靶向WISP-1蛋白的特异性七肽及其应用

摘要

本发明公开了靶向WISP-1蛋白的特异性七肽及其应用。所述特异性七肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1～114任一所示。本发明利用噬菌体肽库技术，筛选到能特异性地靶向WISP-1蛋白的114个拮抗肽，利用这些拮抗肽制备WISP-1蛋白多肽拮抗剂，不仅能明显抑制WISP-1蛋白的活性，高效低毒，并且生产成本低，用量小、易合成。

权利要求

1.靶向WISP-1蛋白的特异性七肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1～114任一所示。

2.编码如权利要求1所述特异性七肽的基因。

3.含有如权利要求2所述基因的表达单元。

4.含有如权利要求2所述基因的重组载体。

5.含有如权利要求1所述特异性七肽的融合蛋白。

6.表面展示有如权利要求1所述特异性七肽的噬菌体。

7.如权利要求1所述特异性七肽在制备WISP-1蛋白多肽拮抗剂中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述WISP-1蛋白多肽拮抗剂为放疗增敏剂。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述放疗增敏剂用于减弱食管癌细胞的放射抗性。

说明书

靶向WISP-1蛋白的特异性七肽及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及靶向WISP-1蛋白的特异性七肽及其应用。

背景技术

[0002] Wnt-1诱导的分泌性蛋白（WISP-1）基因最早是在小鼠乳腺上皮细胞系（C57MG）中发现的，该基因位于人染色体8q24.1-8q24.3，编码产物为367个氨基酸组成的分泌型蛋白，含有一段信号肽（SP）以及IGFBP、VWFC、TSP和CTCK4个结构域（图5）。WISP-1蛋白属于连接组织生长因子（CCN）家族成员，序列分析显示WISP-1与CCN家族成员保持高度的序列相似性。

[0003] 与另两个CCN家族成员CTGF与Cyr-61一样，WISP-1受到整合素受体的信号调控。整合素受体在细胞转移和增殖中发挥作用，且能够影响癌细胞的侵袭和生长。WISP-1在一些细胞系中能引起有丝分裂效应，具有支持细胞系长期生长的能力，具体表现为：参与DNA合成、改变细胞形态、增加细胞饱和度、加速细胞生长等。WISP-1不仅能加速细胞增殖，还能驱使正常细胞向肿瘤细胞的转化。目前，已研究发现WISP-1基因在一些肿瘤细胞系及肿瘤病人体内扩增，在乳癌、肠癌、子宫内膜样癌、软骨瘤等肿瘤中WISP-1蛋白特异性过量表达。

[0004] 目前，在细胞和动物水平均已证实WISP-1的表达受到Wnt信号通路中的Wnt-1及其下游β-连环蛋白的调节，即WISP-1基因的启动子元件转录应答Wnt-1和β-连环蛋白信号。β-连环蛋白是Wnt信号通路的重要分子，它的表达受Wnt-1信号的正调控。WISP-1是Wnt-1的下游靶标，转化Wnt-1基因的C57MG细胞中WISP-1高表达。在对WISP-1基因启动子的研究中发现，cAMP应答元件绑定蛋白（CREB）位点在β-连环蛋白介导WISP-1蛋白的转录活化过程中起重要作用，而淋巴增强子/T细胞因子（TCF/LEF）位点只是起微小的作用。

[0005] WISP-1蛋白在一些细胞类型中也表现出抑制肿瘤细胞生长和转移的作用。在高度转移的鼠黑色素瘤细胞中，与WISP-1等同的mELML表达下调，在该细胞中转染并表达mELML时，细胞转移减少。在肺癌细胞系（H460）中，过量表达WISP-1能够抑制肺癌细胞转移及体外细胞侵袭和活动性。Akt的活化对于细胞骨架重构是十分重要的。研究发现，在WISP-1过量表达的H460细胞中Akt活性受抑制。当整合素的阻断抗体作用时，该细胞中的Akt被重新激活。

[0006] WISP-1促进细胞增殖和转化、抑制细胞凋亡以及肿瘤细胞转移的特性使其成为肿瘤生物治疗的理想靶点。在体内或体外用抗体都能够阻断WISP-1的表达，从而使相关细胞和组织的功能得到恢复。

