 对照品溶液克林霉素B峰面积 供试品溶液克林霉素B峰面积
0h 259720 38631
2h 261522 37657
4h 264952 38296
6h 259752 38198
8h 262498 39489
24h 256813 38616
平均峰面积 260876 38481
RSD（%） 1.07 1.58

[0176] 表15其它杂质稳定性试验结果

[0177]

[0178] 结果表明对照品溶液和供试品溶液均稳定，室温放置24h各个峰面积无明显变化。

[0179] 6、重复性试验

[0180] 取注射用盐酸克林霉素（批号：100901，规格0.3g），照“有关物质”项下制备样品溶液，共制备6份，测定杂质含量，结果见表16。

[0181] 表16重复性试验结果

[0182]

[0183] 结果表明，重复性较好。

[0184] 7、准确度试验

[0185] 精密称取“重复性试验”项下的注射用盐酸克林霉素适量，共3份，置10ml量瓶中，分别加入杂质对照品溶液（林可霉素含量0.425mg/ml，克林霉素B含量0.816mg/ml）0.8ml、1.0ml、1.2ml，再加流动相稀释至刻度，摇匀，测定林可霉素和克林霉素B的含量，每个浓度测定3次，计算回收率、RSD值，结果见表17-18。

[0186] 表17林可霉素回收率试验结果

[0187]

[0188] 结果表明：林可霉素回收率试验结果较好，RSD为1.11%。

[0189] 表18克林霉素B回收率试验结果

[0190]

[0191] 结果表明：克林霉素B回收率试验结果较好，RSD为1.68%。

[0192] 8、含量测定

[0193] 取注射用盐酸克林霉素适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含克林霉素5mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取林可霉素、克林霉素B、克林霉素对照品适量，精密称定，加流动相溶解，并用流动相稀释制成每1ml约含林可霉素0.05mg、克林霉素B0.1mg、克林霉素0.1mg的溶液，摇匀，作为杂质对照品溶液。取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分色谱峰高为满量程的20～25%；再精密量取上述供试品溶液和杂质对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有与林可霉素保留时间一致的色谱峰，按林可霉素对照品外标法以峰面积计算含量；供试品溶液色谱图中如有与克林霉素B保留时间一致的色谱峰，按克林霉素B对照品外标法以峰面积计算含量；供试品溶液色谱图中如有7-差向克林霉素色谱峰（相对主峰保留时间约为0.8），以克林霉素对照品外标法以峰面积计算含量；其他单个杂质，以克林霉素对照品外标法以峰面积计算含量（扣除相对主峰约0.3倍保留时间的溶剂峰不计）。分别按外标法、归一化法、主成分自身对照法计算各杂质的含量。结果见表19。

[0194] 表196批中试样品有关物质检测结果

[0195]

[0196] 结果表明：外标法与归一化法、主成分自身对照法差别较大，为了准确的反应本品的质量以及严格的控制杂质含量，发明人决定采用外标法（杂质对照品法）进行检测。

[0197] 9、各杂质的相对保留时间

[0198] 克林霉素主峰、林可霉素峰、克林霉素B峰与7-差向克林霉素峰的保留时间详见表20，林可霉素约为主峰保留时间的0.3倍，克林霉素B约为主峰保留时间的0.65倍，7-差向克林霉素约为主峰保留时间的0.85倍。

[0199] 表20主峰与杂质峰保留时间

[0200]

[0201] 10、样品杂质检查实例

[0202] 测定法：

[0203] 精密称取注射用盐酸克林霉素，加流动相溶解并稀释至每1ml含克林霉素1mg的溶液，作为供试品溶液。

[0204] 精密量取供试品溶液1ml置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

[0205] 另取取林可霉素、克林霉素B、克林霉素对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释至每1ml含林可霉50μg/ml，含克林霉素B100μg/ml，含克林霉素100μg/ml的溶液，摇匀，作为杂质对照品溶液。

[0206] 照含量测定项下色谱条件，精密量取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20～25%；再精密量取上述供试品溶液和杂质对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有与林可霉素保留时间一致的色谱峰，按林可霉素对照品外标法以峰面积计算含量，不得过克林霉素标示量的0.5%；供试品溶液色谱图中如有与克林霉素B保留时间一致的色谱峰，按克林霉素B对照品外标法以峰面积计算含量，不得过克林霉素标示量的1.0%；供试品溶液色谱图中如有7-差向克林霉素色谱峰（相对主峰保留时间约为0.8），以克林霉素对照品外标法以峰面积计算含量，不得过克林霉素标示量的1.0%；其他单个杂质，以克林霉素对照品外标法以峰面积计算含量，不得过克林霉素标示量的0.5%；
各杂和，不得过克林霉素标示量的3.0%。（扣除相对主峰约0.3倍保留时间的溶剂峰不计）[0207] 照以上方法检测3个批次由“成都百裕科技制药有限公司”生产的注射用盐酸克林霉素与市售品（市售注射用盐酸克林霉素，商品名为皓瑞，批号：100506，规格：0.3g，由西安力邦制药有限公司生产；市售注射用盐酸克林霉素，商品名为沁林，批号：100905，规格：0.3g，由北京利祥制药有限公司生产），测定结果见表21。

[0208] 表21三批中试样品与进口品样品的比较结果

[0209]

[0210] 综上，本发明检测方法采用杂质对照品外标法，分别测定盐酸克林霉素中的杂质-林可霉素、克林霉素B、7-差向克林霉素，测定结果更加准确可靠，专属性更强，主峰保留时间在12分钟，检测时间较短，采用甲醇作为流动相，相对乙腈流动相而言，检测成本更低。