[0007] 肿瘤的非细胞生物治疗包括抗体、多肽（或蛋白质）疫苗、基因疫苗、体内基因治疗等。其中，抗体和多肽治疗是目前最为活跃的两个领域。目前所有用于科学研究的WISP-1抗体都是非临床应用型的，而抗体的制备价格昂贵且存在鼠源性抗体在人体内易产生抗抗体等弊端。

[0008] 与单克隆抗体药相比，较小的多肽几乎没有免疫原性；可化学合成，产品纯度高，质量可控，能为肿瘤的生物治疗提供一种新的方法。近年来，随着生物技术的不断发展，已发现很多肿瘤相关基因及肿瘤产生调控因子，筛选与这些靶点特异拮抗的多肽，可能成为抗癌药物研发的突破口。

[0009] 在多肽药物开发中，利用提取、化学合成、噬菌体展示技术和蛋白酶降解等多种方式可得到各种不同的肽库，从这些肽库中可以筛选出活性多肽，并鉴定其结构。噬菌体肽库是20世纪90年代兴起的一项新技术，其原理是：以噬菌体为载体，将编码外源多肽的基因片段定向插入到噬菌体的外壳蛋白基因区，使外源多肽通过与噬菌体外壳蛋白融合而表达并展示于噬菌体表面，被展示的多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性，进而通过亲和富集等方法筛选表达特异多肽的噬菌体。

发明内容

[0010] 本发明提供了靶向WISP-1蛋白的特异性七肽，该特异性七肽是利用噬菌体肽库技术筛选出来的，能特异性地靶向Wnt信号通路下游靶基因WISP-1编码的蛋白。

[0011] 一种靶向WISP-1蛋白的特异性七肽，氨基酸序列如SEQ ID No.1～114任一所示。

[0012] 本发明还提供了编码所述特异性七肽的基因，以及含有所述基因的表达单元或重组载体。

[0013] 本发明还提供了含有所述特异性七肽的融合蛋白。

[0014] 本发明还提供了表面展示有所述特异性七肽的噬菌体。

[0015] 本发明所述特异性七肽是从噬菌体随机七肽库中筛选获得的，具体步骤包括：

[0016] （1）靶蛋白WISP-1的原核表达和纯化；

[0017] 采用蛋白质编码序列的定向克隆方法，使用pFN19A(HaloTag7)T7SP6Flexi载体构建靶蛋白WISP-1的表达载体，HaloTag蛋白位于WISP-1融合蛋白的N末端；HaloTag作为一种新型蛋白标签，能够增强重组蛋白的表达产率和可溶性。

[0018] 采用一步法（KRX）感受态细胞进行载体的有效转化，由鼠李糖启动子（rhaBAD）驱动T7RNA聚合酶表达，并通过T7启动子对WISP-1融合蛋白的表达进行灵活控制。

[0019] 将诱导表达的WISP-1融合蛋白共价固定到HaloLink树脂上，使用TEV蛋白酶从HaloLink树脂上将WISP-1蛋白切下，再使用HisLink树脂特异性去除TEV酶，这样就得到了产量大且纯度高的WISP-1蛋白。

[0020] （2）噬菌体拮抗肽的筛选；

[0021] 将靶蛋白WISP-1直接包被在固相支持物上，加入噬菌体七肽库（New England Biolabs公司生产），进行“亲和吸附→洗脱→回收→扩增”多轮亲和筛选富集，洗去未吸附的或非特异结合（对照蛋白GUS筛选）的噬菌体，从噬菌体七肽库中筛选到与靶蛋白特异性结合、表达有拮抗肽（特异性七肽）的噬菌体。

[0022] 3）分离并扩增单一的噬菌体克隆；

[0023] 对筛选到的WISP-1特异结合噬菌体进行富集、稀释后铺平板，挑选单克隆噬菌体，并于96孔培养板中培养扩增；为筛选尽可能多的拮抗肽，总共扩增4608个克隆（24块96孔平板），其中包括若干阳性以及阴性对照克隆。

[0024] （4）拮抗肽的鉴定；

[0025] 对WISP-1特异结合噬菌体进行ELISA鉴定：首先，将靶蛋白WISP-1包被酶标板，然后孵育各稀释度的单克隆噬菌体，最后用抗噬菌体ML3抗体检测阳性单克隆噬菌体；阳性单克隆噬菌体经扩增后，提取噬菌体单链DNA进行测序；通过序列分析发现高度重复的多肽序列，确定WISP-1蛋白的特异性七肽基序。

[0026] 由于所述特异性七肽能特异性结合WISP-1蛋白，因此本发明还提供了所述特异性七肽在制备WISP-1蛋白多肽拮抗剂中的应用。所述WISP-1蛋白多肽拮抗剂可用于阻断WISP-1蛋白的表达，从而使相关细胞和组织的功能得到恢复。

[0027] 申请人研究发现，WISP-1是放射抗性的食管癌细胞（KYSE-150R）上皮－间充质细胞转化（EMT）的关键因子。在KYSE-150R细胞中，WISP-1的RNA和蛋白水平表达均显著上调。申请人使用抗体中和WISP-1的表达，发现KYSE-150R细胞的放射抗性随之显著减弱，在裸鼠模型中也得到相似的结果。因此，WISP-1是克服放射抗性的极有价值的治疗靶点。

[0028] 因此，本发明所述WISP-1蛋白多肽拮抗剂可以是放疗增敏剂。所述放疗增敏剂可用于减弱食管癌细胞的放射抗性，有利于对食管癌患者进行放射治疗。

[0029] 本发明利用噬菌体肽库技术，以Wnt信号通路下游靶基因WISP-1编码的蛋白为靶点，从噬菌体七肽库中筛选到具有明显抑制WISP-1蛋白活性的噬菌体，经ELISA鉴定和序列分析获得拮抗肽的序列。

[0030] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0031] 本发明利用噬菌体肽库技术，筛选到能特异性地靶向WISP-1蛋白的114个特异性七肽，利用这些特异性七肽制备WISP-1蛋白多肽拮抗剂以及食管癌治疗中的放疗增敏剂不仅能明显抑制WISP-1蛋白的活性，高效低毒，并且生产成本低，用量小、易合成。

附图说明

[0032] 图1为本发明靶向WISP-1蛋白的特异性七肽的筛选流程图；

[0033] 图2为WISP-1重组蛋白的诱导表达结果电泳图；其中，M为蛋白质marker；

[0034] 图3为WISP-1重组蛋白的Western blot鉴定图；

[0035] 图4为亲和WISP-1蛋白的噬菌体阳性克隆的ELISA鉴定图；

[0036] 图5为WISP-1蛋白的结构图。

具体实施方式

[0037] 靶向WISP-1蛋白的特异性七肽的筛选方法，其筛选流程见图1，具体包括：

[0038] （1）重组质粒pFN19A Halo-WISP-1的构建

[0039] 以pFN2K-WISP-1为模板，设计并合成WISP-1基因的特异性PCR引物，进行PCR扩增，PCR引物序列如下：

[0040] 上游引物：5'-CCCGGCGATCGCCATGAGGTGGTTCCTGCCCTG-3'；

[0041] 下游引物：5'-CTTGGTTTAAACGTTGGCAATTTCTGAGAAGTC-3'；

[0042] PCR产物经纯化后用特异性限制性内切酶（Sgf I&Pme I）进行酶切，将pFN19A(HaloTag7)T7SP6Flexi载体用相同的限制性内切酶进行酶切，并将对应的cDNA片段与载体连接，连接产物转化大肠杆菌JML09，PCR鉴定阳性克隆并测序，将测序验证正确的阳性克隆命名为pFN19A Halo-WISP-1。

[0043] （2）重组质粒pFN19A Halo-WISP-1在KRX大肠杆菌中的诱导表达[0044] 将pFN19A Halo-WISP-1重组质粒转化感受态表达菌KRX，铺入LB琼脂平板上倒置培养，挑取菌落，PCR验证阳性的克隆接种于含氨苄青霉素的LB培养基，振荡培养，在菌体进入指数增长期时，加入鼠李糖诱导表达，收集菌体，用Halo蛋白纯化液（50mM HEPES，150mM NaCl，pH7.5）重悬，SDS-PAGE分析确定最优的表达条件。

[0045] （3）融合蛋白的纯化

[0046] 根据优化的表达条件（37℃，3.5h）进行大量诱导表达，离心去上清收集菌液，沉淀于-80℃保存或置冰上备用；HaloLink树脂悬液1mL预先用2.5倍体积的Halo蛋白纯化液在4℃平衡。

[0047] 用15mL Halo蛋白纯化液重悬步骤（2）收集的菌体，加入100μL溶菌酶（100mg/mL）和100μL核酸酶（5mg/mL），在冰上进行超声破碎至菌液澄清，离心，收集上清液；取12mL上清液（S）加入预先平衡的HaloLink树脂悬液1mL，室温孵育2h，过纯化柱弃滤液（FT），用Halo蛋白纯化液洗涤纯化柱，最后加入含8U/mLTEV酶的Halo蛋白纯化液3mL到纯化柱中，混匀后室温反应1h；过柱收集滤液，加入Halo蛋白纯化液洗涤柱子，重复一次，收集滤液（E1），加入10μL HisLink树脂到3mL E1中，室温孵育0.5h后离心收集上清（E2）。
从S、FT、E1和E2中分别吸取样品，进行10%SDS-PAGE分析，电泳结果见图2。图2中“S-TEV”样品是指取10μL含8U/mL TEV酶的Halo蛋白纯化液与50μL的S样品反应所获得的溶液。

[0048] （4）重组蛋白的鉴定

[0049] 取10μg纯化的重组蛋白加5μL5×蛋白电泳上样缓冲液，于95℃加热5min，进行10%SDS-PAGE电泳；电泳结束后进行考马氏亮蓝染色，或用半干电转移系统将蛋白转移到硝酸纤维素膜17min（15V），脱脂牛奶封闭2h，加入兔抗WISP-1抗体于4℃孵育过夜，用PBS洗涤数次，每次10min；再与山羊抗兔-HRP抗体孵育1h，用PBS洗涤三次后用ECL检测，在暗室中曝光到X光片上（见图3）。

[0050] （5）噬菌体随机七肽库靶向WISP-1蛋白的亲和筛选

[0051] 1）洗管：0.1M NaHCO3（pH8.6）溶液清洗包被免疫管；

[0052] 2）包被：准备100μg/mL靶分子溶液[WISP-1蛋白溶于0.1M NaHCO（3 pH8.6）中]，室温下包被于免疫管中；

[0053] 3）封闭：倒出包被液，免疫管倒置在干净的纸巾上拍甩以除去残余溶液，每管加满封闭液，4℃轻摇封闭；

[0054] 4）亲和：弃 封 闭 液，以 TBST（TBS+0.1%Tween-20）洗涤；用4mL的 TBSB11
（TBS+0.5%BSA）缓冲液稀释2×10 pfu单位噬菌体（10μL），然后加到免疫管中，4℃轻摇孵育；

[0055] 5）洗脱：倾倒除去未结合的噬菌体，倒置免疫管在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液，用TBST缓冲液洗管数次，每次洗涤轻摇；最后一次弃洗涤液后，每管加入500μL的0.2M Glycine-HCl（pH2.2），轻摇晃动；

[0056] 6）中和：将洗脱液吸入一干净1.5mL微量离心管中，用1M Tris-HCl（pH9.1）中和上述洗脱液；

[0057] 7）留取50μL噬菌体洗脱物用于噬菌体滴度测定：按常规ML3方法中的程序测定-1 -41μL噬菌体洗脱物在10 -10 不同稀释度下的滴度（参见步骤（6））；

[0058] 8）剩余洗脱物扩增：将噬菌体洗脱物加入到ER2738培养物中，37℃培养4.5hr；

[0059] 9）将培养物转入一50mL离心管中，离心，上清液转入另一离心管中，再离心；

[0060] 10）将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，噬菌体4℃沉淀过夜；

[0061] 11）离心PEG沉淀物，弃上清，再短暂离心，吸去残留上清液；沉淀用1mL TBS重悬溶解，离心，使残余细胞沉淀，然后取上清转入另一新鲜微量离心管，加入1/6体积的PEG/NaCl冰上孵育60min再次沉淀；离心，弃上清，沉淀溶解于200μL TBS（含0.02%NaN3）中，即为扩增的洗脱液；

[0062] 12）用对照蛋白GUS（实验室储备）包被免疫管，按照上述2）-11）的步骤进行“亲和吸附→洗脱→回收→扩增”筛选，去掉非特异性噬菌体；

[0063] 13）按上述步骤再进行三轮筛选，第二轮及以后几轮分别用上一轮洗脱液的扩增11
噬菌体，投入噬菌体量均约为2×10 pfu。

[0064] （6）筛选获得的噬菌体七肽库的滴度测定

[0065] 1）接种ER2738单菌落于LB培养基中，摇床培养至对数中期；

[0066] 2）准备已高压灭菌的Top Agar培养基和LB/IPTG/Xgal平板；

[0067] 3）用LB培养液准备10倍系列稀释的噬菌体；

[0068] 4）当ER2738菌体生长至对数中期，将培养物等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度对应一管ER2738培养物；

[0069] 5）在每管ER2738培养物中分别一一加入10μL不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育几分钟，进行噬菌体感染；

[0070] 6）将感染菌体加入预温的Top Agar琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于LB/IPTG/Xgal平板上，适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开；

[0071] 7）待平板冷却后，倒置于37℃避光培养过夜；

[0072] 8）检查平板，计数平板上的噬菌斑数，计算空斑形成单位(pfu)。

[0073] （7）靶向WISP-1的噬菌斑单克隆扩增

[0074] 1）将ER2738过夜培养物接种于LB-Tet培养基，恒温摇床摇至对数期；

[0075] 2）将步骤（5）最后一轮筛选洗脱下的靶向WISP-1的噬菌体侵染宿主菌ER2738，铺板过夜；

[0076] 3）分别挑16-48个蓝色噬菌斑到上述步骤1）处于对数期增长的ER2738培养物中，37℃摇床培养4.5-5h；

[0077] 4）将培养物转入一1.5mL离心管中，离心，收集上清，此即为扩增噬菌体贮液，4℃贮存；

[0078] 5）将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，让噬菌体4℃沉淀过夜；

[0079] 6）离心PEG沉淀物，弃上清，再短暂离心，吸去残留上清液；沉淀用1mL TBS重悬溶解，离心，使残余细胞沉淀，然后取上清转入另一新鲜微量离心管，加入1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育60min，离心，弃上清，沉淀溶解于200μL TBS（含0.02%NaN3）中，即为扩增的洗脱液。

[0080] （8）ELISA鉴定亲和WISP-1的噬菌体阳性克隆

[0081] 1）用100μg/mL的靶分子溶液[WISP-1蛋白溶于0.1M NaHCO3（pH8.6）中]包被ELISA板，每孔100μL，在湿盒中轻微振荡；

[0082] 2）甩出多余靶分子溶液，并倒置平板在纸巾上拍甩除去残液，每孔加封闭液封闭；

[0083] 3）甩出封闭液，用0.1%PBST洗板数次；

[0084] 4）每孔加入步骤（7）扩增后的单克隆噬菌体，4℃振荡过夜孵育；

[0085] 5）用0.1%PBST洗板数次，然后每孔加入100μL HRP标记的抗-ML3抗体，室温震荡作用1h；

[0086] 6）用0.1%PBST洗板数次，每孔加100μL TMB底物显色溶液，室温作用至蓝色明显显现后，每孔加入50μL的1M盐酸终止反应，测定450nm处的吸光值。

[0087] 通过与阴性靶蛋白PRDX的OD450值进行比较（部分比较结果见图4），获得能与WISP-1蛋白特异结合的114个阳性克隆噬菌体（OD450>0.4）。

[0088] （9）测序模板的快速纯化

[0089] 1）将ER2738过夜培养物按1:100稀释，取1mL菌体稀释物，加入步骤（8）筛选的阳性克隆噬菌体10μL，进行扩增4.5h，在离心后，取500μL上清转入一新鲜离心管；

[0090] 2）向离心管中加入200μL PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10-20min，离心，弃上清，再离心，吸去残余上清；

[0091] 3）沉淀物彻底重悬于100μL碘化物缓冲液中，加入250μL乙醇，室温温育10-20min，离心，弃上清，用70％的乙醇洗沉淀，离心，弃上清，短暂放置干燥；

[0092] 4）沉淀重悬于30μL不含RNA酶的H2O或者TE[10mM Tris-HCI(pH8.0)，1mMEDTA]中，获得模板溶液；

[0093] 5）取5μL的上述模板溶液，进行测序，测序获得编码114个七肽的核苷酸序列。